Capítulo 9. Versão 0.6. Domínios, motivos proteicos e evolução por rearranjo de éxons. 1.- Domínios proteicos

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1 Capítulo 9 Versão 0.6 Domínios, motivos proteicos e evolução por rearranjo de éxons 1.- Domínios proteicos Domínios de proteínas são unidades estruturais, funcionais e evolutivas das proteínas. Um domínio é uma região compacta da estrutura da proteína que é, muitas vezes, mas nem sempre, constituído por um segmento contínuo da sequência de aminoácidos, e é muitas vezes capaz de se dobrar o suficiente para existir de modo estável por si mesma em solução aquosa. Normalmente eles são responsáveis por uma função particular ou interação que contribui para o papel global de uma proteína, por exemplo, o domínio SRC Homologo 3 (SH3) que são pequenos domínios com cerca de 60 resíduos de aminoácidos que estão envolvidos em interações proteína- proteína. Domínios SH3 têm uma estrutura característica 3D, como mostrado na figura 1. Esses domínios ocorrem em uma diversidade de proteínas com funções diferentes, incluindo proteínas adaptadoras, fosfatidilinositol 3- cinases, fosfolipases e miosinas. Figura 1 - Estrutura do domínio SH3 da alfa espectrina de galinha (código PDB 1SHG), colorido de azul (N- terminal) para vermelho (C- terminal). As setas representam folhas beta, que são sequências de resíduos de aminoácidos que se ligam lateralmente a outras cadeias. Os domínios podem existir numa variedade de contextos biológicos, sendo que domínios semelhantes podem ser encontrados em proteínas com funções diferentes. Além disso, a maioria das proteínas dos genomas, dois terços em organismos unicelulares e mais de 80% em metazoários, são proteínas multidomínios, em sua maioria resultantes de eventos de duplicação gênica. Estas estruturas multidomínios podem também ser chamadas de arquiteturas de domínios proteicos (ADPs) que são os arranjos lineares dos domínios em proteínas individuais. Um exemplo de uma proteína que contém vários domínios SH3 é a proteína citoplasmática Nck. Nck pertence à família de proteínas

2 chamadas adaptadoras e está envolvido na via de transdução de sinais do factor de crescimento a partir do receptor de cinases de tirosina. A composição dos domínios da proteína Nck é ilustrada na figura 2. Figura 2 - Composição de domínio da proteína Nck. A proteína Nck contém três domínios SH3 além de outro domínio conhecido como SH2 (SRC homologo 2). Ambos os domínios SH2 e SH3 são geralmente encontrados em proteínas que interagem com outras proteínas e medeiam a montagens de proteínas complexas. Os domínios SH3 tipicamente ligam- se a peptídios ricos em prolina nos seus respectivos parceiros de ligação, enquanto que os domínios SH2 interagem com peptídios alvo contendo fosfotirosina. Como acabamos de ver com proteína Nck, as proteínas podem ser compostas por ADPs e muitas vezes os domínios individuais têm funções específicas, tais como ligar a uma molécula particular ou catalisar uma determinada reação e em conjunto esta combinação de domínios contribuem para a função global da proteína. Veja, por exemplo, a ADP da enzima fosfolipase D1 na Figura 3. Figura 3 - Composição da ADP da fosfolipase D1, enzima que quebra a fosfatidilcolina. A proteína contém um domínio PX (phox) que está envolvido na ligação do fosfatidilinositol, um domínio PH (homologo de plecstrina) que tem o papel no direcionamento da enzima para locais específicos no interior da célula e dois domínios PLD (fosfolipase D) os quais são responsáveis atividade catalítica da proteína. Os domínios, quando analisados retrospectivamente na evolução, funcionam como módulos intercambiáveis cujas combinações resultam em novas sequências. Assim, os domínios podem ser considerados como unidades geneticamente móveis, referidos como módulos, como em um brinquedo de montar. Frequentemente, o N e C terminais dos domínios estão juntos no espaço, permitindo que eles sejam facilmente encaixados em outras estruturas durante o processo de evolução de modo que novas sequências são então adaptadas a partir de sequências pré- existentes, o invés de produzidas de novo. Muitas

3 famílias de domínio são encontradas em todas as três domínios (aqui com sentido diferente) da vida, Archaea, Bactéria e Eukarya. As ADPs poderiam ter existido em proteínas com estruturas independentes, ou seja, em proteínas em que os domínios são encontrados separadamente. Muitos domínios existentes em ADPs eucarióticas podem ser encontrados como independentes em proteínas procarióticas. Por exemplo, os vertebrados têm um polipeptídeo multi- enzimática que contém a ADP formada pelas sintetases GAR e AIR e também a transformilase GAR (Gars- AIRs- GART). Em insetos, o polipeptídeo aparece como GARS - (AIRS)2 - GART, em levedura Gars- AIRs é codificado separadamente do GART, e em bactérias cada domínio é codificado separadamente, assim como mostrado na figura 4. Figura 4 Representação esquemática da fusão organismo- específica e duplicação pata os ortólogos GARs, AIRs e GART na via biossintética da purina A busca para determinar a origem a famílias de proteínas relacionadas com sequências e estruturas similares baseia- se nos padrões comumente encontrados na evolução molecular. No entanto, as semelhanças de sequências (estrutura primária) podem ser extremamente baixas entre as proteínas que compartilham a mesma estrutura secundária ou terciária. Estruturas terciárias de proteínas podem ser semelhantes porque as proteínas divergiram de um ancestral comum e a pressão de seleção ocorreu mais intensamente na preservação da estrutura tridimensional (3D) do que na sequência de resíduos propriamente dita. Assim, alguns dobramentos podem ser mais favorecidos do que outros, já que eles representam arranjos estáveis de estruturas secundárias e algumas proteínas podem convergir para estes dobramentos ao longo da evolução. Existem atualmente cerca de 96 mil estruturas 3D de proteínas determinadas experimentalmente depositados dentro do banco de dados proteicos (Protein Data Bank, PDB). No entanto, este conjunto contém uma grande quantidade de estruturas 3D idênticas ou muito semelhantes. Todas as proteínas devem ser classificados para as famílias estruturais para entender suas relações evolutivas. Comparações estruturais são mais bem alcançados ao nível do domínio. Por esta razão, muitos algoritmos foram desenvolvidos para atribuir automaticamente domínios em proteínas com estrutura 3D conhecida. 2.- Motivos Os motivos, em seu uso geral, referem- se a um tema ou ideia característica que é recorrente ou predominante. Dessa forma é possível se encontrar motivos em áreas bastantes distintas, tais como música e na biologia. Na música, o motivo é a menor unidade estrutural que possui uma identidade temática. Um exemplo muito conhecido é a pequena barra de abertura da quinta sinfonia de Beethoven: Tcham Tcham Tcham Tchaaaam, mostrado na figura 5.

4 Figura 5 Trecho da abertura inicial da quinta Sinfonia de Beethoven Na biologia, as menores unidades de sequência das famílias de proteínas são denominados motivos, que são identificadas como regiões bastante semelhantes em alinhamentos de segmentos de proteínas. Motivos são frequentemente utilizados para identificar regiões funcionais de proteínas e, quando eles compartilham um ancestral comum, são úteis para a classificação da família proteica correspondente. Os sítios ativos das enzimas, que geralmente são bastante conservados, são frequentemente encontrados dentro de motivos. Do mesmo modo que os domínios, os motivos podem refletir tanto um ancestral comum quanto uma convergência a partir de origens distintas. Em ambos os casos, a identificação dos motivos pode ser importante para fazer inferências estruturais e funcionais. Por exemplo, um motivo comum o P- loop (laço P) que está presente em domínios de ligação de nucleotídeos de famílias tão diversas como proteínas motoras cinesinas e a transportadores de cassetes de ligação de ATP. Apesar da falta de uma estrutura conhecida por qualquer ligação de cassete ATP, a presença de uma P- loop auxilia a prevê em que o local pode haver ligação de ATP no complexo transportador, veja na figura 6. Figura 6 Representação esquemática dos transportadores de cassetes de ligação de ATP exibem diferentes conectividades de dois pares de subunidades As ferramentas para encontrar motivos tem inúmeras aplicações, tais como a busca de sítios de iniciação de transcrição, os sítios de clivagem de RNA e sinais de splicing alternativo, além dos estudos com motivos proteicos. Porém os programas para encontrar motivos são comumente projetados para identificar os sítios de ligação perto de genes, onde uma classe de proteínas os fatores de transcrição ligam- se e regulam a expressão gênica. Encontrar estes sítios de ligação é um processo lento e caro experimentalmente e ferramentas computacionais são populares como um substituto rápido e barato. 3.- Algoritmos de detecção de domínios e motivos A identificação de domínios e motivos estruturais a partir de informação de sequências isoladas apresenta alguns desafios. Um ponto é que

5 muitas sequências de aminoácidos diferentes são compatíveis com a mesma estrutura secundária e portanto, pode haver incontáveis diferentes sequências independentes que codificam feixes de quatro hélices, por exemplo. Métodos que utilizam somente similaridade de sequência par- a- par não podem ser usados para identificação absoluta de motivos estruturais. É necessário avaliar as sequências como pertencentes a uma família para que haja significado funcional. Além disso, os resultados de alinhamentos par- a- par podem ser dominados por regiões com sobreposições irrelevantes para regiões de baixa complexidade ou bastantes repetitivas. Também devemos considerar que a presença de módulos ou multidomínios podem complicar a interpretação dos dados. A distinção entre moléculas ortólogas e parálogas também pode vir a ser necessária. Nesta seção abordaremos alguns métodos amplamente utilizados para detecção de domínios e motivos. E é importante entender as diferenças entres as abordagens, já que cada uma possuem pontos positivos e negativos e por isso cada uma deve ser escolhida conforme as circunstâncias. O princípio que permeia as abordagens descritas é o alinhamento múltiplo de sequências utilizado para encontrar regiões de conservação entre várias sequências o qual acredita- se refletir as características estruturais ou funcionais compartilhadas entre as sequências. Assim, essas regiões podem ser utilizadas para construir blocos com assinatura diagnóstica a partir dos quais podemos reconhecer potencialmente novos membros da família. Os métodos descritos se baseiam no uso de um motivo, múltiplos motivos ou alinhamento de todo o domínio Expressões regulares Provavelmente este é o método mais simples para reconhecimento de padrão. Nele as sequências curtas são reduzidas a consensos para capturar a essência do motivo. Existem várias notações para descrever os motivos, mas a maioria deles são variantes de notações padrão para expressões regulares e algumas convenções são utilizadas para descrever os padrões para representar os motivos: a.- Existe um alfabeto de caracteres únicos em que cada um denota um aminoácido específico ou de um conjunto de aminoácidos; b.- Uma sequência de caracteres a partir deste alfabeto indica uma sequência de aminoácidos correspondentes; c.- Qualquer sequência de caracteres extraídos do alfabeto entre colchetes corresponde a qualquer um dos aminoácidos correspondentes. Por exemplo [ABC] corresponde a qualquer dos aminoácidos representados por A ou B ou C. A ideia fundamental por trás de todas estas notações é princípio da congruência, que atribui um significado a uma sequência de elementos do padrão de notação, no qual uma sequência de elementos do padrão notação corresponde a uma sequência de aminoácidos somente se esta última sequência possa ser dividida em sub- sequências, de tal maneira que cada elemento corresponde ao padrão correspondente subsequência, por sua vez. Assim, o padrão [AB] [CDE] F coincide com as sequências de aminoácidos seis correspondentes a ACF, ADF, AEF, BCF, BDF, e BEF. A notação [XY] não indica necessariamente na probabilidade de X ou Y que ocorre no padrão. Probabilidades observadas podem ser representadas graficamente utilizando logos de sequência, que são representações gráficas da

6 conservação da sequência nucleicas ou proteicas. Os padrões também podem ser definidos em termos de um modelo probabilístico tal como um modelo de Markov oculto. A figura 7, por exemplo, contêm um alinhamento de cinco sequências curtas que queremos caracterizar usando uma expressão regular. O primeiro passo é olhar em cada coluna do alinhamento e anotar o que vemos. Veja que a primeira e a terceira coluna contém apenas um único resíduo em cada coluna coluna, enquanto que a sexta coluna cada sequência contem um resíduo diferente. A expressão regular consolidada aparece ao lado das sequências alinhadas. A expressão regular é útil para encontrar as sequências que se encaixam no padrão bem conservado e de preferência bem conhecidos entre os motivos. Figura 7 Expressão regular associada ao motivo estrutural Expressões regulares são bastantes restritas no que se refere a identificação de motivos, entretanto é possível utilizar expressões mais permissivas que agreguem fatores biológicas tais as características fisico- químicas dos aminoácidos, por exemplo se eles possuem a cadeia lateral aromática, básica, polar, entre outras. É evidente que sendo mais relaxado na expressão regular a busca aceitará um conjunto maior de sequências com aquelas características. E isso terá a vantagem potencial de se aceitar sequências relativamente mais distantemente relacionadas, mas também será mais propensa aceitar sequências não relacionadas por origem ou função por mero acaso "Impressões digitais" Os métodos baseados em expressões regulares são bons para identificar motivos individuais em proteínas, a maioria das famílias de proteínas não são caracterizados por uma, mas por várias regiões conservadas, que ocorrem em uma determinada ordem. A identificação dessas regiões é o princípio por trás de impressões digitais ou fingerprints. As impressões digitais são compostas por uma combinação de vários motivos curtos conservados, os quais são extraídos de alinhamentos de sequências, como ilustrado na figura 8. Cada motivo é então convertido em uma matriz preenchida somente com a frequência com a qual os resíduos de aminoácidos ocorrem em cada posição dos motivos para criar uma assinatura digital. Um ponto importante a se enfatizar é que nesta matriz não são colocados pesos para as substituições, mas apenas as frequências. A figura 9 ilustra a uma matriz de frequência.

7 Figura 8 Representação das etapas envolvidas na criação de uma assinatura digital. Figura 9 Matriz de frequência correspondente aos alinhamentos. Na matriz linhas correspondem aos resíduos de aminoácidos e as colunas a posição dos resíduos no motivo As impressões digitais são muito boas para se modelar pequenas diferenças entre as proteínas intimamente relacionadas, principalmente quando há varreduras em grandes bancos de dados. Entretanto, um problema atribuído à matriz de frequências é que a pontuação dada é limitada,tornando a identificação de homólogos distantes difícil. Impressões digitais podem distinguir subfamílias individuais dentro de famílias de proteínas. E uma vez guardada a matriz ela pode ser utilizada para a caracterização funcional das sequências a um nível elevado de especificidade, tais como identificação de vias celulares individuais em que uma proteína pode estar envolvida, reações que poderiam ser catalisadas, agentes ligantes que poderiam ser ligados. Além disso, ela pode ser combinada com a matriz BLOSUM para obter melhores resultados.

8 3.3.- Perfis Os perfis são matrizes criadas por métodos iterativos de alinhamento e descrevem quantitativamente os motivos. Eles fornecem pesos numéricos para cada combinação possível ou incompatibilidade entre um resíduo sequência e uma posição de perfil, produzindo chamados blocos que são alinhamentos múltiplos de sequências sem lacunas fortemente conservados entre as sequências. Os perfis são usados para modelar famílias de proteínas e domínios e, geralmente, bancos de dados curados são utilizados para calibrar essas perfis, tais como o Swissprot. Eles são construídos através da conversão de alinhamentos múltiplos de sequência em uma matriz de pontuação de posição específica (PSSM, em inglês position- specific scoring matix). Para construir as PSSMs é necessário criar uma matriz de frequência como visto nas impressões digitais. A frequência de cada resíduo é comparada com a frequência de qualquer resíduo esperada numa sequência aleatória. Um dos problemas atribuídos às matrizes de frequência é que elas possuem zeros em consequência ao número limitado de sequências no alinhamento múltiplo. E, infelizmente, uma frequência observada 0 pode implicar a exclusão do resíduo correspondente a esta posição, essa é a situação que ocorre com o uso das expressões regulares. Para resolver este problema as PSSMs são então comparadas com as matrizes de substituições como por exemplo a BLOSUM, para ponderar as distâncias evolutivas a estas pontuações. As pontuações na matriz são dadas pela razão da frequência observada pela frequência esperada. Mais precisamente, é feito o logaritmo desta razão que se refere como a razão logarítmica verossímil, formula mostrada abaixo em que a Pontuaçãoij é a pontuação para o resíduo i na posição j, f' é a frequência relativa para um resíduo i na posição j, ponderado pela matriz de distância, e qi é a frequência relativa do resíduo esperada em uma sequência aleatória. A figura 10 mostra uma representação esquemática da construção dos perfis. As vantagens associadas a este método são bons para trabalhar com regiões curtas e conservadas, ele é relativamente rápido e simples de implementar e as pontuações por ele podem ser interpretados com base em teoria estatística. Entretanto, entre as desvantagens, pode- se destacar que as inserções e deleções são estritamente proibidas. Por conseguinte, regiões de sequências relativamente longas não podem ser descritas com este método> Como acontece com todos os métodos que utilizam pesos, existe uma dificuldade de capturar todos os membros da família, além da probabilidade de se adicionar falsos positivos.