Carvão ativado e estiolamento no estabelecimento in vitro de romãzeira

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1 Carvão ativado e estiolamento no estabelecimento in vitro de romãzeira Márcia Maria Dias, Silvia Nietsche e Marlon Cristian Toledo Pereira 2 Eng. Agr. Mestre Agronomia/Fitotecnia. marciamaridias@yahoo.com.br Doutorado em genética e melhoramento 3 UNIMONTES. silvia.nietsche@unimontes.br Doutorado em Fitotecnia/Produção vegetal UNIMONTES. silvia.nietsche@unimontes.br Resumo - A romãzeira é uma espécie lenhosa que se destaca pelo potencial como medicinal, frutífero e ornamental, mas ainda são escassos os estudos relacionados à obtenção de mudas com qualidade genética da espécie. O objetivo deste estudo foi avaliar diferentes concentrações de carvão ativado e períodos de estiolamento na oxidação e contaminação, ao longo do processo de estabelecimento in vitro de explantes de romãzeira (Punica granatum L.). Foram estudadas quatro concentrações de carvão ativado (; 1,25; 2,5 e 5, g.l ), quatro períodos de estiolamento em câmara escura (, 7, 14 e 28 dias) e sete períodos de avaliação (, 5, 1, 15, 2, 25 e 3 dias), com quatro repetições. O experimento foi realizado no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Estadual de Monte Claros, em Minas Gerais, em dezembro de 29. O carvão ativado foi eficiente na redução da oxidação dos explantes. A concentração recomendada corresponde a 1,81 g.l de carvão ativado em meio MS para o estabelecimento in vitro de explantes de P. granatum. Palavras-chave: Punica granatum, micropropagação, cultura de tecidos, espécie lenhosa. Activated carbon and etiolating in the establishment in vitro of pomegranate tree Abstract - The pomegranate tree is a woody species that stands by the potential medicinal, ornamental and fruitful, but still there are few studies related to obtaining of slips with genetic quality of the specie. The objective of this study was to evaluate different concentratio of activated carbon and etiolating periods in the oxidation and contamination, along the process of establishment in vitro of pomegranate tree explants (Punica granatum L.). Four concentratio of activated carbon (, 1.25, 2.5 and 5. g.l ), four etiolating periods in darkroom (, 7, 14 and 28 days) and seven evaluation periods (, 5, 1, 15, 2, 25 and 3 days) were evaluated, with four replicates. The experiment was carried out at the Laboratory of Biotechnology, in State University of Monte Claros, in Minas Gerais, Brazil, in December 29. The activated carbon was effective in reducing the oxidation of explants. The concentration recommended corresponds to 1.81 g.l of activated carbon in MS medium for establishment in vitro of P. granatum explants. Keywords: Punica granatum, micropropagation, tissue culture, woody species. Introdução A família Punicaceae, cotituída de apenas um gênero, abrange duas espécies, dentre estas a romãzeira (Punica granatum L.) (Morton, 1987), utilizada como planta frutífera, ornamental (parques e jardi) e medicinal (Corrêa, 1978). A romãzeira é um arbusto lenhoso (Pasqual, 24) originalmente nativo da Pérsia e países adjacentes (Lloyd & Ohio, 1987), cultivado mundialmente em regiões de clima tropical e subtropical (Pereira et al., 26). A espécie apresenta 1 a 3 m de altura (Dantas & Souza, 24) com folhas perenes ou decíduas, flores isoladas ou em agrupamentos com cálice tubular vermelho cotituído de 5 a 8 sépalas, com 3 a 7 pétalas vermelhas, brancas ou matizadas (Morton, 1987). Os frutos são originários de ovário ínfero com pericarpo carnoso-coriáceo, divididos internamente em muitas lojas com inúmeras sementes irregularmente facetadas (Lopes et al., 21), que representam aproximadamente 52% do peso da fruta inteira (Morton, 1987). A propagação da espécie pode ser realizada sexuada (sementes), gerando grande variabilidade genética ou assexuadamente (estaquia) com a utilização de ácido indolbutírico (Morton, 1987). A cultura de tecidos propicia a obtenção de milhares de mudas a partir de uma gema em pequeno intervalo de tempo e espaço (Albert, 24). A técnica é utilizada comercialmente permitindo a obtenção de plantas geneticamente uniformes, idênticas a matriz e sadias evitando a disseminação de pragas e doenças (Borges & Souza, 24), visando à coervação e multiplicação rápida de genótipos com características desejadas (Pasqual, 24). A maior uniformidade obtida no cultivo in vitro, permite a uniformização do plantio e sincronização da colheita. As mudas advindas deste método propagativo são mais produtivas e de maior precocidade na produção (Borges & Souza, 24). Na fase de estabelecimento in vitro, as plantas lenhosas apresentam dificuldades relevantes, principalmente relacionadas à contaminação e oxidação dos explantes. Os microrganismos contaminantes competem com os explantes pelos nutrientes do meio de cultivo e provocam danos diretos e indiretos pela colonização dos tecidos vegetais, podendo exudar ao meio, metabólitos tóxicos às plantas (Montarroyos, 2). 1

2 A oxidação de compostos fenólicos liberados pelas células danificadas com o corte durante o isolamento in vitro também pode causar toxidez ao explante e se difundirem no meio de cultura (Grattapaglia & Machado, 1998). Estudos sobre a propagação in vitro de romãzeira ainda são escassos e necessários para a obtenção de mudas com qualidade genética. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações de carvão ativado e períodos de estiolamento na oxidação e contaminação, ao longo do processo de estabelecimento in vitro de explantes de romãzeira. Material e Métodos O trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Estadual de Montes Claros Campus Janaúba, MG. Estacas de romãzeira foram coletadas no pomar da Universidade, em 2 de dezembro de 29. O material vegetal, após a retirada das folhas, foi submetido à assepsia com hipoclorito de sódio a 2,5% por 1 min., em seguida, a tríplice lavagem em água deionizada e autoclavada. Posteriormente, as estacas foram imersas em álcool 92,8 GL por 6 segundos e realizada a tríplice lavagem com água deionizada autoclavada. As microestacas foram imersas em hipoclorito de sódio a 2,5% P/V (peso/volume) adicionada de três gotas de Tween 2 por 3 min. Após a assepsia, em câmara de fluxo laminar, as microestacas foram submetidas à tríplice lavagem com água deionizada e autoclavada. Procedeu-se, então, a extração das brotações apicais com cerca de 1,5 cm. Os explantes foram inoculadas em tubo de eaio com meio MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 3 g.l de sacarose, 7 mg.l de 6-Benzilaminopurina, 7 g.l de ágar e diferentes concentrações de carvão ativado, conforme os tratamentos, com ph ajustado para 5,7 e autoclavados durante 2 minutos a 121 C e 1,5 atm. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 4 x 7 resultante de 4 concentrações de carvão ativado (; 1,25; 2,5 e 5, g.l ), 4 períodos de estiolamento em câmara escura (, 7, 14 e 28 dias) e 7 períodos de avaliação (, 5, 1, 15, 2, 25 e 3 dias após a introdução), com 4 repetições e 2 plantas por parcela. Após os períodos de estiolamento em câmara escura, as plantas foram mantidas em sala de cultivo com lâmpadas fluorescentes do tipo super luz do dia de 4 watts e uma -2. inteidade luminosa de 52 Mmol.m s, temperatura de 25 ± 3 ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas no escuro, segundo os tratamentos. Foram avaliadas as características: porcentage de contaminação fúngica e bacteriana e porcentagem de oxidação dos explantes a, 5, 1, 15, 2, 25 e 3 dias após do estabelecimento em meio de cultura. Coideraram-se oxidados os explantes de coloração marrom ou preto com degeneração causada pelo processo oxidativo. Os dados foram analisados estatisticamente utilizando o software SISVAR - Sistema de Análise de Variância de Dados Balanceados (Ferreira, 2). Procedeu-se ao teste F e a comparação de médias pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os tratamentos quantitativos foram submetidos à análise de regressão. Os dados de porcentagem de contaminação bacteriana foram traformados em raiz quadrada (X+1) para afi de análise estatística. Resultados e Discussão De acordo com os resultados da Tabela 1, houve diferença significativa para ambas as variáveis analisadas. Para a contaminação fúngica e bacteriana, obtiveram-se diferenças significativas para os fatores concentração de carvão ativado, estiolamento e tempo, isoladamente, e, para a interação entre carvão ativado e estiolamento. Quanto à porcentagem de oxidação, observaram-se diferenças significativas para para os fatores concentração de carvão ativado, estiolamento e tempo, isoladamente, e, para as interações carvão ativado e estiolamento, e, carvão ativado e tempo. Tabela 1. Resumo da análise de variância para % contaminação fúngica (PCF), % contaminação bacteriana (PCB) e % oxidação (POX), em relação às diferentes concentrações de carvão ativado, períodos de estiolamento e avaliação de explantes de Punica granatum. Quadrados Médios Fontes de variação GL PCF PCB POX Carvão (C) ,298 29, ,342 Estiolamento (E) ,536 31, ,258 Tempo (T) ,36 16, ,92 C x E ,21 23, ,971 C x T ,99 1, ,475 E x T 18 21,813 1,78 24,82 C x E x T ,951 2,148 2,255 Resíduo ,24 2,126 44,178 Média Geral CV (%) 42,634 74,6 1,878 77,63 2,926 31,76 Significativo a 5% de probabilidade, pelo teste F; Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F; GL = Graus de liberdade, CV= Coeficiente de variação As contaminações iniciaram aos três dias após o estabelecimento in vitro e apresentaram diferenças significativas para os fatores concentração de carvão ativado, período de estiolamento e tempo de estabelecimento do explante, isoladamente e para a interação entre carvão ativado e estiolamento (Tabela 1). Para contaminação fúngica, ao analisar a interação entre carvão e estiolamento, a menor porcentagem obteve-se quando os explantes foram submetidos por sete dias em câmara escura em meio de cultura MS com 2,5 g.l de carvão ativado, correspondendo a 19,64% (Figura 1). Erig & Schuch (23) obtiveram melhores resultados em macieira com média de,1% de contaminação fúngica nas cultivares Maxigala, Mastergala e Galaxy. 2

3 carvão ativado com, 7 e 28 dias de cultivo em câmara escura; 2,5 g.l de carvão ativado com 28 dias de cultivo em câmara escura e 5, g.l de carvão ativado com 7 dias de cultivo em câmara escura, nos quais obteve-se 1% de contaminação (Figura 2). Figura 1. Efeito da interação de diferentes concentrações de carvão ativado e períodos de estiolamento na porcentagem de contaminação fúngica no estabelecimento in vitro de explantes de romãzeira. Ao analisar os períodos de cultivo isoladamente, as contaminações fúngicas na romãzeira apresentaram um acréscimo ao longo do cultivo de % para 4,63% e 51,56% correspondentes aos, 5 e 1 dias de cultivo, respectivamente, e mantiveram-se cotantes após este período (Tabela 2). As contaminações bacterianas, quando analisadas isoladamente, também apresentaram um acréscimo ao longo do estabelecimento in vitro correspondendo aos 3 dias de cultivo a contaminação de 2,35% dos explantes. Em relação à oxidação dos explantes observou-se aos 5 dias de cultivo uma média de 23,5% e a partir deste período houve um pequeno acréscimo não significativo ao longo das demais avaliações, correspondendo aos 3 dias a 26,17%. Tabela 2. Porcentage de contaminação fúngica (PCF), porcentagem de contaminação bacteriana (PCB) e porcentagem de oxidação (POX) em explantes de romãzeira. Períodos (dias) PCF PCB POX 4,625 b 1,384 ab 1,832 bc 2,89 bc 2,217 c 2,281 c 2,345 c 23,47 b 24,69 b 26,172 b Médias seguidas da mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si, pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As menores porcentage de contaminações bacterianas foram observadas nas interações: g.l de carvão ativado com 14 e 28 dias de cultivo em câmara escura; 1,25 g.l de Figura 2. Efeito da interação de diferentes concentrações de carvão ativado e períodos de estiolamento na porcentagem de contaminação bacteriana no estabelecimento in vitro de explantes de romãzeira. Rosa et al. (29), em experimento com mirtilo, não observaram relação quanto às contaminações fúngicas e bacterianas com o período em que os explantes permaneceram sob o escuro, não obtendo influência no resultado total de contaminação. Erig & Fortes (22) obtiveram contaminação por bactérias em 45,7% das gemas de pereira provenientes de plantas mantidas no campo. Em trabalho realizado com a macieira cv. Galaxy, Erig & Schuch (23), observaram 27,8% de contaminação bacteriana. As contaminações bacterianas dos explantes da romãzeira ocorreram ao longo do período do cultivo e não cotituíram impedimento ao estabelecimento in vitro da cultura. Em relação a oxidação dos explantes observou-se aos cinco dias de cultivo uma média de 23,5% e a partir deste período houve um pequeno acréscimo não significativo ao longo das demais avaliações, correspondendo aos 3 dias a 26,17% (Tabela 2). O estudo isolado do fator estiolamento em relação à oxidação demotrou que a técnica não é necessária para o estabelecimento in vitro desta espécie, uma vez que as plantas que não foram acondicionadas em câmara escura apresentaram a menor porcentagem de oxidação que correspondeu a 18,3% de explantes oxidados (Tabela 3). 3

4 Tabela 3. Porcentagem de oxidação de explantes de romãzeira em função da concentração de carvão ativado e do período de estiolamento em câmara escura. Carvão ativado (g.l ) 1,25 2,5 5, Oxidação (%) 82,366 a,223 b,223 b,893 b Estiolamento (dias) Oxidação (%) 18,34 a 21,55 b 22,98 b 22,98 b Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Oxidação (%) 1, y= -5,9x ,625x 2-129,6x + 92,188 R 2 = 1 y= -6,2x ,25x 2-135,63x + 96,875 R 2 = 1 8, y = -6,2x ,25x 2-135,63x + 96,875 R 2 = 1 y= -5,9333x ,25x 2-132,29x + 96,875 R 2 = 1 6, y= -6,333x ,125x 2-133,23x + 96,875 R 2 = 1 4, 2,, -2,, 1, 2, 3, 4, 5, Carvão ativado (g.l ) 5 dias 1 dias 15 dias 2 dias 25 dias 3 dias Diferentemente, Rosa et al. (29), em trabalho realizado com mirtilo, obteve menor porcentagem de oxidação quando as plantas foram mantidas no escuro por 21 dias quando comparadas ao tratamento com 7 dias de escuro com aproximadamente 35% e 9% respectivamente. A ausência de carvão ativado promoveu um significativo aumento na porcentagem de explantes oxidados (82,37%) quando comparadas com os índices das demais concentrações (Tabela 3). Ao realizar o desdobramento do fator concentrações de carvão ativado para analisar a interação deste com o fator estiolamento observou-se que ambas as curvas apresentaram-se semelhantes. A concentração de carvão ativado que proporcionou melhores resultados foi 1,814g.L de acordo com estudo da derivada das funções na Figura 3. Na interação carvão ativado e estiolamento menores porcentage de oxidação foram obtidas aos 7 e 14 dias de estiolamento em câmara escura, ambos corresponderam a,22% de explantes oxidados. Avaliações (dias) Figura 4. Efeito das interações de carvão ativado e tempo de estabelecimento in vitro em explantes de romãzeira. Ao realizar o desdobramento do fator concentrações de carvão ativado, verifica-se, também, que as curvas de respostas foram similares onde a concentração 1,814 g.l propiciou os melhores resultados (Figura 4). Resultados satisfatórios quanto ao uso do carvão ativado também foram obtidos por Costa et al. (27) na cultura de Lippia sidoides. Os autores obtiveram 1,7% e % de oxidação dos explantes ao utilizar carvão ativado no meio de cultura nas concentrações 3 g.l e 12 g.l,respectivamente. Segundo Grattapaglia & Machado (1998), a eficiência do carvão ativado atribui-se ao fato deste escurecer o meio impedindo a incidência de luz na base do explante evitando a oxidação e, também, a capacidade de adsorver substâncias tóxicas, principalmente fenóis, liberadas de explantes cujos tecidos foram lesionados. Oxidação (%) 1, y = -4,6854x 3 + 4,998x 2-12,49x + 73,21 R 2 = 1 y = -5,4285x ,499x 2-118,75x + 84,82 R 2 = 1 8, 6, y = -5,5612x ,566x 2-12,59x + 85,71 R 2 = 1 y = -5,2954x ,715x 2-117,98x + 85,71 R 2 = 1 4, 2,, -2,, 1, 2, 3, 4, 5, 6, Carvão ativado (g.l ) Conclusões 1. As contaminações fúngicas apresentaram-se nos primeiros 1 dias após o estabelecimento in vitro dos explantes. 2. As contaminações bacterianas apareceram até os 3 dias de cultivo in vitro de romãzeira. 3. O carvão ativado foi eficiente na redução da oxidação dos explantes. A concentração recomendada corresponde a 1,81 g.l de carvão ativado em meio MS para o estabelecimento in vitro de explantes de Punica granatum Períodos de estiolamento (dias) Figura 3. Efeito das interações de diferentes concentrações de carvão ativado e períodos de estiolamento em explantes de romãzeira. Referências ALBERT, L.H. de B. Aspectos morfo-anatômicos de m u d a s d e a b a c a x i z e i r o ' S m o o t h c a y e n n e ' micropropagadas. Lavras: Universidade Federal de Lavras, p. Tese Doutorado. 4

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