CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS

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1 CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS Agonistas PPAR (rosiglitazona, bezafibrato e fenofibrato) e alterações bioquímicas e estruturais em órgãos-alvo de camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica rica em sacarose Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências no Programa de Pós-Graduação em Biologia Humana e Experimental, Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Orientador: Professor Doutor Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda Rio de Janeiro, RJ 2010

2 CAROLINE FERNANDES DOS SANTOS Agonistas PPAR (rosiglitazona, bezafibrato e fenofibrato) e alterações bioquímicas e estruturais em órgãos-alvo de camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica rica em sacarose Apresentada em: 7 de junho de 2010 Banca Examinadora: Prof. Dr. Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda (orientador) Rio de Janeiro, RJ 2010

3 DEDICATÓRIA À minha família, aos amigos queridos, ao meu orientador.

4 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, pelo apoio e amor incondicional. Por terem ajudado sua filha de 17 anos a ir para a cidade grande cursar uma universidade e conquistar o mundo! À Prof. Dra. Leila Maria Meirelles Pereira, pelo incentivo no meu 2 período de faculdade em Ciências Biológicas a iniciar o estágio de Iniciação Científica no Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular (LMMC) da Uerj, laboratório onde me encontrei e permaneço até hoje. Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Mandarim de Lacerda, por toda a orientação ao longo desses nove anos, desde a Iniciação Científica, passando pelo Mestrado e agora Doutorado, pelo incentivo constante a auto-superação, ao aprendizado de novas técnicas e a aquisição de novos conhecimentos. E não posso esquecer também do zelo pelo planejamento do protocolo experimental e na aplicação das técnicas, pois nada é mais forte que a sua parte mais fraca. E é claro, se ao longo do meu caminho enxerguei mais longe, foi porque eu estava apoiada no ombro de um gigante. À Prof. Dra. Márcia Barbosa Águila, por ter me acolhido e adotado como orientanda. Seu conhecimento sobre dietas experimentais foi fundamental para a execução do trabalho. Ao nutricionista Rafael Evangelista, que participou deste trabalho como aluno de Iniciação Científica, por toda a ajuda. Além do aprendizado das técnicas, espero que esse trabalho tenha contribuído com a sua formação tanto profissional quanto científica. À técnica Thatiany Marinho, por toda a assistência durante o desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por seccionar meu material e pela ajuda na compra do material necessário para a realização da imunohistoquímica. Fico muito feliz que você tenha escolhido seguir a carreira de Biólogo, lhe desejo muito sucesso nessa sua nova empreitada.

5 Aos amigos de longa data Leonardo Mendonça e Mariana Catta-Preta, por toda a ajuda, apoio e produtivas discussões sobre nossos trabalhos ao longo de nossos mestrado e doutorado. Vocês sempre estiveram presentes e sempre me ajudaram, creio que sempre estarão, e sei que posso contar com vocês sempre que necessário. Aos amigos de curta data cultivados ao longo do doutorado, Thiago Torres, Sandra Barbosa, Lyana Parente, Daniele Bezerra e Fernanda Amorim, que também sempre me apoiaram verdadeiramente, assim como contribuíram inúmeras vezes com profundas discussões sobre o andamento de nossos trabalhos. À equipe LMMC news e Titanic, por descontrair nosso ambiente de trabalho com atualizações diárias dos acontecimentos inéditos. Nosso barco pode ficar à deriva, mas não afundará nunca! Aos secretários Ciro Reis e Simone por estarem sempre dispostos a resolver nossos pepinos como cancelar uma disciplina aqui, resolver assuntos de bolsa ali... Obrigada por terem paciência comigo durante o processo de pedido da bolsa PDEE Capes. Ao Prof. Dr. Kamal Rahmouni por ter me acolhido em seu laboratório durante o doutorado sandwich. Também agradeço ao Donald Morgan e ao Deng-Fuo Guo pelo ensino das técnicas de fisiologia e biologia molecular, além dos demais integrantes do laboratório Leonard Brooks, Shannon Harlan e Kenjiro Muta. À Elisa Mandarim por ter me apresentado à Iowa City e me ajudado nos primeiros meses de adaptação à cidade. Aos amigos conquistados durante o doutorado sandwich Milena Pires, Robert Corso, Marlon Hernadez, Luciana Cunha, Evan Roz, Gustavo Koberstein, Ian DeVolder e Aline Hilzendeger, pelos momentos de descontração, pelo apoio e por terem tornado a minha estadia longe de casa mais fácil. À todos os componentes do LMMC por todo o apoio e torcida ao longo do desenvolvimento deste projeto.

6 Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco à medida que adquirimos conhecimento. Instala-se a dúvida. Johann Goethe

7 RESUMO FERNANDES-SANTOS Caroline. Agonistas PPAR (rosiglitazona, bezafibrato e fenofibrato) e alterações bioquímicas e estruturais em órgãos-alvo de camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica rica em sacarose. Tese (Doutorado em Ciências, Biologia Humana e Experimental) IBRAG, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Este trabalho teve o objetivo de estudar o efeito de medicamentos com diferentes ações agonista PPAR (rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato) sobre o perfil lipídico, glicídico e alterações na massa corporal e morfologia do tecido adiposo e pancreático em modelo de diabetes e sobrepeso induzido por dieta. Camundongos C57BL/6 (2 meses de idade) foram alimentados com dieta padrão (SC, n=10) ou dieta hiperlipídica rica em sacarose (HFHS, n=40) por 6 semanas. Logo após, os animais HFHS foram subdividos em: HFHS não tratado e HFHS tratado com rosiglitazona (HFHS-Ro), fenofibrato (HFHS-Fe) ou bezafibrato (HFHS-Bz) (5 semanas). Os camundongos alimentados com dieta HFHS apresentaram maior glicemia e insulina de jejum (+33% e +138%, respectivamente), intolerância à glicose, resistência à insulina, aumento da massa corporal (MC) (+20%) e adiposidade, hipertrofia de adipócitos e redução da imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo. No pâncreas houve aumento da massa (+28%), acúmulo de gordura (+700%), hipertrofia da ilhota (+38%) e redução da imunocoloração para GLUT-2 (-60%). A rosiglitazona diminuiu a glicemia e insulina de jejum, porém induziu o ganho de MC e hipertrofia cardíaca. O fenofibrato estabilizou a MC, enquanto o bezafibrato levou a perda de MC. Apenas o bezafibrato impediu a hipertrofia da ilhota. A imunocoloração para GLUT-2 foi aumentada por todos os medicamentos, e não houve alterações na imunocoloração para o PPARα. Sinais morfológicos de pancreatite foram vistos no grupo HFHS-Fe, apesar dos níveis normais de amilase e lipase séricos. A rosiglitazona exacerbou a infiltração intrapancreática de gordura (+75% vs. HFHS), e o bezafibrato aumento a imunocoloração para o PPARβ/δ nas ilhotas pancreáticas. Em conclusão, o bezafibrato apresentou um efeito mais amplo sobre as alterações metabólicas, morfológicas e biométricas decorrentes da dieta HFHS, sugerindo que a inibição das três isoformas do PPAR seria melhor do que a inibição de apenas uma isoforma. A rosiglitazona exacerbou o ganho de MC, a infiltração de gordura no pâncreas e induziu hipertrofia cardíaca, assim, é necessário cautela ao prescrever este medicamento a um paciente obeso. Palavras chaves: Receptor ativador de proliferação peroxissomal, dieta hiperlipídica rica em sacarose, doença pancreática gordurosa não-alcoólica, fibratos, rosiglitazona, adiponectina.

8 ABSTRACT This work aimed to evaluate the effect of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists (rosiglitazone, fenofibrate and bezafibrate) on lipid and glucose metabolism, body mass, and adipose and pancreatic tissue morphology in a model of diet-induced type 2 diabetes and overweight in mice. Two-month-old male C57BL/6 mice were fed a standard chow (SC, n=10) or a high-fat high-sucrose chow (HFHS, n=40) for 6 weeks, and then HFHS-fed mice were subdivided by treatment: untreated HFHS and HFHS treated with rosiglitazone (HFHS-Ro), fenofibrate (HFHS-Fe), or bezafibrate (HFHS-Bz) (5 weeks on medication). HFHS-fed mice have altered fasting glucose (+33%) and insulin (+138%), GI, IR, increased body mass (+20%) and fat pad weight, adipocyte hypertrophy, and decreased adiponectin immunostain. They also presented increased pancreatic (+28%) mass, intrapancreatic fat (+700%), islet hypertrophy (+38%), and decreased GLUT-2 immunostain (-60%). Rosiglitazone reduced fasting glucose and insulin but induced weight gain and heart hypertrophy. Fenofibrate impaired body mass gain, while bezafibrate induced weight loss. Only bezafibrate impaired islet hypertrophy. GLUT-2 immunostain was improved by all treatments, and there were no alterations in PPAR-α stain. There were morphological signs of pancreatitis in fenofibrate-treated mice, although there was no alteration in serum amylase and lipase. Rosiglitazone exacerbated pancreatic fat infiltration (+75% vs. HFHS group), and bezafibrate increased PPAR-β expression in pancreatic islets. In conclusion, bezafibrate showed a wider range of action on metabolic, morphologic, and biometric alterations due to HFHS intake, suggesting that inhibiting the three PPAR isoforms is better than inhibiting each isoform alone. Rosiglitazone exacerbated body mass gain, pancreatic fat infiltration and induced heart hypertrophy as well, thus, precaution has to be taken in prescribing rosiglitazone to obese patients. Key words: Peroxisome proliferator-activated receptor, high-fat high-sucrose diet, nonalcoholic fatty pancreatic disease, fibrates, rosiglitazone, adiponectin.

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura Página 1 Lipotoxicidade na síndrome metabólica Regulação da glicemia pela insulina Tecido adiposo: células e adipocinas Padrões de distribuição da gordura corporal na obesidade Ativação do PPAR e transcrição gênica Morfometria do adipócito Quantificação da densidade de volume de gordura pancreática Quantificação da imunocoloração nas ilhotas pancreáticas Eficiência alimentar dos diferentes grupos experimentais, nos períodos pré-tratamento e pós-tratamento Evolução da massa corporal ao longo do experimento Teste oral de tolerância à glicose Hipertrofia cardíaca Adipócitos na gordura retroperitoneal Regressão linear e correlação de Pearson entre o diâmetro do adipócito da gordura retroperitoneal e a resistência à insulina (avaliada pelo HOMA-IR) Imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo retroperitoneal Fotomicrografias do tecido pancreático mostrando os achados mais frequentes Fotomicrografias de ilhotas pancreáticas coradas com diferentes anticorpos... 77

10 LISTA DE TABELAS Tabela Página 1 Componentes da Síndrome Metabólica segundo o NCEP-ATP III Modelos de Doenças Metabólicas induzidas por Dieta Composição das dietas Ingestão de Ração, Energia e Água Metabolismo Lipídico e Glicídico e Função Pancreática Gorduras Viscerais e Subcutânea e Diâmetro do Adipócito Regressão linear e correlação entre o diâmetro do adipócito de diferentes depósitos de gordura e parâmetros do metabolismo glicídico Quantificação da Imunocoloração para Adiponectina no Tecido Adiposo (sistema semiquantitativo por escore) Massa Pancreática, Diâmetro da Ilhota e Gordura Pancreática Quantificação da Densidade de Imunomarcação nas Ilhotas Pancreáticas... 78

11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Sigla Definição Sigla Definição AGL Ácido graxo livre LGK Glicoquinase hepática AIN93 Guia nutricional para roedores LPL Lipase lipoproteica AMPK Adenosina monofosfato quinase MCP-1 Proteína quimiotática do macrófago 1 APOA1 Apolipoproteína A-1 NaCl Cloreto de sódio ASC Área sob a curva NCEP- ATPIII Programa Nacional de Educação do Colesterol Terceiro Painel de Tratamento do Adulto ATP Adenosina trifosfato NR1C1 sinônimo de PPARα bgk Glicoquinase pancreática NR1C2 sinônimo de PPARβ/δ BRIN-BD11 Linhagem clonal de células β NR1C3 sinônimo de PPARγ BSA Albumina de soro bovino ob/ob Camundongo deficiente em leptina Bz Bezafibrato OMS Organização Mundial de Saúde C/EBPS CCAAT/enhancer biding protein PACAP Polipeptídeo ativador da adenilato ciclase Ca 2+ Íon cálcio PAI-1 Inibidor do ativador de plasminogênio-1 CCL2 Quimiocina CC ligante 2 PBS Salina tamponada com fosfato CT Colesterol total Pp Pontos parciais db/db Camundongo com excesso de leptina PPAR Receptor ativador de proliferação celular DM2 Diabetes tipo II PPRE Elemento responsivo ao PPAR EGIR Grupo Europeu de Estudo da Resistência à Insulina PT Pontos totais EPM Erro padrão da média RA Ácido retinóico Fe Fenofibrato RI Resistência à insulina GIP Peptídeo insulinotrópico dependente de glicose RNAm RNA mensageiro GK Glicoquinase Ro Rosiglitazona GLP-1 Peptídeo semelhante ao glucagon 1 ROS Espécies reativas de oxigênio GLUT Transportador da glicose RXR Receptor do ácido retinóico HDL Lipoproteína de alta densidade SC Grupo dieta controle HFHS Grupo dieta rica em lipídios e sacarose SD Rato Sprague Dawley HOMA-IR Índice de resistência à insulina Sub:Vis Relação entre gordura subcutânea e visceral HSL Lipase sensível a hormônio TG Triglicerídeo IL-1b Interleucina 1β TNF-α Fator de necrose tumoral α

12 Sigla Definição Sigla Definição IL-6 Interleucina 6 TOTG Teste oral de tolerância à glicose INS-1 Linhagem clonal de células β TZD Tiazolidinediona IR Receptor da insulina VEGF Fator vascular de crescimento endotelial K + Íon potássio VIP Peptídeo intestinal vasoativo LDL Lipoproteína de baixa densidade Vv[gord] Densidade de volume de gordura

13 SUMÁRIO Página INTRODUÇÃO 15 1 OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos 17 2 REVISÃO DA LITERATURA Síndrome Metabólica Metabolismo da Glicose e Sensibilidade à Insulina Tecido Adiposo, Adipócitos e Adipocinas Tecido Adiposo Visceral versus Subcutâneo Doença Gordurosa Pancreática Não-Alcoólica Receptores Ativadores de Proliferação Peroxissomal Modelos Experimentais de Doenças Metabólicas 42 3 MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção da Amostra e Grupos Experimentais Ingestão de Ração, Água, Energia e Eficiência Alimentar Metabolismo Glicídico e Lipídico e Função Pancreática Hipertrofia Cardíaca Morfometria do Tecido Adiposo Morfometria e Estereologia do Pâncreas 51

14 3.7 Imunohistoquímica do Tecido Adiposo e Pâncreas Análise Estatística 55 4 RESULTADOS Ingestão de Ração, Energia e Água e Eficiência Alimentar Massa Corporal Lipídios Séricos Insulina e Glicose séricos Coração Gorduras Visceral e Subcutânea e Diâmetro do Adipócito Expressão de Adiponectina no Tecido Adiposo Massa do Pâncreas, Gordura pancreática e Ilhotas pancreáticas Expressão de Insulina, Glucagon, GLUT-2 PPARα e PPARδ/β nas Ilhotas Pancreáticas 76 5 DISCUSSÃO Considerações Finais 88 6 CONCLUSÃO 89 REFERÊNCIAS 90 ANEXO - Parecer do Comitê de Ética em Experimentação Animal APÊNDICE 1 - Artigo publicado na revista Nutrition APÊNDICE 2 - Artigo publicado na revista Pancreas

15 15 INTRODUÇÃO A obesidade, o diabetes e as doenças cardiovasculares são cada vez mais comuns na sociedade moderna. Estas patologias estão frequentemente associadas à ingestão da dieta ocidental rica em lipídios saturados combinado a um estilo de vida sedentário. Este hábito alimentar vai contra o genótipo econômico, que promove o armazenamento de energia nas células adiposas na forma de triacilglicerol a fim de atingir a demanda energética em tempos de necessidade (Prentice e Moore, 2005). A obesidade é uma doença heterogênea em relação à distribuição regional do tecido adiposo. Existem dois depósitos principais de tecido adiposo, um visceral, e um subcutâneo. O tecido adiposo subcutâneo é definido como a gordura localizada entre a pele e o músculo, enquanto o tecido adiposo visceral localiza-se no interior das cavidades corporais, principalmente abdominal (Catalan et al., 2009). Evidências mostram que a obesidade visceral está associada a um risco aumentado para comorbidades associadas à obesidade, enquanto a gordura subcutânea estaria associada a um risco reduzido de doenças cardiovasculares (Wajchenberg, 2000; Wajchenberg et al., 2002; Despres e Lemieux, 2006). Além disso, o tecido adiposo visceral é mais ativo metabolicamente do que o subcutâneo, assim como também há diferença entre as moléculas secretadas por eles (Fried et al., 1998; Russell et al., 1998; Lihn et al., 2004; Hotamisligil, 2006). Alguns trabalhos mostram que o tecido pancreático pode ser foco de acúmulo ectópico de gordura (Ogilvie, 1933; Matsumoto et al., 1995; Katz et al., 1999), mas até recentemente, descrições sobre a influência da obesidade sobre o acúmulo de gordura no pâncreas ainda não tinham sido feitas. Mathur e col. foram os primeiros a descrever uma condição denominada doença pancreática gordurosa não alcoólica, a qual se caracteriza pelo aumento da massa pancreática e gordura intralobular e interlobular (especialmente triglicerídeos e ácidos graxos livres), além do aumento da produção de citocinas inflamatórias (Mathur et al., 2007). A pancreatite é outra

16 16 doença que compromete a função pancreática normal, e sua patogênese ainda não é bem entendida. Entretanto, evidências sugerem que há uma conexão potencial entre a ingestão de dieta rica em lipídios e o dano pancreático crônico (Chowdhury et al., 2000; Yan et al., 2006; Zhang et al., 2008). Os receptores ativadores de proliferação peroxissomal (PPAR) fazem parte de uma família de fatores de transcrição intimamente conectada ao metabolismo celular de lipídios, carboidratos e proteínas, além de promoverem a diferenciação celular. Eles existem em três isotipos: PPARα, PPARβ/δ e PPARγ (Dreyer et al., 1992). O PPARα é expresso em tecidos metabolicamente ativos como o fígado, coração, rim e músculo esquelético, o PPARβ/δ é expresso de forma ampla, e a expressão do PPARγ é encontrada de forma predominante no tecido adiposo, macrófagos, colo e placenta (Rosen e Spiegelman, 2000). Medicamentos capazes de modular a expressão do PPAR como as tiazolidinedionas (TZD) e os fibratos são bem conhecidos pelos clínicos. Os TZDs são ativadores PPARγ e ajudam a aumentar a sensibilidade dos tecidos à ação da insulina em pacientes diabéticos. Os fibratos são ativadores PPARα e reduzem a produção hepática de triglicerídeos pelo aumento da oxidação de ácidos graxos. Não há medicamentos com ação agonista PPARβ/δ no mercado, apesar de existirem fortes evidências de que sua ativação reduz o tamanho do adipócito e a massa adiposa corporal total (Luquet et al., 2003; Wang et al., 2003), tornando-os armas potentes no combate a obesidade. Há um grande potencial para que medicamentos capazes de ativar mais de um isotipo do PPAR (duplo-agonistas PPARα/γ ou pan-agonistas PPARα/β/δ/γ) sejam utilizados como instrumento de combate à doenças metabólicas. Infelizmente, alguns deles possuem efeitos colaterais como, por exemplo, o aumento de eventos cardiovasculares adversos (muraglitazar, infarto do miocárdio, acidente vascular encefálico e ataque isquêmico transitório; tesaglitazar, aumento da creatina sérica) (Fagerberg et al., 2005; Nissen et al., 2005). Sabe-se hoje que o bezafibrato agonista PPARα também possui alta afinidade pelos isotipos β e γ e, por essa razão, ele é classificado como um pan-agonista PPAR (Krey et al., 1997; Willson et al., 2000). O bezafibrato tem sido amplamente utilizado no tratamento da dislipidemia em

17 17 humanos com um bom perfil de segurança (Goa et al., 1996). Além disso, estudos clínicos têm mostrado suas propriedades anti-diabéticas (Tenenbaum et al., 2005; Tenenbaum et al., 2006). A ação dos TZDs e fibratos sobre o metabolismo glicídico e lipídico são bem conhecidas, porém a comparação entre a ação de um pan-agonista PPAR e agonistas PPAR únicos (que ativam apenas um isotipo do PPAR) sobre alterações na massa corporal, tecido adiposo e pâncreas in vivo decorrentes da ingestão de uma dieta rica em lipídios e sacarose merece atenção. 1 OBJETIVOS 1.1 Objetivo Geral Estudar o efeito de medicamentos com diferentes ações agonista PPAR (rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato) sobre o perfil lipídico, glicídico e alterações na massa corporal e morfologia do tecido adiposo e pancreático em modelo de diabetes e sobrepeso induzido por dieta. 1.2 Objetivos Específicos Induzir o diabetes tipo II e o sobrepeso em camundongos C57BL/6 através da administração de dieta rica em lipídios e sacarose; Comparar o efeito da rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato sobre: o Metabolismo glicídico e lipídico; o Massa corporal, morfologia do tecido adiposo e expressão de adiponectina; o Morfologia pancreática e expressão de insulina, glucagon, GLUT2, PPARα e PPARβ/δ.

18 18 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Síndrome Metabólica A síndrome metabólica é caracterizada por um conjunto de fatores de risco cardiovascular, usualmente relacionados à deposição central de gordura e à resistência à insulina, sendo responsável pelo aumento da taxa de mortalidade geral em 1,5 vezes e da mortalidade cardiovascular em 2,5 vezes. A predisposição genética (Bouchard, 1995), a alimentação inadequada (Liese et al., 1998) e a inatividade física (Lakka et al., 2003) estão entre os principais fatores que contribuem para o surgimento dessa síndrome. Há uma indicação consensual de que o aumento da pressão arterial, os distúrbios do metabolismo glicídico e lipídico e o excesso de massa corporal estão, de forma definitiva, associados ao aumento da morbimortalidade cardiovascular, fato observado não só nos países desenvolvidos, mas também, e de forma preocupante, nos países em desenvolvimento e subdesenvolvidos (SBH, 2004). A combinação de alterações metabólicas conhecida atualmente como síndrome metabólica foi primeiramente descrita por Kylin em 1923 como sendo a associação entre a hipertensão arterial, a hiperglicemia e a gota (Kylin, 1923). Duas décadas depois, Vague notou que a adiposidade concentrada na porção superior do corpo (andróide, descrita em maior detalhe na seção Tecido Adiposo Visceral versus Subcutâneo ) era o tipo mais frequentemente associado com as anormalidades metabólicas vistas no diabetes e na doença cardiovascular (Vague, 1947). Em 1988, Reaven utilizou o termo Síndrome X e estabeleceu firmemente a importância clínica desta síndrome, apesar da obesidade não ter sido incluída (Reaven, 1988). Em 1989, Kaplan renomeou a síndrome como Quarteto Mortal, e outros atribuíram o nome de Síndrome da Resistência à Insulina (Kaplan, 1989; Haffner et al., 1992). Hoje, o nome Síndrome Metabólica é a descrição mais utilizada e mais bem aceita para a caracterização desta constelação de distúrbios metabólicos que atuam não apenas

19 19 como fatores de risco cardiovascular, mas também predizem o alto risco de desenvolvimento do diabetes (se este já não estiver presente). Vários grupos tentaram desenvolver uma definição única para a síndrome metabólica. As definições mais amplamente aceitas foram propostas pela Organização Mundial de Saúde (OMS), pelo Grupo Europeu de Estudo da Resistência à Insulina (EGIR) e pelo Programa Nacional de Educação do Colesterol Terceiro Painel de Tratamento do Adulto (NCEP-ATP III) (Balkau e Charles, 1999; World Health Organisation, 1999; NCEP, 2002). Todos os grupos concordam com os componentes que são o centro da síndrome metabólica: obesidade, resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão arterial. Entretanto, eles estabelecem diferentes critérios clínicos para a identificação de cada componente, sendo seus valores ligeiramente diferentes, quando as três recomendações são comparadas entre si. A definição da OMS preconiza como ponto de partida a avaliação da resistência à insulina ou do distúrbio do metabolismo da glicose, o que dificulta a sua utilização. Por outro lado, a definição do NCEP-ATP III foi desenvolvida para uso clínico e não exige a comprovação de resistência à insulina, facilitando a sua utilização (SBH, 2004). Segundo o NCEP-ATP III, a síndrome metabólica representa uma combinação de pelo menos três componentes dos apresentados na Tabela 1, e devido a sua simplicidade e praticidade, ela é a definição recomendada pela I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica (SBH, 2004). Apesar de não fazerem parte dos critérios de diagnóstico da síndrome metabólica, várias condições clínicas e fisiopatológicas estão frequentemente associadas a ela, tais como: síndrome de ovários policísticos, acanthosis nigricans, doença hepática gordurosa não-alcoólica, microalbuminúria, estados pró-trombóticos, estados próinflamatórios e de disfunção endotelial e hiperuricemia (Bloomgarden, 2004). É importante destacar o aumento da prevalência da obesidade em todo o Brasil e uma tendência de aumento especialmente preocupante do problema em crianças em idade escolar, em adolescentes e nos estratos de menor renda (Monteiro et al., 1995). A adoção precoce por toda a população de estilos de vida que promovam a manutenção da saúde, como a ingestão de uma dieta adequada e a prática regular de

20 20 atividade física, preferencialmente desde a infância, são componentes básicos para a prevenção da síndrome metabólica. As características clínicas da síndrome metabólica estão associadas a um risco aumentado de desenvolvimento de doença cardiovascular (Alexander et al., 2003), incluindo um maior risco de doença arterial coronariana para um determinado nível de LDL colesterol (2001), assim como morte prematura (Trevisan et al., 1998). O estabelecimento de um critério para a definição da síndrome é útil, uma vez que cada componente individual atua de forma sinérgica de forma a amplificar o risco; porém, estes mesmo componentes também são fatores de risco independentes para o desenvolvimento da doença cardiovascular aterosclerótica. Tabela 1. Componentes da Síndrome Metabólica segundo o NCEP-ATP III 1 Componentes Níveis Obesidade Abdominal (circunferência da cintura) Homem > 102 cm Mulher > 88 cm Triglicerídeos 150 mg/dl HDL colesterol Homens < 40 mg/dl Mulheres < 50 mg/dl Pressão Arterial 130 mmhg ou 85 mmhg Glicemia de Jejum 110 mg/dl 1 Adaptado de NCEP-ATPIII 2001 (2001).

21 21 Apesar da obesidade por si só não ser um componente no diagnóstico da síndrome metabólica, há evidências suficientes de que a gordura visceral intra-abdominal a qual aumenta com a idade (Bouchard et al., 1993) esteja intimamente ligada a resistência à insulina. Esta relação fisiopatológica é consistente ao se notar a ênfase sobre a circunferência abdominal e a relação cintura-quadril (World Health Organisation, 1999), parâmetros amplamente utilizados como critério de diagnóstico de risco cardiovascular decorrente da obesidade, ao invés do uso do índice de massa corporal. Mesmo em indivíduos que possuem massa corporal normal, o aumento da circunferência abdominal está associado a um risco cardiovascular aumentado. As anormalidades do metabolismo lipídico estão frequentemente presentes em indivíduos com síndrome metabólica, formando uma tríade de dislipidemia aterogênica que consiste em hipertrigliceridemia, baixos níveis de HDL colesterol e altos níveis de LDL (Howard e Howard, 1994; Betteridge, 1997). Mais especificamente, as partículas de LDL pequenas e densas que são mais aterogênicas estão presentes em proporção aumentada. Além disso, níveis aumentados de partículas remanescentes com capacidade aterogênica ricas em triglicerídeo e colesterol também são encontrados. Assim, a hipertrigliceridemia tem sido estudada como um defeito metabólico central que leva a uma cascata de eventos, que no final produz um perfil lipídico pró-aterogênico. Este tipo de dislipidemia encontrada na síndrome metabólica também está comumente presente em pacientes com diabetes tipo 2. Também é importante ressaltar que os indivíduos não diabéticos com síndrome metabólica apresentam um risco elevado de desenvolvimento de diabetes tipo 2 (Laaksonen et al., 2002; Lorenzo et al., 2003). A pressão arterial aumentada é um componente frequente na síndrome metabólica, e a hipertensão arterial é mais frequentemente vista em indivíduos com resistência à insulina ou obesidade (Reaven, 1988). Diversos estudos têm mostrado que mesmo ganhos modestos de massa corporal podem precipitar o surgimento da hipertensão arterial (Must et al., 1999). Assim como acontece no infarto do miocárdio, também há uma associação positiva e significante entre a presença da síndrome metabólica e o acidente vascular encefálico (Ninomiya et al., 2004).

22 22 Um dos maiores desafios na síndrome metabólica é entender os mecanismos celulares e moleculares que fazem a conexão entre a constelação de anormalidades metabólicas e seus efeitos fisiopatológicos que mais tardiamente se manifestarão na forma de doença. Diversas evidências apontam o aumento da massa de tecido adiposo como o mecanismo primário por trás desta síndrome. Assim como nos humanos que apresentam formas raras de obesidade monogênica, os modelos de obesidade genética em roedores frequentemente manifestam resistência à insulina, hiperglicemia e hipertrigliceridemia. Algumas características peculiares à adiposidade aumentada têm sido apontadas como causas das alterações referenciadas acima. Entre elas podemos destacar: (1) níveis elevados de ácidos graxos livres, levando a resistência periférica à insulina (Boden, 1997); (2) esteatose tecidual (p. ex., no músculo esquelético, fígado e ilhotas pancreáticas) e consequente lipotoxicidade (prejuízo na sinalização da insulina nestes tecidos) (Fig. 1) (Unger, 1995) e; (3) níveis reduzidos de adiponectina (adipocina ligada à sensibilidade à insulina) e níveis elevados de resistina (adipocina ligada à resistência à insulina) (Berg et al., 2001; Banerjee et al., 2004). Na síndrome metabólica, o acúmulo excessivo de ácidos graxos livres (AGL) em tecidos que não o tecido adiposo resulta em disfunção celular (p. ex., alterações no transporte de glicose estimulado pela insulina ou secreção diminuída de insulina) (Fig. 1). O acúmulo excessivo de AGL também pode levar à morte celular por apoptose. Os efeitos do acúmulo de AGL depende do tipo celular, da natureza do lipídio e do grau e duração da exposição aos níveis elevados de lipídios. A lipotoxicidade pode ser melhorada ou prevenida se o lipídio é redirecionado ao tecido adiposo (p. ex., através da estimulação da via dos receptores ativadores de proliferação peroxissomal [PPAR] γ) ou se ele é secretado na forma de lipoproteína. De forma alternativa, o direcionamento dos AGL aos depósitos de triglicerídeos ou para a β-oxidação aumentada (p. ex., através da estimulação das vias de sinalização do PPARα) pode proteger contra a lipotoxicidade. Agentes como os salicilatos, os inibidores da síntese de ceramidas ou as proteínas degradadoras de espécies reativas de oxigênio (ROS scavengers) podem bloquear algumas vias de sinalização específicas e vias do metabolismo de ácidos graxos que são críticas para a lipotoxicidade.

23 23 PPARγ Leptina PPARα Figura 1. Lipotoxicidade na síndrome metabólica. O aumento excessivo de ácidos graxos livres pode levar, em último caso, a disfunção celular (p. ex., alterações no transporte de glicose estimulado pela insulina ou secreção de insulina diminuída, dependendo do tipo celular) e, finalmente, a disfunção celular e morte por apoptose. Maiores explicações no texto acima. Abreviações: TG, triglicerídeo; PPAR, receptor ativador de proliferação peroxissomal. Adaptado de Schaeffer e col (Schaffer, 2003).

24 Metabolismo da Glicose e Sensibilidade à Insulina Apesar de a glicemia apresentar uma variação entre os estados alimentado e jejum, a glicose plasmática permanece dentro de um intervalo fisiológico limitado que varia de 4 a 7 mmol/l ( 72 a 126 mg/dl) em indivíduos sadios. Este controle é feito pelo balanço entre a absorção intestinal de glicose, sua produção hepática e sua captação e metabolismo nos tecidos periféricos. A insulina aumenta a captação da glicose nos tecidos periféricos e inibe sua produção hepática, servindo assim como um regulador primário de sua concentração sanguínea (Fig. 2). Ela também promove o armazenamento de substratos no tecido adiposo, fígado e músculo esquelético pela estimulação da lipogênese, glicogênese e síntese de proteínas, respectivamente, assim como inibe a lipólise, glicogenólise e quebra de proteínas (Scheen, 2004). Em condições normais, a insulina promove a captação de glicose nas células adiposas e musculares pela estimulação da translocação do transportador da glicose tipo 4 (GLUT4) de sítios intracelulares para a membrana plasmática. O GLUT4 se localiza na membrana de vesículas intracelulares, que estão em constante movimento de reservatórios intracelulares em direção à membrana plasmática e vice-versa. A insulina aumenta o transporte da glicose através do aumento da taxa de exocitose das vesículas que contêm o GLUT4, e pela ligeira diminuição da taxa de internalização das mesmas (Pessin et al., 1999). Estudos sugerem que estas vesículas se movem ao longo de trilhos de microtúbulos em direção a superfície celular, onde a vesícula então se ancora e se funde a membrana, permitindo a exposição extracelular da proteína GLUT4 (Guilherme et al., 2000).

25 25 Figura 2. Regulação da glicemia pela insulina. O aumento nos níveis plasmáticos de glicose é percebido pelas células β da ilhota pancreática, que secretam insulina. No adipócito e no músculo esquelético, a ligação da insulina ao seu receptor IR estimula a translocação do GLUT4 para a membrana e consequente captação de glicose para armazenamento. No fígado, a estimulação do receptor IR leva a uma série de eventos que no final inibem a produção hepática de glicose. Adaptado de Muoio e col (Muoio e Newgard, 2005).

26 26 Até 75% da captação de glicose dependente de insulina ocorre no músculo esquelético, enquanto o tecido adiposo contribui apenas com uma pequena fração (Klip e Paquet, 1990). De forma interessante, camundongos com o receptor da insulina silenciado no músculo esquelético possuem tolerância normal à glicose (Bruning et al., 1998), enquanto esta mesma alteração no tecido adiposo leva a intolerância à glicose, aparentemente devido a indução de resistência à insulina no músculo e no fígado (Abel et al., 2001). Tanto a obesidade quanto a lipoatrofia resultam em resistência à insulina e predispõem ao diabetes mellitus tipo 2 (DM2), demonstrando que o tecido adiposo é crucial na regulação do metabolismo glicídico (Gavrilova et al., 2000). Apesar da insulina não estimular a captação da glicose no fígado, ela é capaz de bloquear a glicogenólise e a gliconeogênese, assim como estimular a síntese de glicogênio. Muitos tecidos estão envolvidos na manutenção da homeostase da glicose. Entre eles, o fígado e as células β pancreáticas são os mais importantes porque eles podem sentir e responder a alterações nos níveis sanguíneos de glicose. O aparato de sensibilidade à glicose é composto pelo transportador de glicose tipo 2 (GLUT2) e pela glicoquinase (GK) (Schuit et al., 2001; Cerf, 2007). Enquanto o gene do GLUT2 possui um promotor único, o gene da GK possui dois promotores separados e funcionalmente distintos, que expressam isoformas da GK específicas para cada tecido: GK do fígado (LGK) e GK da célula β pancreática (βgk) (Magnuson, 1990). A glicose é captada pela célula através do GLUT2, e a GK mantém a glicose no citoplasma através de sua fosforilação (Schuit et al., 2001). Em indivíduos saudáveis a secreção de insulina estimulada pela glicose é bifásica. O aumento dos níveis de glicose no citoplasma da célula β induz a primeira fase de secreção da insulina, através de sua liberação de grânulos secretores presentes no citoplasma. A entrada de glicose na célula β é percebida pela βgk, que a fosforila em glicose-6-fosfato, gerando ATP. O fechamento dos canais de K + dependentes de ATP resulta na despolarização da membrana plasmática e ativação dos canais de Ca 2+ dependentes de voltagem, levando ao aumento intracelular da concentração de Ca 2+, e consequente secreção de insulina em pulsos (segunda fase de secreção) (Soria et al., 2004). Outros mediadores da secreção de insulina incluem a ativação de fosfolipases

27 27 e proteína quinase C (p. ex., pela acetilcolina), e a estimulação da atividade da adenilato ciclase e ativação da proteína quinase A. Este último mecanismo pode ser ativado por hormônios como peptídeos intestinais vasoativos (VIP), polipeptídeo ativador da adenilato ciclase (PACAP), peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) e peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP). Estes fatores parecem desempenhar um papel importante na segunda fase de secreção de insulina estimulada pela glicose, após o reabastecimento dos grânulos secretores intracelulares (Bratanova-Tochkova et al., 2002). O aparato de sensibilidade à glicose do fígado exerce forte influência na utilização da glicose e na síntese do glicogênio. A glicose é conhecida por regular a transcrição de diversos genes envolvidos nas vias metabólicas hepáticas (Girard et al., 1997; Nordlie et al., 1999), como o gene da L-piruvato quinase, da ácido graxo sintase e do GLUT2. O aumento intracelular da glicose-6-fosfato leva a glicólise e síntese de glicogênio (Aiston et al., 1999). Mesmo pequenas alterações na expressão da LGK levam a um impacto mensurável sobre a concentração sanguínea de glicose (Ferre et al., 1996; Hariharan et al., 1997; Niswender et al., 1997). Adicionalmente, camundongos silenciados especificamente para o GLUT2 hepático apresentam expressão diminuída da LGK (Burcelin et al., 2000). Assim, a LGK e o GLUT2 desempenham papéis chaves no metabolismo hepático da glicose. Os principais problemas relacionados ao DM2 são a resistência à insulina e a deterioração progressiva da função da célula β (Saltiel, 2001). A resistência à insulina pode ser desencadeada por diversos fatores como a idade, defeitos genéticos, fatores ambientais e a obesidade. Ela é caracterizada por uma alteração na sinalização normal da insulina nas células que captam a glicose. Há insulina, mas a resposta celular a sua presença está diminuída e assim, a captação da glicose é menor. Como resultado, aumenta o estímulo de secreção de insulina pela célula β, uma vez que parte da glicose ainda permanece no sangue. Se esta célula conseguir sentir os níveis de glicose e secretar insulina de forma suficiente a compensar a resistência à insulina (hiperinsulinemia compensatória), o DM2 não ocorre. O DM2 só se desenvolve quando ocorrem de forma concomitante a resistência à insulina e a insuficiência da célula β. A característica essencial da insuficiência da célula β é o aumento da

28 28 secreção basal de insulina e a diminuição da secreção de insulina estimulada pela glicose, resultantes da perda da habilidade da célula β em responder aos níveis circulantes de glicose (Muoio e Newgard, 2008). Tanto a hiperglicemia quanto a hiperlipidemia crônica podem exercer efeitos deletérios sobre a função da célula β, fenônemos denominados glicotoxicidade e lipotoxicidade, respectivamente. Progressivamente, ambos contribuem para a deteriorização da homeostase da glicose no DM2. O mecanismo da glicotoxicidade envolve diversos fatores de transcrição que são, pelo menos em parte, mediados pela geração de estresse oxidativo crônico (Matsuoka et al., 1997; Tajiri et al., 1997; Ihara et al., 1999). Ela desempenha efeitos lentos e progressivamente irreversíveis sobre a função da célula β pancreática: efeitos reversíveis até certo ponto, e então se tornam irreversíveis (Moran et al., 1997; Gleason et al., 2000). Além das alterações funcionais, a hiperglicemia crônica induz a diminuição da massa de células β através de apoptose (Pick et al., 1998; Donath et al., 1999). Os ácidos graxos combustível essencial da célula β no estado normal também se tornam tóxicos à célula β quando presentes cronicamente em níveis elevados. A exposição prolongada das células β aos ácidos graxos aumenta a secreção basal de insulina inibindo, porém, a secreção de insulina estimulada pela glicose. A lipotoxicidade é mediada provavelmente pelo acúmulo de um sinal citosólico derivado da via de esterificação do ácido graxo. Os ácidos graxos inibem a expressão do gene da insulina na presença de níveis elevados de glicose (Gremlich et al., 1997; Ritz-Laser et al., 1999; Jacqueminet et al., 2000), em parte devido à regulação negativa do fator de transcrição pancreático-duodenal homeobox-1 (Gremlich et al., 1997). Ácidos graxos em excesso também levam a morte da célula β por apoptose tanto in vitro (Cnop et al., 2001; Maedler et al., 2001), quanto in vivo (Pick et al., 1998; Shimabukuro et al., 1998). Tem sido proposto que a hiperglicemia crônica, independente da hiperlipidemia, é tóxica para a função da célula β, enquanto a hiperlipidemia crônica seria deletéria apenas quando concomitante a hiperglicemia (Poitout e Robertson, 2002).

29 Tecido Adiposo, Adipócitos e Adipocinas A homeostase da ingestão e do gasto energético é regulada pela deposição e liberação de ácidos graxos do tecido adiposo (na forma de triacilglicerol), um órgão que até recentemente não era considerado nas pesquisas que relacionavam o balanço energético com a obesidade. Entretanto, esta idéia mudou radicalmente nos últimos anos, e o tecido adiposo se tornou foco de intensa pesquisa. Existem algumas razões para essa mudança de pensamento: 1) a obesidade é definida como a expansão do tecido adiposo, assim ele deveria ser considerado como ponto central no estudo da doença; 2) o tecido adiposo branco é o sítio primário de produção dos hormônios envolvidos no balanço energético, como a leptina e; 3) o tecido adiposo secreta inúmeros fatores envolvidos numa constelação de processos metabólicos e fisiológicos, sendo que alguns destes fatores estão implicados em patologias associadas a obesidade, particularmente a resistência à insulina e a síndrome metabólica (Rajala e Scherer, 2003; Trayhurn e Wood, 2004). A simplicidade aparente do tecido adiposo branco e marrom, tanto histologicamente quanto metabolicamente, é a principal razão pela qual este órgão foi negligenciado até recentemente. O triacilglicerol constitui até 85% do peso do tecido, e por isso acreditava-se que sua função estava limitada a síntese e quebra de lipídios, mas sabe-se hoje que esta simplicidade é ilusória. Ao nível celular, existe uma considerada heterogeneidade, onde os adipócitos maduros contribuem com não mais do que metade do conteúdo celular. Entre as demais células estão, por exemplo, os fibroblastos, células endoteliais, pre-adipócitos e macrófagos (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003). O tecido adiposo branco é um órgão secretor, particularmente pela secreção de ácidos graxos durante o jejum. Ele também secreta outros lipídios como o colesterol e o retinol (armazenados, mas não sintetizados pelo adipócito), hormônios esteróides e prostaglandinas (Trayhurn e Beattie, 2001). Além disso, os adipócitos secretam a enzima lipase lipoprotéica (LPL), que quebra o triacilglicerol circulante em ácido graxo, para que seja posteriormente armazenado no adipócito. Os adipócitos são células de renovação lenta em pessoas não obesas, e a expansão do tecido adiposo durante o desenvolvimento (da idade jovem a meia idade) é

30 30 principalmente resultado do seu aumento uniforme em tamanho por hipertrofia (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000). No homem existe um aumento no número de adipócitos no depósito subcutâneo da região abdominal, o mesmo não ocorrendo na mulher. A obesidade que se desenvolve na criança e no adolescente é geralmente hiperplásica, ou seja, há um aumento no número de células adiposas (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000; Karelis et al., 2004). Por outro lado, a maior parte da obesidade no adulto está relacionada a expansão hipertrófica dos adipócitos pré-existentes (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000). Estudos sobre a celularidade do tecido adiposo mostram que os adipócitos se tornam gravemente resistentes à insulina se armazenam mais de 1,0 μg de lipídio/célula, e um novo recrutamento de adipócitos normalmente ocorre quando o conteúdo lipídico da célula atinge 0,7-0,8 μg/célula (Krotkiewski et al., 1983). O recrutamento de adipócitos ocorre pela proliferação e diferenciação dos préadipócitos, um processo que é caracterizado pela ativação e inativação de genes específicos através da indução de fatores de transcrição como o a CCAAT/enhancer biding protein (C/EBPs) e o receptor ativador de proliferação peroxissomal γ (PPARγ) (Gregoire et al., 1998). A atividade biológica do tecido adiposo muda conforme seu estoque de lipídio aumenta. Comparado aos adipócitos pequenos, os adipócitos grandes são mais resistentes à insulina e são mais lipolíticos, secretam mais citocinas inflamatórias, secretam menos adiponectina (Le Lay et al., 2001; Sopasakis et al., 2004), e são achados de forma mais frequente em indivíduos com distúrbios metabólicos relacionados a obesidade (Krotkiewski et al., 1983; Weyer et al., 2000). Dessa forma, a composição de células no tecido adiposo, assim como a proporção entre a quantidade de adipócitos grandes e pequenos, são fatores importantes na determinação da atividade metabólica e da resposta às alterações ambientais daquele depósito específico. O tecido adiposo secreta moléculas peptídicas e não peptídicas que são coletivamente denominadas adipocinas (Fig. 3). Elas funcionam como hormônios, regulando a atividade biológica de tecidos e órgãos vizinhos e distantes (Smith et al., 2005). Algumas adipocinas são sintetizadas exclusivamente pelos adipócitos (p. ex., adiponectina), enquanto outras são sintetizadas pelos outros tipos celulares

31 31 presentes no tecido adiposo. A diversidade entre as adipocinas é grande, tanto em termos de estrutura protéica quanto em função. Entre elas podemos encontrar citocinas clássicas (p. ex., fator de necrose tumoral α, TNF-α; interleucina 6, IL-6), quimiocinas (p. ex., proteína quimiotática do monócito, MCP-1), proteínas do sistema complemento (p. ex., adipsina) e proteínas envolvidas na homeostase vascular (p. ex., inibidor do ativador do plasminogênio-1, PAI-1), na regulação da pressão arterial (angiotensinogênio), no metabolismo lipídico (p. ex., proteína de transferência de ésteres de colesterol, proteína ligante do retinol), na homeostase da glicose (p. ex., adiponectina e resistina) e na angiogênese (p. ex., fator vascular de crescimento endotelial, VEGF) (Rajala e Scherer, 2003; Trayhurn e Wood, 2004). Entre as adipocinas mais recentemente descobertas estão a proteína ligadora de retinol 4 (RBP-4), Nampt/PBEF/Visfatin, lipocalina 2 (LCN-2), omentina, chemerina, osteopondina e vaspina (Catalan et al., 2009). Geralmente a taxa de secreção das adipocinas ocorre de acordo com a quantidade de gordura estocada no adipócito, um fenômeno que representa um meio de ajustar a atividade celular de forma a manter a fisiologia e a morfologia ótima do tecido adiposo. Por exemplo, o aumento da produção de TNF-α e IL-6 pelo tecido adiposo na obesidade estimula a atividade da lipase sensível a hormônio (HSL), diminui a expressão de GLUT4, assim como a produção e a atividade da LPL, limitando a entrada adicional de lipídios nos adipócitos hipertrofiados (Wajchenberg, 2000; Smith et al., 2005). A leptina e a adiponectina são as adipocinas mais estudadas até o momento, e sabe-se que ambas exercem efeitos regulatórios no hipotálamo, fígado, ilhotas pancreáticas e músculo esquelético (Smith et al., 2005). A leptina funciona como um sinal de feedback negativo na regulação da massa corporal. Uma redução nos níveis de leptina sinaliza que o armazenamento de energia está insuficiente. Isto induz a ingestão de energia e a redução do seu gasto e aumenta a transformação de energia em gordura, levando a um balanço energético positivo que, consequentemente, eleva os níveis de leptina (Friedman, 2002). Entretanto, a obesidade está frequentemente associada com hiperleptinemia, refletindo um estado de resistência à ação da leptina em indivíduos obesos, uma vez que eles permanecem com peso elevado apesar dos altos níveis de leptina circulante (Caro et al., 1996). Adicionalmente, a leptina aumenta a atividade nervosa simpática renal na obesidade, levando ao conceito de

32 32 resistência seletiva à leptina, onde a resistência parece estar limitada as suas ações metabólicas com preservação, porém, da sua ação sobre a atividade simpática renal (Correia et al., 2002; Rahmouni et al., 2002; Rahmouni et al., 2005). A adiponectina é uma citocina anti-inflamatória que possui ação tanto de sensibilização à insulina quanto anti-aterosclerótica. Semelhante à leptina, a produção de adiponectina também responde ao estado energético sistêmico. Entretanto, enquanto a adiposidade eleva os níveis plasmáticos de leptina, ela reduz significativamente os níveis de adiponectina (Weyer et al., 2001). Apesar do efeito oposto em relação ao acúmulo de gordura, tanto a adiponectina quanto a leptina regulam a via AMP quinase (AMPK) de forma a aumentar a oxidação de ácidos graxos nos tecidos alvos, tanto através de uma ação direta sobre a via AMPK (Minokoshi et al., 2002; Yamauchi et al., 2002) quanto pela modulação da atividade nervosa simpática (Qi et al., 2004). Na obesidade, a inflamação e a resistência à insulina no tecido adiposo são promovidas pelos macrófagos residentes (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003; Arkan et al., 2005; Cancello e Clement, 2006; Lesniewski et al., 2007). Eles secretam mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α, IL-6 e MCP-1, os quais estão envolvidos no desenvolvimento da resistência à insulina em humanos e em camundongos obesos (Senn et al., 2002; Klover et al., 2005; Cancello e Clement, 2006; Kanda et al., 2006; Sell et al., 2007). Em ambos, os macrófagos infiltram no tecido adiposo na forma de monócitos circulantes em resposta ao aumento de MCP-1, produzindo proteinases que degradam a matriz extracelular necessária ao seu remodelamento, associado à hipertrofia do adipócito e a expansão do tecido adiposo (Huber et al., 2007). Os macrófagos também secretam mais TNF-α, IL-6 e MCP-1, gerando assim um ciclo vicioso (Strissel et al., 2007).

33 Figura 3. Tecido adiposo: células e adipocinas. A expansão do tecido adiposo durante o ganho de peso leva ao recrutamento de macrófagos através de vários sinais como o CCL2. Estes macrófagos se localizam principalmente ao redor dos adipócitos apoptóticos. Vários mediadores sintetizados pelos adipócitos e macrófagos residentes podem contribuir para a inflamação local e sistêmica. Abreviações: TNF, fator de necrose tumoral; IL-6, interleucina 6; CCL2, quimiocina CC ligante 2. Adaptado de Tilg e col (Tilg e Moschen, 2006). 33

34 Tecido Adiposo Visceral versus Subcutâneo Na obesidade moderada, a distribuição regional do tecido adiposo parece ser um indicador importante de alterações metabólicas e cardiovasculares, uma vez que uma correlação inconstante entre o índice de massa corporal e estes distúrbios tem sido encontrada (Mann, 1974; Keys, 1981; Kannel, 1985; Larsson, 1991). Ao longo das últimas duas décadas os estudos têm reenfatizado a hipótese postulada anteriormente por Vague em 1947 (Vague, 1947) de que a obesidade não é uma condição homogênea e que a distribuição regional do tecido adiposo é importante na compreensão da relação entre a obesidade e os distúrbios no metabolismo glicídico e lipídico (Bouchard et al., 1993). Muitos estudos prospectivos mostraram que o excesso de gordura na região superior do corpo (central ou abdominal) considerada por Vague como obesidade andróide ou masculina se correlaciona de forma mais frequente com o aumento da mortalidade e risco de doenças como o diabetes, hiperlipidemia, hipertensão arterial e aterosclerose das artérias coronárias, encefálicas e de vasos periféricos, quando comparada ao tipo ginecóide de distribuição da gordura (porção inferior do corpo ou glúteo-femoral ou depósito periférico) (Lapidus et al., 1984; Larsson et al., 1984; Ohlson et al., 1985; Ducimetiere et al., 1986; Donahue et al., 1987) (Fig. 4). Figura 4. Padrões de distribuição da gordura corporal na obesidade. Em (A) é mostrado o padrão de distribuição andróide ou masculino ou central, onde o acúmulo de gordura predomina na região superior do corpo, ao nível da linha da cintura. Em (B), padrão ginecóide ou feminino, com predomínio de acúmulo de gordura na região glúteo-femoral. Adaptado de Adams, risk_of_diabetes.increased_by_liver_disease.php

35 35 Foram realizados diversos estudos epidemiológicos na Suécia e nos Estados Unidos no início da década de 1980 utilizando a espessura da dobra cutânea, a circunferência abdominal e/ou relação cintura-quadril como marcadores substitutos ao índice de massa corporal para se avaliar a adiposidade corporal. Estes estudos confirmaram uma associação entre a obesidade abdominal (andróide ou central) e o risco de desenvolvimento de doença cardiovascular e diabetes (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000). Todavia, as medidas antropométricas não distinguem entre o acúmulo de gordura abdominal subcutânea e abdominal intra-abdominal. Assim, análises posteriores por tomografia computadorizada e ressonância magnética da região abdominal ao nível da quarta e quinta vértebras lombares revelaram o acúmulo de gordura visceral com sendo a característica crítica que distingue indivíduos metabolicamente saudáveis (mas obesos) de pessoas obesas com desordens metabólicas e de indivíduos metabolicamente obesos, mas com peso normal (Sims, 2001). Desde então, a obesidade visceral tem sido implicada como fator de risco independente para o desenvolvimento de resistência à insulina e intolerância à glicose, capaz de levar ao desenvolvimento de DM2 e de doenças cardiovasculares em diferentes grupos étnicos (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000). A gordura da porção superior do corpo (central) corresponde ao depósito visceral localizado na cavidade abdominal adicionado ao depósito de gordura subcutâneo localizado imediatamente abaixo da pele e sobre a musculatura abdominal na porção superior do abdome (Smith et al., 2001). A gordura visceral é representada pela gordura situada na região intra-abdominal, composta pelos omentos maior e menor e pelo tecido adiposo mesentérico. A gordura visceral contribui com cerca de 20% da gordura corporal total no homem e corresponde, porém, a apenas 6% na mulher prémenopausa (Ross et al., 1992). A gordura da porção inferior do corpo (ginecóide) é representada principalmente pelo tecido adiposo subcutâneo nas regiões glútea e femoral, que é metabolicamente menos ativa do que o tecido adiposo da porção superior do corpo. O depósito subcutâneo glúteo-femoral também pode proteger contra o desenvolvimento de distúrbios metabólicos (Frayn, 2002). Ambos os depósitos visceral e subcutâneo servem como repositores de energia de forma a manter o equilíbrio sistêmico do gasto e da ingestão energética. Entretanto,

36 36 eles possuem algumas diferenças constitutivas em termos de morfologia e fisiologia que são características do seu papel fisiológico primário (Kissebah e Krakower, 1994; Wajchenberg, 2000). Os adipócitos do depósito adiposo visceral possuem uma taxa de lipólise basal baixa, mas esta se torna muito alta quando estimulados por catecolaminas, comparado a células oriundas dos depósitos subcutâneos abdominal, glúteo e femoral. Isto se deve ao grande número de receptores β-adrenérgicos e ao baixo número de receptores α-adrenérgicos nos adipócitos da gordura visceral (Mauriege et al., 1987; Hellmer et al., 1992; Vikman et al., 1996). A gordura visceral também possui uma alta taxa de captação de ácidos graxos não esterificados e triacilglicerol (Marin et al., 1992; Jensen et al., 2003). No homem, por exemplo, o tecido adiposo omental capta aproximadamente 50% mais lipídios do que o tecido adiposo subcutâneo (Marin et al., 1992; Jensen et al., 2003). Em relação às citocinas inflamatórias, sua função varia de acordo com a localização anatômica do depósito de gordura de onde são provenientes. As citocinas secretadas pelo depósito visceral exercem um maior efeito sobre o metabolismo hepático de carboidratos e lipídios e estimulam a secreção de proteínas inflamatórias pelo fígado (Baumann e Gauldie, 1990; Fernandez-Real et al., 2001). Dessa forma, citocinas inflamatórias provenientes do tecido adiposo visceral induziriam resistência hepática à insulina e inflamação sistêmica crônica (Frayn, 2002; Ravussin e Smith, 2002). Por outro lado, as citocinas produzidas pelo depósito subcutâneo exercem um efeito maior sobre o desenvolvimento e a função da célula adiposa a nível local (Sopasakis et al., 2004), apesar de também exercerem efeitos sistêmicos sobre o músculo esquelético, por exemplo. Em relação à leptina e adiponectina, o nível de expressão e secreção de leptina é aproximadamente três vezes maior no tecido adiposo subcutâneo comparado ao visceral, e é proporcional a quantidade de triacilglicerol armazenada no adipócito (Tritos e Mantzoros, 1997) e, consequentemente, ao tamanho do adipócito (Hamilton et al., 1995; Montague et al., 1997; Wajchenberg, 2000). Em contraste, a gordura visceral secreta mais adiponectina do que a gordura subcutânea que, por sua vez, é mais sensível à ação da insulina e dos sensibilizadores de insulina (tiazolidinedionas) (Motoshima et al., 2002).

37 Doença Gordurosa Pancreática Não-Alcoólica Uma das consequências da obesidade é a infiltração de gordura em diversos órgãos incluindo o coração, rins, fígado e músculo esquelético (acúmulo ectópico de gordura). Sob estresse oxidativo, citocinas são liberadas pelo tecido adiposo levando a um processo inflamatório e a disfunção do órgão. No fígado, a infiltração de gordura tem sido denominada como doença gordurosa hepática não-alcoólica, a qual pode levar cronicamente a esteatohepatite não-alcoólica e cirrose (Wanless e Shiota, 2004; McCullough, 2006). Infelizmente, não existem dados relatando a influência da obesidade sobre o acúmulo de gordura no pâncreas ou produção de citocinas no mesmo e, assim, a doença gordurosa pancreática não-alcoólica até recentemente ainda não havia sido descrita (Mathur et al., 2007). Apesar da inexistência de uma descrição mais detalhada da doença gordurosa pancreática não-alcoólica, algumas evidências mostrando uma correlação entre a obesidade e o acúmulo de gordura no pâncreas têm sido relatadas há algum tempo na literatura. Em 1920, Schaefer relatou uma correlação entre o peso do pâncreas e a massa corporal no indivíduo adulto (Schaefer, 1926). Em 1933, Ogilvie e col. encontraram 9% de gordura pancreática em cadáveres magros comparado a 17% em cadáveres obesos (Ogilvie, 1933). Nas décadas de 1960 e 1970, a gordura no pâncreas foi correlacionada com a idade, obesidade e o DM2 (Walters, 1966). Estudos recentes com tomografia computadorizada e ressonância magnética também mostram uma correlação entre a gordura pancreática e a obesidade (Matsumoto et al., 1995; Kovanlikaya et al., 2005). A pancreatite aguda é uma das doenças que mais frequentemente acometem o pâncreas e sua patogênese ainda não é completamente compreendida. Entretanto, evidências mostram que há uma autodigestão da glândula causada por um evento desconhecido, que converte as enzimas digestivas inativas em sua forma ativa no interior do pâncreas, levando a ruptura da membrana celular, edema, hemorragia intersticial, necrose e ativação adicional de outras pró-enzimas, que podem levar a destruição total dos ácinos pancreáticos (Vasseur et al., 2004). Já foi observado em humanos que a gravidade da pancreatite é aumentada em pacientes obesos

38 38 comparado a indivíduos magros, sugerindo também uma correlação entre a pancreatite e a obesidade (Segersvard et al., 2001; Papachristou et al., 2006). Comparado a camundongos magros, camundongos obesos com deficiência de leptina possuem mais gordura pancreática intralobular e interlobular avaliada histologicamente (Mathur et al., 2007; Fraulob et al., 2010). Os camundongos obesos também apresentam mais TNF-α e IL-1β em seu pâncreas. Em um estudo comparando camundongos magros (C57BL/6J, leptina normal) com camundongos obesos ob/ob ou db/db (ob/ob, deficiente em leptina e db/db, excesso de leptina, mas não possui seu receptor), foi administrado salina ou ceruleína para indução de pancreatite edematosa (Zyromski et al., 2008). Os camundongos obesos apresentaram uma pancreatite grave (histologicamente), sendo que os camundongos obesos hiperleptinêmicos (db/db) apresentaram uma pancreatite mais grave do que os camundongos ob/ob. Complementando os dados acima, ratos obesos por ingestão de dieta hiperlipídica apresentam lipotoxicidade pancreática e maior peroxidação lipídica, associada a danos morfológicos semelhantes a pancreatite, assim como aumento da síntese de colágeno por células estreladas ativadas (Zhang et al., 2008). Assim, estes estudos sugerem que a doença gordurosa pancreática não-alcoólica pode levar a uma esteatopancreatite não-alcoólica. Entretanto, trabalhos adicionais são necessários para elucidar o papel fisiopatológico da obesidade nesta nova condição, uma vez que o pâncreas possui uma função vital na homeostase da glicose e no desenvolvimento do DM2 no indivíduo obeso. 2.6 Receptores Ativadores de Proliferação Peroxissomal Os receptores ativadores de proliferação peroxissomal (PPARs) são fatores de transcrição ativados por ligantes que pertencem à superfamília de receptores nucleares hormonais. O PPARα (NR1C1) (Committee, 1999) foi o primeiro a ser descrito como um receptor ativador de proliferação peroxissomal, daí seu nome (Issemann e Green, 1990). Dois isotipos relacionados, o PPARβ/δ (NR1C2) e o PPARγ (NR1C3) foram posteriormente encontrados e caracterizados (Dreyer et al., 1992). O

39 39 sequenciamento do genoma de mamíferos indicou que existem apenas três isotipos do PPAR, e cada um deles é codificado por um gene separado. Cada isotipo do PPAR possui um padrão de expressão tecidual característico (Kliewer et al., 1994; Braissant et al., 1996). O PPARα é altamente expresso em órgãos que desempenham um papel significante no catabolismo de ácidos graxos, como o tecido adiposo marrom, fígado, coração, rim e intestino (Mandard et al., 2004). Sua expressão também é detectada em muitas células vasculares como as células endoteliais, células musculares lisas, monócitos e macrófagos (Chinetti et al., 1998; Inoue et al., 1998; Staels et al., 1998; Diep et al., 2000). Entre os três isotipos, o PPARβ/δ é o que possui o mais amplo espectro de expressão. Funções importantes têm sido atribuídas ao PPARβ/δ na pele, intestino, placenta, músculo esquelético, tecido adiposo e encéfalo (Braissant et al., 1996; Bastie et al., 1999; Peters et al., 2000; Michalik et al., 2001; Barak et al., 2002), contudo seu nível de expressão é relativamente maior no encéfalo, tecido adiposo e pele (Braissant et al., 1996). O gene do PPARγ possui três promotores, permitindo a expressão de três isoformas, PPARγ1 e PPARγ2 e PPARγ3 (Fajas et al., 1997; Fajas et al., 1998). O RNAm do PPARγ1 e PPARγ3 originam a mesma proteína PPARγ1. Uma alta expressão do PPARγ2 é encontrada nos diferentes tecidos adiposos (Dreyer et al., 1992; Chawla et al., 1994; Tontonoz et al., 1994b), enquanto o PPARγ1 possui uma expressão mais ampla como, por exemplo, no intestino, encéfalo, células vasculares e tipos específicos de células imunes e inflamatórias (Tontonoz et al., 1994a; Zhu et al., 1995). O PPARγ3 é encontrado nos macrófagos, intestino grosso e tecido adiposo branco (Braissant et al., 1996; Fajas et al., 1998; Ricote et al., 1998a). Diferente dos receptores de hormônios esteróides que atuam como homodímeros, a regulação transcripcional pelo PPAR necessita da heterodimerização com o receptor X retinóico (RXR or NR2B), que pertence à mesma superfamília de receptores nucleares (Fig. 5) (Kliewer et al., 1992; Keller et al., 1993). O heretodímero PPAR/RXR pode se formar na ausência de um ligante. Quando ativado por um ligante, ele modula a transcrição através de sua ligação a uma sequência específica do DNA denominada elemento responsivo ao PPAR (PPRE) (Kliewer et al., 1992; Tugwood et al., 1992; Feige et al., 2005). O PPRE é composto de dois sítios que ocorrem como

40 40 repetições consenso da sequência AGGTCA, e entreposto a eles há um único nucleotídeo fazendo o espaçamento. Este elemento responsivo normalmente está presente em cópia única ou múltiplas cópias na região promotora de seus genes alvos, mas também pode estar localizado na região proximal de certos genes responsivos ao PPAR (Di-Poi et al., 2002). O PPAR e o RXR se ligam aos sítios 5 e 3 do PPRE, respectivamente, e a região 5 medeia a seletividade de ligação entre os diferentes isotipos do PPAR (DiRenzo et al., 1997; Ijpenberg et al., 1997; Juge-Aubry et al., 1997). O controle transcripcional pelos heterodímeros PPAR/RXR requer a interação com complexos coreguladores tanto um coativador para estimulação ou um corepressor para inibição da expressão de genes alvos (Dowell et al., 1999; Stanley et al., 2003; Guan et al., 2005; Yu et al., 2005). Figura 5. Ativação do PPAR e transcrição gênica. A ativação do receptor PPAR leva a sua acumulação no núcleo, onde ele forma um heretodímero com o RXR. O heterodímero PPAR/RXR se liga a sequência PPRE do DNA, induzindo a transcrição gênica dos diferentes isotipos do PPAR. Abreviações: PPAR, receptor ativador de proliferação peroxissomal; RA, ácido retinóico; RXR receptor X retinóico; PPRE, elemento responsivo ao PPAR. Adaptado de Bishop-Bailey e col (Bishop-Bailey, 2000).

41 41 Consistente com a sua distribuição em tecidos com altas taxas catabólicas de ácidos graxos e alta atividade peroxissomal, o principal papel do PPARα é a regulação da homeostase energética (Lefebvre et al., 2006). No fígado em especial, o PPARα ativa o catabolismo dos ácidos graxos, estimula a gliconeogênese, a síntese de corpos cetônicos, e está envolvido no controle da montagem das lipoproteínas (Staels et al., 1995; Vu-Dac et al., 1995; Kersten et al., 1999; Reddy e Hashimoto, 2001). O PPARα também estimula a síntese do heme e o catabolismo do colesterol. Adicionalmente, ele atenua a resposta inflamatória e participa do controle do metabolismo de aminoácidos e da síntese da uréia (Devchand et al., 1996; Staels et al., 1998; Kersten et al., 2001). O aumento da oxidação de ácidos graxos devido à ativação do PPARα diminui os níveis circulantes de triglicerídeos, a esteatose hepática e muscular e reduz a adiposidade, que leva a melhora da sensibilidade à insulina (Guerre-Millo et al., 2000; Chou et al., 2002; Kim et al., 2003). De forma não surpreendente, os medicamentos da classe dos fibratos p. ex., gemfibrozil, clofibrato, fenofibrato e bezafibrato que são amplamente utilizados no tratamento da hipertrigliceridemia são ativadores do PPARα. Os agonistas PPARα têm demonstrado também uma atividade antiinflamatória significativa, e isto parece estar relacionado às suas ações protetoras no sistema cardiovascular (Berger et al., 2005). Apesar de amplamente expresso nos tecidos do corpo, as funções do PPARβ/δ não são ainda completamente conhecidas. Hoje já se sabe que ele é necessário ao desenvolvimento normal da placenta e do intestino, e também está envolvido no controle da homeostase energética pela estimulação de genes envolvidos no catabolismo de ácidos graxos e na termogênese adaptativa (Wang et al., 2003; Nadra et al., 2006; Varnat et al., 2006). O PPARβ/δ também possui um papel importante no controle da proliferação, diferenciação e sobrevivência celular, assim como no reparo tecidual (Letavernier et al., 2005; Michalik e Wahli, 2006). O tratamento com o GW (agonista PPARβ/δ de alta afinidade) tem mostrado que a ativação do PPARβ/δ é capaz de aumentar o HDL colesterol (Leibowitz et al., 2000; Oliver et al., 2001), impede a progressão da lesão aterosclerótica em camundongos (Lee et al., 2003) e induz a perda de peso (Wang et al., 2003). Adicionalmente, os ligantes

42 42 PPARβ/δ têm sido propostos como potentes sensibilizadores de insulina, uma vez que eles melhoram a intolerância à glicose (Tanaka et al., 2003; Wang et al., 2004). O PPARγ é o protagonista na diferenciação do tecido adiposo e na manutenção das funções específicas do adipócito, como o armazenamento de lipídios no tecido adiposo branco e a dissipação de energia no tecido adiposo marrom (Tontonoz et al., 1993; He et al., 2003; Koutnikova et al., 2003). Além disso, ele é necessário à sobrevivência dos adipócitos diferenciados (Imai et al., 2004). Adicionalmente, o PPARγ está envolvido no metabolismo da glicose através da melhora da sensibilidade à insulina e assim representa uma ligação molecular entre o metabolismo de carboidratos e lipídios (Rosen et al., 1999; Rieusset et al., 2002; Savage et al., 2003). Da mesma forma que o PPARα, a ativação do PPARγ parece limitar a inflamação, adicionando um interesse em seu possível papel sobre a contenção da aterosclerose, além do diabetes (Ricote et al., 1998b). Entre os compostos sintéticos que ativam seletivamente o PPARγ estão as tiazolidinedionas, que são sensibilizadores de insulina utilizados para tratar a hiperglicemia no DM2 (Mayerson et al., 2002; Bajaj et al., 2003; Bays et al., 2004). 2.7 Modelos Experimentais de Doenças Metabólicas Modelos animais apropriados são cruciais no estudo da patogênese e terapia das doenças metabólicas, mas ainda não é claro que critério deve ser utilizado na definição do modelo animal ideal. Do ponto de vista científico e ético, a exigência mínima é a de que não apenas o fenótipo, mas também a patogênese da condição do animal se assemelhe à doença humana em estudo. Considerando a natureza poligênica da síndrome metabólica humana, os estudos com modelos de obesidade monogênica ou induzida farmacologicamente devem ser interpretados com cuidado, uma vez que na maioria das vezes é difícil definir o quanto um resultado é decorrente do fenótipo obesidade ou do modelo genético/farmacológico em questão (Buettner et al., 2007).

43 43 Como alternativa, os pesquisadores têm utilizado dietas ricas em lipídios, denominadas dietas hiperlipídicas (high-fat diets) (Oakes et al., 1997), com a finalidade de gerar modelos de obesidade em roedores. O primeiro relato de tal intervenção nutricional data da década de Estudos subsequentes mostraram que as dietas hiperlipídicas promovem hiperglicemia e resistência à insulina e, assim, diversos pesquisadores têm examinado seus efeitos sobre a fisiologia muscular esquelética e hepática, e sobre a sinalização da insulina. Baseado nesta experiência, o uso de dietas hiperlipídicas é geralmente bem aceito na geração de modelos válidos de síndrome metabólica humana em roedores que apresentam como fenótipo a resistência à insulina e uma função comprometida da célula β (Oakes et al., 1997; Ahren et al., 1999; Lingohr et al., 2002). Entretanto, há um problema importante relacionado à dieta hiperlipídica, que concerne à definição do termo hiperlipídica propriamente dito. Apesar das inúmeras publicações na base de artigos PubMed 2 usarem o termo high-fat diet, nem o conteúdo lipídico (quantidade), nem a composição lipídica (qualidade) das dietas é padronizado. A AIN-93 é um guia que determina a quantidade e a qualidade ideal de macro e micronutrientes na dieta de roedores de laboratório (Reeves et al., 1993). Segunda esta publicação, recomenda-se que a dieta padrão de manutenção de roedores (AIN-93M) contenha 9,5% de lipídios em sua composição energética (= 40 g/kg de ração), sendo sua fonte o óleo de soja. Porém, não existe uma recomendação para a elaboração de dietas hiperlipídicas, resultando em inúmeras variações na literatura, com dietas contendo 20%, 40% ou até 60% de sua energia derivada do lipídio, assim como dietas elaboradas com lipídios de origem animal (banha de porco, sebo) ou vegetal (milho ou palma). Isto leva inevitavelmente a resultados variáveis e conflitantes, de difícil comparação. Outro agravante é o de que a maioria das pesquisas em obesidade utiliza dietas com ingredientes purificados (mais correto), enquanto alguns estudos adicionam gordura à ração comercial. Isto pode levar a inadequações nutricionais, uma vez que quando a gordura é adicionada, outros nutrientes são diluídos (proteínas, vitaminas, minerais e fibras). A adição de uma quantidade excessiva de gordura pode na verdade gerar uma dieta deficiente em proteínas, que claramente não é a intenção ao se criar uma dieta hiperlipídica. 2 (

44 44 O efeito da dieta hiperlipídica sobre a massa corporal depende tanto da quantidade de lipídio quanto do tempo de ingestão da dieta. A maioria dos roedores se torna obeso quando alimentado com dietas com teor lipídico entre 30%-60%, mas a resposta na tolerância à glicose, resistência à insulina, triglicerídeos, etc, depende da linhagem, idade (Levin et al., 1997; Rossmeisl et al., 2003) e fonte do lipídio (Ikemoto et al., 1996; Buettner et al., 2006). Na Tabela 2 são apresentados alguns modelos de doenças metabólicas induzidos por dieta em roedores. Tomando como base o camundongo C57BL/6, o modelo mais indicado para o estudo do DM2 seria através da oferta de uma dieta hiperlipídica rica em sacarose (Surwit et al., 1988).

45 45 Tabela 2. Modelos de doenças metabólicas induzidas por dieta Tipo de dieta Linhagem Fenótipo Comentário Lipídio 30-60% SD, Wistar Obesidade Diferença aparente na massa corporal após 2-10 semanas de dieta. O tipo de lipídio influencia o ganho de massa corporal (Chang et al., 1990; Ghibaudi et al., 2002; Levin e Dunn-Meynell, 2006). Frutose 60% SD, Wistar Hipertensão, insulina, CT, TG, HDL, LDL Hipertensão se desenvolve após 6-8 semanas de dieta (Sanchez- Lozada et al., 2007; de Moura et al., 2008). Sacarose 60-70% SD, Wistar RI, TG Ambos ocorrem após 2 semanas de dieta (Pagliassotti et al., 1996; Pagliassotti et al., 2000). Lipídio 45-60% C57BL/6 Obesidade, diabetes, RI, CT Massa corporal aumenta já na 1ª semana; hiperglicemia ocorre após 4 semanas (Rossmeisl et al., 2003; Gallou-Kabani et al., 2007; Fraulob et al., 2010). Dieta hiperlipídica (ác. graxo saturado), 1% colesterol, 0,25% ácido cólico C57BL/6 Aterosclerose CT Hipercolesterolemia e aterosclerose moderada ocorrem após semanas de dieta (Nishina et al., 1990; Nishina et al., 1993). Lipídio 36%, Sacarose 37% C57BL/6 Obesidade, diabetes, RI O aumento da glicemia de jejum é mais pronunciado quando a sacarose é adicionada à dieta hiperlipíca (Surwit et al., 1988). A porcentagem indicada dos macronutrientes é calculada com base na energia total da dieta (em kcal). Abreviações: SD, rato Sprague Dawley; CT, colesterol total; TG, triglicerídeo; HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; RI, resistência à insulina (Gajda et al., 2007).

46 46 MATERIAIS E MÉTODOS O protocolo de manuseio e experimentação foi aprovado pelo Comitê local de Ética para Uso e Cuidado de Animais de Laboratório (Anexo 1). Este estudo foi realizado em acordo com o Guia para Uso e Cuidado de Animais Laboratoriais (US National Institutes of Health 85-23, revisada em 1996). 3.1 Obtenção da Amostra e Grupos Experimentais Neste estudo foram utilizados camundongos C57BL/6 machos com dois meses de idade, obtidos previamente da Universidade Federal de São Paulo (USP/CEDEME). Eles foram mantidos em condições controladas de umidade, temperatura, luz e exaustão (umidade 60±10%, 21±2 C, ciclo de 12 h claro/escuros e ciclo de exaustão de 15 min/h). Os animais foram agrupados conforme descrito abaixo: SC controle não diabético e sem sobrepeso, alimentado com dieta padrão para roedores (standard chow) por 6 semanas (n=10); HFHS controle diabético e com sobrepeso, alimentado com dieta rica em lipídios e sacarose (high-fat high-sucrose diet) por 6 semanas (n=40). Passadas 6 semanas, os animais do grupo HFHS foram subdivididos conforme o tratamento, que durou 5 semanas, sem interrupção da dieta: HFHS dieta HFHS, sem tratamento (n=10); HFHS-Ro dieta HFHS + rosiglitazona (0,01% na ração) (n=10); HFHS-Fe dieta HFHS + fenofibrato (0,18% na ração) (n=10); HFHS-Bz dieta HFHS + bezafibrato (0,4% na ração) (n=10).

47 47 O experimento totalizou 11 semanas. Os medicamentos foram administrados na ração. As dietas foram elaboradas com nutrientes purificados pela empresa Rhoster (Rhoster, Ribeirão Preto, SP, Brasil, em acordo com as recomendações da AIN93M (Reeves et al., 1993). Suas formulações encontram-se descritas na Tabela 3: Tabela 3. Composição das dietas. SC HFHS Ingredientes (g/kg) Caseína 140,0 160,0 Amido de milho 620,7 220,7 Sacarose 100,0 300,0 Fibras 50,0 50,0 Óleo de soja 40,0 40,0 Banha - 180,0 Mix de vitaminas* 10,0 10,0 Mix de minerais** 35,0 35,0 Colina 2,5 2,5 Antioxidante 0,008 0,008 Energia kcal/g 3,81 4,71 Proteína, % 14,9 13,7 Lipídio, % 9,4 42,0 Carboidrato, % 75,7 44,2 * Vitaminas presentes no mix estão em acordo com a AIN-93M. ** Minerais presentes no mix estão em acordo com a AIN-93M. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta hiperlipídica rica em sacarose.

48 Ingestão de Ração, Água, Energia e Eficiência Alimentar A livre ingestão de ração e água foi permitida aos animais. Ao longo do experimento, a massa corporal foi aferida semanalmente e a ingestão de água e ração diariamente. A ingestão de ração (g/dia) foi multiplicada pela energia da ração (Kcal/g) para se obter a ingestão de energia diária por camundongo. A eficiência alimentar foi calculada como [(ganho de massa corporal/kcal ingerida) x 100]. Todos estes parâmetros foram calculados para o período pré-tratamento (semana 0 a 6) e pós-tratamento (semana 6 a 11). O cálculo da dose diária de medicamento ingerido foi feito com base na ingestão diária de ração e na massa corporal, correspondendo a 9,4±0,09 mg/kg/dia para a rosiglitazona, 163,0±3.0 mg/kg/dia para o fenofibrato e 382,0±7,0 mg/kg/dia para o bezafibrato. 3.3 Metabolismo Glicídico e Lipídico e Função Pancreática Na semana 6, sangue foi coletado após 6 horas de jejum através da veia submandibular para análise dos níveis séricos de glicose (glicômetro, Accu-Chek Go, Roche, São Paulo, SP, Brasil) e insulina (insulin ImmuChem coated tube radioimmunoassay kit, MP Biomedicals, Califórnia, USA). Na semana 10 foi realizado teste oral de tolerância à glicose (TOTG), onde glicose a 25% diluída em salina estéril (0,9% NaCl) foi administrada através de gavagem orogástrica após jejum de 6 horas (dose de 1g/kg de massa corporal). Sangue foi coletado através de uma incisão na ponta da cauda do animal para dosagem da glicose plasmática antes da gavagem e após 15, 30 e 60 minutos. A área sob a curva (ASC) foi calculada usando a regra do trapézio para analisar a intolerância à glicose. Na eutanásia (semana 11), sangue foi novamente coletado (punção cardíaca pelo átrio direito) após 6 horas de jejum para análise da glicose (glicômetro) e insulina

49 49 (radioimunoensaio) de jejum. Os lipídios séricos (triglicerídeos, colesterol total e HDL colesterol), amilase e lipase também foram analisados, através de ensaio colorimétrico (Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brasil). O LDL colesterol foi calculado através da equação de Friedwald, LDL = [CT - HDL - (TG/5)], onde CT representa o colesterol total e TG o triglicerídeo (Friedwald et al., 1972). A resistência à insulina foi avaliada pelo HOMA-IR (homeostasis model assessment index) onde: HOMA-IR = [insulina (µu/ml) x glicose (mmol/l)] / 22,5 (Matthews et al., 1985). 3.4 Hipertrofia Cardíaca Para a análise da hipertrofia cardíaca o coração foi removido no momento da eutanásia, pesado e seu peso foi corrigido pelo comprimento da tíbia (côndilo ao maléolo medial) a fim de se remover o efeito do tamanho do animal sobre este parâmetro (Yin et al., 1982). 3.5 Morfometria do Tecido Adiposo Foram utilizadas as gorduras epididimal, retroperitoneal e inguinal para analisar a morfologia dos adipócitos. A gordura subcutânea localizada entre a porção inferior da caixa torácica e a porção mediana da coxa foi considerada como gordura inguinal (Surwit et al., 1995). A gordura conectada a parede abdominal posterior, ao redor dos rins e na parte abdominal do ureter foi considerada gordura retroperitoneal. A gordura abdominal localizada na porção inferior do abdome conectada ao epidídimo foi considerada como gordura epididimal. A relação entre a gordura visceral e a subcutânea foi calculada como: Sub:Vis = [gordura inguinal] / [gordura epididimal + retroperitoneal]. Após pesadas, as gorduras foram fixadas em formalina 4%, incluídas em Paraplast plus (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), seccionadas em 5 µm de espessura e

50 50 coradas com hematoxilina e eosina. Foram obtidas imagens digitais dos cortes histológicos, e aproximadamente 250 adipócitos por grupo tiveram seu diâmetro aferido usando o software Image-Pro Plus versão 5.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, USA) (Fig. 6). Figura 6. Morfometria do adipócito. No software Image-Pro Plus, uma imagem digital do tecido adiposo foi adquirida e duas medidas de diâmetro por adipócito foram realizadas, para o cálculo do diâmetro médio. No quadro à direita estão os valores dos diâmetros mensurados.

51 Morfometria e Estereologia do Pâncreas O pâncreas foi pesado logo após ser retirado do corpo do animal, fixado em formalina 4% por 24h e então seguiu a rotina de processamento histológico do laboratório para inclusão em Paraplast plus (Sigma Co., St. Louis, MO, USA). O tecido incluído foi seccionado em cortes histológicos não consecutivos de 5 μm de espessura, e posteriormente corado em hematoxilina e eosina. Imagens digitais do tecido pancreático foram adquiridas utilizando o software Image-Pro Plus versão 5.0 (Media Cybernetcs, Silver Spring, MD, USA). O maior e o menor diâmetro de cada ilhota foram mensurados a fim de se calcular o diâmetro médio da ilhota. Pelo menos 25 ilhotas foram analisadas por camundongo, totalizando 125 ilhotas por grupo. A densidade de gordura no pâncreas (interlobular + intralobular + perilobular) foi calculada através da análise estereológica por contagem de pontos. Uma imagem do tecido pancreático em pequeno aumento foi projetada em um monitor Sony (Sony Triniton, Pencoed, UK) acoplado ao microscópio Leica (Leica DMRBE, Wetzlar, Germany) através de uma videocâmera (Kappa, Gleichen, Germany), e um sistema teste contendo 36 pontos foi sobreposto a imagem do tecido (Fig. 7). Os pontos que tocavam as células adiposas foram considerados. A densidade de volume de gordura pancreática foi calculada como Vv[gord] = Pp/PT, onde Pp representa os pontos que tocavam as células adiposas e PT representa o número total de pontos do sistema teste (Mandarim-de-Lacerda, 2003).

52 Figura 7. Quantificação da densidade de volume de gordura pancreática. Este parâmetro foi calculado a partir da relação entre os pontos (representado pelo centro de cada cruz) que tocam as células adiposas e o número total de pontos do sistema teste. 52

53 Imunohistoquímica do Tecido Adiposo e Pâncreas Os tecidos adiposo e pancreático utilizados na imunohistoquímica passaram pelo mesmo processamento histológico utilizado na análise morfométrica e estereológica. As lâminas foram tratadas com xilol e posteriormente com álcool etílico em concentrações decrescentes e água destilada. A recuperação antigênica foi feita em tampão citrato ph 6,0 a 60 C. A peroxidase endógena foi inibida com peróxido de hidrogênio 3% e as ligações não específicas foram inibidas com PBS/BSA 5%. Os cortes foram incubados com os anticorpos descritos a seguir: Tecido adiposo: anti-adiponectina (A6354, Sigma) Pâncreas: anti-insulina (A0564, DAKO), anti-glucacon (A0565, DAKO), anti-glut2 (AB1342, Chemicon), anti-pparα (sc-9000, Santa Cruz Biotechnology) e anti- PPARβ/δ (sc-1987, Santa Cruz Biotechnology). A ligação do anticorpo primário foi amplificada pelo sistema avidinaestreptavidina (K0679; Universal DakoCytomation LSAB + Kit, Peroxidase), e a reação foi visualizada após incubação com 3,3 diaminobenzidina tetraclorido (DAB, K3466, DakoCytomation). Os cortes foram então contracorados com hematoxilina de Mayer, banhados em água destilada, desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico, banhados em xilol e, finalmente, as lamínulas foram sobrepostas à lâmina usando Enthelan. No tecido adiposo, a quantificação da imunocoloração para adiponectina foi classificada usando um sistema de escore semi-quantitativo: 0, sem expressão; +, expressão fraca; ++ expressão moderada; +++ expressão forte. No pâncreas, imagens digitais das ilhotas imunocoradas foram obtidas usando o mesmo equipamento utilizado para a análise morfométrica. Uma ferramenta de seleção foi utilizada para identificar as áreas da ilhota com coloração imunopositiva (Fig. 8). Esta seleção foi segmentada em uma nova imagem digital em preto e branco, sem tons intermediários, onde a cor branca representava as áreas imunopositivas e a cor preta representava o restante do tecido pancreático. O limite externo da ilhota foi delimitado usando a ferramenta AOI irregular, e no interior desta área delimitada, a

54 54 área ocupada pela cor branca foi quantificada usando a ferramenta de histograma da imagem. Esta área foi expressa na forma de densidade de coloração por ilhota (%) (Mandarim-de-Lacerda et al., 2010). Figura 8. Quantificação da imunocoloração nas ilhotas pancreáticas. Em (a), ilhota pancreática corada com anticorpo anti-insulina (em marrom). Em (b), segmentação da imagem a em uma nova imagem em preto e branco, onde a cor branca representa a imunocoloração para insulina e a cor preta o restante do tecido. A área que representa a ilhota é delimitada (linha verde) e, assim, a quantidade de cor branca é quantificada pelo histograma da imagem e expressa como percentagem da área total da ilhota.

55 Análise Estatística Os dados são apresentados na forma de média ± erro padrão da média (EPM). Um n=10 por grupo foi mantido ao longo do experimento, entretanto apenas um n=5 foi utilizado para cada parâmetro analisado. Os dados foram testados em relação a normalidade e a homocedasticidade das variâncias. As diferenças entre os grupos estudados foram analisadas através de análise de variância seguida de pós-teste de Tukey. As diferenças para um mesmo grupo, em momentos diferentes (prétratamento versus pós-tratamento), foram testadas usando teste t-pareado. A correlação e regressão linear foram calculadas para o diâmetro do adipócito versus o HOMA-IR e a área sob a curva do TOTG (Statistica version 7, Statsoft, Tulsa, OK, USA). Um P menor do que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

56 56 RESULTADOS 4.1 Ingestão de Ração, Energia e Água e Eficiência Alimentar Até a semana 6, o grupo HFHS ingeriu 10% a menos de ração do que o grupo SC, porém a ingestão energética foi maior (+10%, P<0,0001), sem diferença na ingestão hídrica (Tabela 4). Os grupos HFHS-Fe e HFHS-Bz ingeriram a mesma quantidade de ração do grupo HFHS, porém o tratamento com a rosiglitazona resultou em hiperfagia (+15% comparado ao grupo HFHS, P<0,0001). A eficiência alimentar dos animais alimentados com dieta HFHS foi maior do que no grupo SC no período pré-tratamento (aproximadamente +116%, P<0,01) (Fig. 9). Este comportamento se manteve no grupo HFHS sem tratamento no período póstratamento. A eficiência alimentar no grupo HFHS-Ro foi exacerbada pelo medicamento (+494% e +94%, respectivamente, comparado aos grupos SC e HFHS, P<0,001). Ambos os fibratos diminuíram a eficiência energética, de forma a torná-la negativa. No período pós-tratamento houve aumento da ingestão hídrica pelo grupo HFHS comparado ao SC (+14%, P<0,05), a qual foi diminuída pela administração de rosiglitazona (-10% comparado ao grupo HFHS, P<0,05) (Tabela 4). Não foi observada diarréia ou qualquer alteração física nos animais.

57 57 Tabela 4. Ingestão de Ração, Energia e Água Ração (g/dia/animal) Energia (Kcal/dia/animal) Água (ml/dia/animal) Pré-tratamento SC 3,0±0,04 11,5±0,2 4,5±0,2 HFHS 2,7±0,02 a 12,7±0,1 a 4,5±0,1 Pós-tratamento SC 2,7±0,03 a 10,5±0,1 ab 3,5±0,1 ab HFHS 2,7±0,05 a 12,7±0,3 *a 4,0±0,1 *b HFHS-Ro 3,1±0,03 * b 14,5±0,2 * ab 3,6±0,1 ab HFHS-Fe 2,7±0,05 a 12,6±0,2 * a 4,1±0,1 * HFHS-Bz 2,6±0,05 a 12,2±0,3 * 4,3±0,1 * Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. Grupos: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (a) SC e (b) HFHS, no período pré-tratamento; (*) SC, ( ) HFHS e ( ) HFHS-Ro, no período pós-tratamento, P<0,05.

58 58 Figura 9. Eficiência alimentar dos diferentes grupos experimentais, nos períodos pré-tratamento e póstratamento. Grupos: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (a) mesmo grupo, no período pré-tratamento; (*) SC, ( ) HFHS e ( ) HFHS-Ro, no período pós-tratamento, P<0, Massa Corporal Os animais iniciaram o experimento sem diferenças na massa corporal (22,2 g ± 0,2 g aos 2 meses de idade) (Fig. 10). A dieta HFHS induziu ganho de massa corporal, onde na semana 6 os animais apresentaram massa corporal 17% maior do que o grupo SC (P<0,0001). A massa corporal do grupo HFHS sem tratamento continuou aumentando até o fim do experimento, alcançando 34,3 g ± 1,0 g. A administração de rosiglitazona exacerbou o ganho de massa corporal (+49% e +17% comparado aos grupos SC e HFHS, respectivamente, P<0,01). O fenofibrato impediu a evolução do ganho de massa corporal e o bezafibrato induziu perda de massa (-9% comparado à massa corporal do mesmo grupo na semana 6, P<0,01).

59 Figura 10. Evolução da massa corporal ao longo do experimento. As dietas foram administradas por 11 semanas e os medicamentos da 6ª à 11ª semana. Grupos: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS- Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS, ( ) HFHS-Ro e ( ) HFHS-Fe, P<0,05. 59

60 Lipídios séricos O colesterol total e o HDL colesterol apresentaram-se elevados após 11 semanas de ingestão da dieta HFHS, comparado aos animais que receberam dieta padrão (+46% for CT, P<0,001 e +22% for HDL, P<0,05) (Tabela 5). O colesterol total foi menor nos grupos HFHS-Ro e HFHS-Bz comparado ao grupo HFHS (-12%, P<0,05 e -14%, P<0,05, respectivamente). Os três tratamentos reduziram o HDL colesterol, sendo o bezafibrato o mais eficiente (-45%, P<0,0001). A dieta HFHS não alterou os níveis de triglicerídeos, porém o tratamento com os fibratos reduziu este parâmetro, comparado aos grupos SC e HFHS (P<0,05). O LDL colesterol foi aumentado pela dieta HFHS (+93%, P<0,001), porém o tratamento com rosiglitazona o manteve similar ao grupo SC, enquanto os fibratos aumentaram o LDL, quando comparado tanto ao grupo SC quanto ao grupo HFHS (P<0,0001). 4.4 Insulina e Glicose séricos A ingestão da dieta HFHS levou ao aumento da glicemia de jejum em cerca de 32% comparado ao grupo SC (P<0,0001) (Tabela 5). Esta diferença foi observada durante todo o experimento. A rosiglitazona impediu o aumento da glicemia de jejum, enquanto o bezafibrato teve efeito hipoglicemiante, uma vez que o grupo HFHS-Bz apresentou glicemia de jejum inferior a glicemia apresentada pelo grupo HFHS na semana 6 (-18%, P<0,001). Não houve melhora da glicemia de jejum pelo fenofibrato. No teste oral de tolerância à glicose, a área sob a curva foi maior no grupo HFHS comparado ao SC (+30%, P<0,0001), indicando intolerância à glicose nesses animais. Os animais que receberam rosiglitazona ou bezafibrato apresentaram redução da área sob a curva, comparado aos animais HFHS não tratados (P<0,01) (Fig. 11). O fenofibrato não alterou de forma significativa a área sob a curva no grupo HFHS-Fe, a qual se apresentou semelhante ao grupo HFHS.

61 61 A insulina de jejum aumentou após a ingestão da dieta HFHS (+57% na semana 6, P<0,05, e +138% na semana 11 comparado ao grupo SC, P<0,001) (Tabela 5). Todos os medicamentos impediram a elevação dos níveis de insulina quando comparados ao grupo HFHS (-32% para a rosiglitazona, P<0,001; -58% para o fenofibrato, P<0,0001; e -63% para o bezafibrato). Ao final do experimento, a insulina de jejum nos animais que receberam fenofibrato ou bezafibrato foi semelhante à do grupo SC. A resistência à insulina foi vista nos animais HFHS não tratados nas semanas 6 e 11, comparado ao grupo SC, acessado através do HOMA-IR (+97% e +201%, respectivamente, P<0,0001) (Tabela 5). Todos os medicamentos impediram o desenvolvimento da resistência à insulina. A amilase e lipase séricas não diferiram de forma significativa entre os grupos estudados (Tabela 5).

62 62 Tabela 5. Metabolismo Lipídico e Glicídico e Função Pancreática. SC HFHS HFHS-Ro HFHS-Fe HFHS-Bz Pré-tratamento Glicose, mmol/l 7,5±0,3 9,9±0,2 a Insulina, ng/dl 0,7±0,07 1,1±0,12 a HOMA-IR 5,9±0,3 11,6±1,0 a Pós-tratamento Glicose, mmol/l 9,1±0,3 a 12,1±0,7 *b 9,2±0,4 10,5±0,7 a 8,1±0,3 b Insulina, ng/dl 0,8±0,11 1,9±0,13 *b 1,3±0,11 * a 0,8±0,05 0,7±0,06 HOMA-IR 9,2±0,6 27,7±2,4 *ab 12,9±1,4 a 9,9±1,1 6,7±0,6 Triglicerídeos, mg/dl 147±11 156±12 122±10 108±4 * 110±7 * Colesterol total, mg/dl 136±4 199±5 * 176±5 * 192±3 * 172±9 * HDL, mg/dl 68±5 83±2 * 68±4 55±3 46±2 * Amilase, U/L 666±25 654±18 697±6 661±17 656±4 Lipase, U/L 608±8 628±2 613±15 595±15 625±27 Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato; HOMA-IR, índice de resistência à insulina e; HDL, lipoproteína de alta densidade. Os símbolos representam diferença estatística com: (a) SC e (b) HFHS, no período pré-tratamento; (*) SC, ( ) HFHS, ( ) HFHS-Ro e ( ) HFHS-Fe, no período póstratamento, P<0,05.

63 Figura 11. Teste oral de tolerância à glicose. As curvas glicêmicas de resposta à sobrecarga de glicose são mostradas em (A) e as áreas sob as curvas são mostradas em (B). Grupos: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS, ( ) HFHS-Ro e ( ) HFHS-Fe, P<0,05. 63

64 Coração A dieta HFHS não induziu hipertrofia cardíaca (Fig. 12). Entretanto, a relação coração:tíbia foi 43% maior no grupo HFHS-Ro comparado ao grupo SC (P<0,0001), indicando hipertrofia cardíaca. Os fibratos não apresentaram ação sobre este parâmetro. Figura 12. Hipertrofia cardíaca. Relação entre o peso do coração e o comprimento da tíbia nos diferentes grupos experimentais. Grupos: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS e ( ) HFHS-Ro, P<0,05.

65 Gorduras Viscerais e Subcutânea e Diâmetro do Adipócito Houve aumento da massa das gorduras epididimal (+176%), retroperitoneal (+211%) e inguinal (+219%) nos animais HFHS não tratados comparado ao grupo SC (P<0,001) (Tabela 6). As gorduras epididimal e inguinal se apresentaram, respectivamente, 33% (P<0,05) e 75% (P<0,0001) maior no grupo HFHS-Ro comparado aos animais HFHS não tratados. Já nos grupos HFHS-Fe e HFHS-Bz elas apresentaram massa similar à do grupo SC. Apenas a rosiglitazona teve ação sobre a relação gordura Sub:Vis (+54% comparado ao grupo SC, P<0,001). A administração da dieta HFHS induziu a hipertrofia dos adipócitos das gorduras epididimal (+26%, P<0,001), retroperitoneal (+58%, P<0,0001) e inguinal (+54%, P<0,001) (Tabela 6 e Fig. 13). O tamanho do diâmetro dos adipócitos no grupo HFHS- Ro foi similar aos animais do grupo HFHS, enquanto os fibratos apresentaram adipócitos de tamanho similar ao grupo SC.

66 66 Tabela 6. Gorduras Viscerais e Subcutânea e Diâmetro do Adipócito SC HFHS HFHS-Ro HFHS-Fe HFHS-Bz Gordura, g Epididimal 0,49±0,04 1,35±0,13 * 1,80±0,19 * 0,52±0,04 0,61±0,05 Retroperitoneal 0,18±0,03 0,56±0,04 * 0,60±0,05 * 0,17±0,02 0,16±0,01 Inguinal 0,37±0,05 1,18±0,12 * 2,07±0,29 * 0,46±0,04 0,50±0,04 Sub:Vis 0,50±0,03 0,63±0,03 0,77±0,07 * 0,66±0,05 0,65±0,03 Adipócito, µm Epididimal 61,9±3,5 77,7±2,1 * 82,5±3,8 * 59,4±2,6 54,9±2,2 Retroperitoneal 59,8±4,7 94,4±3,8 * 89,2±1,7 * 60,6±2,0 56,8±2,9 Inguinal 43,1±3,5 66,4±4,3 * 62,6±3,4 * 47,4±3,9 48,3±1,4 Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato; Sub, gordura subcutânea e; Vis, gordura visceral. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS e ( ) HFHS-Ro, P<0,05.

67 Figura 13. Adipócitos na gordura retroperitoneal. Grupos: (a) dieta padrão, SC; (b) dieta rica em lipídios e sacarose, HFHS; (c) HFHS tratado com rosiglitazona; (d) HFHS tratado com fenofibrato e; (e) HFHS tratado com bezafibrato. Observe os adipócitos hipertrofiados em (b) e (c) e adipócitos com morfologia similar ao grupo SC em (d) e (e). 67

68 68 A correlação entre o diâmetro do adipócito e a glicemia e insulina de jejum, intolerância à glicose (ASC do TOTG) e resistência à insulina (HOMA-IR) é mostrada na Tabela 7. A glicemia de jejum não apresentou correlação com o diâmetro do adipócito. A insulina de jejum apresentou correlação com o diâmetro do adipócito em todos os depósitos de gordura, sendo esta correlação mais forte com os adipócitos da gordura retroperitoneal. A intolerância à glicose apresentou fraca correlação com o diâmetro do adipócito para todos os depósitos de gordura, enquanto a resistência à insulina apresentou maior correlação com o diâmetro dos adipócitos da gordura retroperitoneal (Figura 14).

69 69 Tabela 7. Regressão linear e correlação entre o diâmetro do adipócito de diferentes depósitos de gordura e parâmetros do metabolismo glicídico Slope Interseção em Y r P Glicose G. inguinal 0,8 ± 1,1 46 ± 11 0,15 NS G. epididimal 1,3 ± 1,2 54 ± 11 0,23 NS G. retroperitoneal 2,9 ± 1,6 44 ± 16 0,35 NS Insulina G. inguinal 15,3 ± 3,9 37 ± 5 0,64 <0,0001 G. epididimal 17,2 ± 4,1 48 ± 5 0,66 <0,0001 G. retroperitoneal 29,4 ± 4,6 40 ± 6 0,81 <0,0001 ASC do TOTG G. inguinal 0,05 ± 0,02 17 ± 14 0,50 <0,05 G. epididimal 0,06 ± 0,02 27 ± 15 0,51 <0,05 G. retroperitoneal 0,10 ± 0,03 6 ± 19 0,60 <0,01 HOMA-IR G. inguinal 0,77 ± 0,25 44 ± 4 0,53 <0,001 G. epididimal 0,84 ± 0,28 56 ± 4 0,53 <0,001 G. retroperitoneal 1,60 ± 0,31 51 ± 5 0,73 <0,00001 Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. O slope representa o coeficiente angular da reta de regressão linear. Abreviações: r, coeficiente de correlação de Pearson; P, significância do coeficiente de correlação; NS, sem significância estatística; ASC, área sob a curva e; TOTG, teste de tolerância oral à glicose.

70 Figura 14. Regressão linear e correlação de Pearson entre o diâmetro do adipócito da gordura retroperitoneal e a resistência à insulina (avaliada pelo HOMA-IR). Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. 70

71 Expressão de Adiponectina no Tecido Adiposo A ingestão da dieta HFHS resultou na diminuição da imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo inguinal e retroperitoneal, quando comparado à dieta controle SC (Tabela 8 e Fig. 15). Na gordura inguinal, todos os tratamentos mantiveram a imunocoloração para adiponectina semelhante ao grupo SC, enquanto na gordura retroperitoneal a rosiglitazona apresentou imunocoloração mais forte quando comparada aos fibratos. Tabela 8. Quantificação da imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo (sistema semiquantitativo por escore) Grupos SC HFHS HFHS-Ro HFHS-Fe HFHS-Bz G. inguinal G. retroperitoneal Escores: (+) expressão fraca; (++), expressão moderada; (+++) expressa forte. Abreviações: G., gordura; SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato.

72 Figura 15. Imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo retroperitoneal (em marrom). (a) dieta padrão, SC; (b) dieta rica em lipídios e sacarose, HFHS; (c) HFHS tratado com rosiglitazona; (d), HFHS tratado com fenofibrato; (e) HFHS tratado com bezafibrato e; (f) controle negativo da reação. Comparado ao grupo SC (a), a imunocoloração para adiponectina está diminuída no grupo HFHS (b). Os grupos tratados (c, d, e) apresentaram imunocoloração mais forte do que o grupo HFHS (b). Entre os tratados, a rosiglitazona apresentou a maior intensidade de imunocoloração (c). 72

73 Massa do Pâncreas, Gordura pancreática e Ilhotas pancreáticas Os achados mais relevantes no que concerne a morfologia pancreática estão ilustrados na Fig. 16. O grupo HFHS não tratado apresentou aumento da massa pancreática (+28% comparado ao grupo SC, P<0,05) (Tabela 9), e esta alteração foi prevenida pelo tratamento com ambos os fibratos (-24% no HFHS-Fe, P<0,05 e -41% no HFHS-Bz, P<0,001, comparado ao grupo HFHS), mas não pela rosiglitazona. O diâmetro da ilhota aumentou após a ingestão da dieta HFHS (+38%, P<0,001), indicando hipertrofia da ilhota. Entre os medicamentos, apenas o bezafibrato inibiu este processo. Os ácinos nos grupos HFHS não tratado e HFHS-Fe apresentaram certo grau de degeneração (necrose da célula acinar) e infiltrado de células inflamatórias (Fig. 16). A dieta HFHS induziu o acúmulo de gordura no pâncreas nos espaços interlobular, intralobular e perilobular (+700% de gordura no grupo HFHS comparado ao grupo SC, P<0,001). A rosiglitazona exacerbou o acúmulo de gordura no pâncreas (+75% comparado ao HFHS, P<0,05), enquanto os fibratos não tiveram ação sobre este parâmetro.

74 74 Tabela 9. Massa Pancreática, Diâmetro da Ilhota e Gordura Pancreática Parâmetros Grupos SC HFHS HFHS-Ro HFHS-Fe HFHS-Bz Pâncreas, mg 246±17 315±13 * 271±17 240±12 187±18 Ilhota, μm 102±4 141±5 * 145±5 * 123±5 * 109±3 Gordura, % 0,2±0,1 1,6±0,4 * 2,8±0,2 * 1,2±0,3 1,0±0,2 Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS e ( ) HFHS-Ro, P<0,05.

75 Figura 16. Fotomicrografias do tecido pancreático mostrando os achados mais frequentes. (A) SC, tecido pancreático normal; (B) HFHS, alguns adipócitos podem ser vistos no pâncreas exócrino e ao redor dos vasos de grande calibre; (C) HFHS-Ro, grande infiltrado de adipócitos entre os lóbulos pancreáticos (interlobular) e no tecido exócrino (intralobular); (D) HFHS-Ro, adipócitos eram comumente encontrados no pâncreas exócrino; (E) SC, tecido pancreático normal; (F) HFHS, infiltrado inflamatório (setas cheia); (G) HFHS, início de degeneração acinar (seta vazia) e; (H) HFHS-Fe, grau avançado de degeneração acinar e deposição de matriz extracelular (seta vazia). Os cortes foram corados em HeE. As barras de calibração em (A) correspondem às figuras A-D e a barra em (B) corresponde às figuras E-H. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona e; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato.. 75

76 Expressão de Insulina, Glucagon, GLUT2, PPARα e PPARβ/δ nas Ilhotas Pancreáticas As ilhotas dos animais do grupo HFHS apresentaram densidade aumentada de imunocoloração para insulina (+134%, P<0,0001) e densidade diminuída de imunocoloração para o glucagon e GLUT2 (-60%, P<0,001 e -39%, P<0,05, respectivamente), quando comparado ao grupo SC (Tabela 10 e Fig. 17). A densidade de imunocoloração para o GLUT2 foi mantida nos níveis do grupo SC após o tratamento com a rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato. No grupo HFHS-Bz, a densidade de imunocoloração para insulina se manteve maior do que a do grupo SC (+85%, P<0,001), enquanto os grupos HFHS-Ro e HFHS-Fe não apresentaram diferenças com o mesmo. Apenas a rosiglitazona foi capaz de manter a densidade de imunocoloração para o glucagon semelhante ao grupo SC (+127% no grupo HFHS-Ro comparado ao grupo HFHS, P<0,001). A densidade de imunocoloração para o PPARα e PPARβ/δ não foi afetada pela dieta ou tratamento, com exceção do bezafibrato, que aumento a densidade de imunocoloração para o PPARβ/δ nas ilhotas pancreáticas dos animais do grupo HFHS-Bz (+56% quando comparado ao grupo SC, P<0,01).

77 Figura 17. Fotomicrografias de ilhotas pancreáticas imunocoradas com diferentes anticorpos. Cada coluna representa um grupo de estudo, e cada linha um anticorpo. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. 77

78 78 Tabela 10. Quantificação da Densidade de Imunocoloração nas Ilhotas Pancreáticas Parâmetro Grupos SC HFHS HFHS-Ro HFHS-Fe HFHS-Bz Densidade/ilhota, % Insulina 8,5±1,0 19,9±1,2 * 7,5±0,8 10,1±0,8 15,7±1,5 * Glucagon 6,5±0,8 2,6±0,4 * 5,9±0,7 3,3±0,4 * 3,7±0,6 * GLUT2 7,6±0,5 4,6±0,4 * 7,6±0,7 8,0±0,6 9,8±0,9 PPARα 10,2±1,4 9,3±0,9 9,6±1,4 11,4±1,3 9,8±0,7 PPARβ/δ 19,7±2,1 27,3±2,3 27,1±1,8 25,1±1,8 30,7±2,0 * Os dados são apresentados na forma de média ± EPM. Abreviações: SC, dieta padrão; HFHS, dieta rica em lipídios e sacarose; HFHS-Ro, HFHS tratado com rosiglitazona; HFHS-Fe, HFHS tratado com fenofibrato e; HFHS-Bz, HFHS tratado com bezafibrato. Os símbolos representam diferença estatística com: (*) SC, ( ) HFHS, ( ) HFHS-Ro e ( ) HFHS-Bz, P<0,05.

79 79 DISCUSSÃO As principais alterações induzidas pela ingestão da dieta HFHS em camundongos C57BL/6 no presente estudo foram: hiperglicemia, intolerância à glicose, hiperinsulinemia, resistência à insulina, hipercolesterolemia, sobrepeso, hipertrofia de adipócitos e lesão pancreática. Algumas destas alterações estão presentes na síndrome metabólica humana como, por exemplo, as alterações do metabolismo glicídico e a massa corporal elevada. A lesão pancreática induzida pela dieta HFHS apresentou como características o aumento da massa pancreática, a infiltração de células adiposas (intra e interlobular) e inflamatórias e a degeneração acinar. O infiltrado de células adiposas caracteriza a doença pancreática gordurosa nãoalcóolica. Outro achado relevante foi a hipertrofia da ilhota pancreática, com concomitante aumento da imunocoloração para insulina e diminuição da imunocoloração para o GLUT2. O tratamento com bezafibrato apresentou maior ação sobre as alterações metabólicas induzidas pela dieta HFHS, uma vez que a melhora na intolerância à glicose e na sensibilidade à insulina foram mais pronunciadas nos animais HFHS-Bz, comparado aos demais tratamentos. Além disso, o bezafibrato apresentou um efeito antiobesidade, uma vez que ele diminuiu a massa corporal dos animais alimentados com a dieta HFHS, assim como impediu a hipertrofia dos adipócitos das gorduras inguinal, retroperitoneal e epididimal. O efeito antiobesidade do bezafibrato foi compartilhado apenas com o fenofibrato, porém este medicamento não agiu de forma satisfatória sobre a intolerância à glicose. Por outro lado, a rosiglitazona exacerbou o ganho de massa corporal induzido pela dieta HFHS e como consequência houve hipertrofia cardíaca. Em relação ao pâncreas, os achados mais relevantes são o acúmulo exacerbado de gordura intrapancreática pela rosiglitazona, sinais morfológicos de pancreatite nos animais tratados com fenofibrato, aumento da

80 80 imunocoloração para o PPARβ/δ nas células endócrinas pelo bezafibrato e um aumento da imunocoloração para o GLUT2 pelos três medicamentos. Tem sido mostrado que a rosiglitazona trata de forma eficiente a intolerância à glicose e a resistência à insulina. Esta ação é promovida pelo aumento da expressão do GLUT4 no tecido adiposo, redução da lipotoxicidade dos ácidos graxos livres sobre as células β pancreáticas, redução da secreção de TNF-α pelos adipócitos e aumento da secreção de adiponectina (Olefsky, 2000; Kramer et al., 2001; Kim et al., 2004). Por outro lado, a rosiglitazona pode induzir ganho de massa corporal pelo aumento da massa de tecido adiposo e edema periférico como resultado da retenção renal de sódio (Fuchtenbusch et al., 2000; Mudaliar et al., 2003). Assim, ainda é tema de debate se o ganho de peso induzido pela rosiglitazona em pacientes diabéticos com doença cardiovascular e/ou obesidade associados agravaria esta situação a longoprazo. Foi publicado que a rosiglitazona pode duplicar o risco de insuficiência cardíaca e aumentar em 42% o risco de infarto do miocárdio (Singh et al., 2007). Alguns trabalhos indicam que o tratamento com tiazolidinedionas pode causar hipertrofia cardíaca (Carley et al., 2004; Wu et al., 2004; Chang et al., 2008) e, ratificando este dado, este fenômeno também foi encontrado no presente estudo no grupo HFHS-Ro. Assim, a hipertrofia cardíaca induzida pela rosiglitazona poderia exercer efeitos adversos sobre a função cardiovascular durante o tratamento crônico de pacientes com DM2 ou hipertensão arterial sistêmica. Entretanto, o quanto a indução da hipertrofia cardíaca ocorre em humanos após o uso a longo-prazo de tiazolidinedionas ainda é esconhecido. Alterações nos níveis plasmáticos de LDL e HDL colesterol são fatores de risco importantes para o desenvolvimento da aterosclerose e da doença arterial coronariana (Gordon et al., 1977; Harper e Jacobson, 1999; Brewer, 2004), especialmente em pacientes com síndrome metabólica. O aumento do HDL colesterol é uma característica comum à maioria das linhagens de camundongos quando alimentadas com uma dieta hiperlipídica (Paigen, 1995), de forma contrária ao que acontece na síndrome metabólica humana, que é caracterizada por níveis reduzidos de HDL colesterol (Alberti et al., 2006). Nos humanos, os fibratos reduzem o triglicerídeo plasmático e aumentam o HDL (Fruchart et al., 2001; Fruchart e Duriez,

81 ), e apesar da rosiglitazona apresentar efeito similar, ela aumenta o LDL (Parulkar et al., 2001; Miyazaki et al., 2003; Deeg et al., 2007; Gastaldelli et al., 2007). Alterações no HDL cholesterol pela rosiglitazona não foram vistas no presente estudo, porém os fibratos diminuíram o HDL colesterol, efeito diferente do que é usualmente visto em humanos. O efeito oposto da ativação do PPARα sobre o HDL plasmático em camundongos comparado ao que acontece nos humanos é provavelmente devido a uma regulação diferenciada da apolipoproteína A-1, (APOA1), que forma o núcleo do HDL colesterol. Enquanto a ativação do PPARα aumenta os níveis plasmáticos e a expressão hepática do RNAm da APOA1 em humanos (Berthou et al., 1996), o efeito oposto é observado em roedores (Staels et al., 1992). Além disso, a rosiglitazona diminuiu o LDL colesterol, enquanto os fibratos aumentaram o mesmo, efeito que também provavelmente se deve a diferenças espécie-específicas na regulação das apolipoproteínas. As reduções do LDL e o HDL colesterol foram os principais responsáveis pelo baixo colesterol total nos animais tratados com rosiglitazona ou bezafibrato. A atividade biológica do adipócito muda conforme o seu armazenamento de lipídios aumenta. Comparado aos adipócitos pequenos, os adipócitos grandes são mais resistentes à ação da insulina, secretam mais citocinas inflamatórias e menos adiponectina (Le Lay et al., 2001; Sopasakis et al., 2004), e são mais frequentemente encontrados em pessoas com distúrbios metabólicos relacionados a obesidade (Krotkiewski et al., 1983; Weyer et al., 2000). A resistência à insulina e a inflamação, por sua vez, podem levar ao diabetes tipo II, doença cardiovascular, aumento do risco de câncer e outros problemas associados à obesidade (Powell, 2007). Assim, a composição celular do tecido adiposo é o principal determinante de sua atividade metabólica em resposta às alterações ambientais (Yang e Smith, 2007). A correlação positiva encontrada no presente estudo entre a sensibilidade à insulina (HOMA-IR) e o diâmetro o adipócito ratifica essa afirmação, uma vez que ela mostra que quanto maior o diâmetro do adipócito, maior a resistência à insulina. O presente estudo mostra prevalência de adipócitos pequenos após a terapia com fibratos em todos os depósitos de gordura analisados, o que pode explicar a melhora da resistência à insulina nos grupos HFHS-Fe e HFHS-Bz. A imunocoloração

82 82 aumentada para adiponectina também ratifica a menor resistência à insulina. As gorduras epididimal e inguinal apresentaram-se mais pesadas nos animais tratados com rosiglitazona comparado ao grupo HFHS não tratado, e este achado indica claramente que a rosiglitazona induziu a hiperplasia dos adipócitos nestes dois depósitos, uma vez que não foi vista diferença no diâmetro dos adipócitos entre estes dois grupos. A relação entre o peso das gorduras subcutânea e visceral indica um maior incremento de massa na gordura subcutânea pela rosiglitazona. Devido à expressão abundante de PPARγ no tecido adiposo, acredita-se que a melhora metabólica desempenhada pelos TZDs se deve principalmente a indução da adipogênese para recrutamento de adipócitos novos e pequenos, com maior capacidade de armazenamento de lipídios e secreção de adiponectina, e este fenômeno ocorreria principalmente no tecido adiposo subcutâneo. Entretanto, o ganho excessivo de massa adiposa após tratamentos a longo-prazo pode desempenhar consequências prejudiciais à saúde, particularmente em pessoas nas quais o sobrepeso ou obesidade já está instalado antes do tratamento (Yang e Smith, 2007). Os pesquisadores estão agora prestando atenção na localização da gordura ao invés da obesidade como um todo, uma vez que os depósitos de gordura visceral e subcutâneo possuem funções distintas. Os depósitos viscerais liberam citocinas as quais exercem efeito principal no metabolismo hepático de carboidratos e lipídios e estimulam a secreção hepática de proteínas inflamatórias (Baumann e Gauldie, 1990; Fernandez-Real et al., 2001). As citocinas liberadas pelos depósitos de gordura subcutâneos afetam principalmente o desenvolvimento e função local do adipócito (Sopasakis et al., 2004). A expressão e secreção de leptina são maiores na gordura subcutânea, enquanto, em contraste, a gordura visceral secreta mais adiponectina e é mais sensível a captação da glicose estimulada pela insulina (Tritos e Mantzoros, 1997; Virtanen et al., 2002; Lundgren et al., 2004). No presente estudo, a correlação entre o diâmetro do adipócito e o HOMA-IR foi maior na gordura retroperitoneal comparado às gorduras epididimal e inguinal, sugerindo que os depósitos de gordura podem desempenhar papéis diferentes na sensibilidade à insulina. Morfologicamente, uma estrutura em forma de coroa, representada por células gigantes multinucleadas (resultante da agregação de macrófagos) ao redor dos adipócitos indica a morte do

83 83 adipócito (Cinti et al., 2005), e esta estrutura foi vista com frequência apenas na gordura retroperitoneal dos animais tratados com rosiglitazona. Além disso, a imunocoloração para adiponectina foi maior na gordura retroperitoneal comparada à inguinal após o tratamento com rosiglitazona. Estas ações depósito-específicas (gordura retroperitoneal) reforçam a idéia de funções diferentes para cada tipo depósito de gordura. Os fibratos impediram o armazenamento de energia na forma de gordura independente do consumo de energia, uma vez que a ingestão diária de energia nos animais de ambos os grupos HFHS-Fe e HFHS-Bz não foi diferente do grupo HFHS não tratado. É sabido que o fenofibrato pode causar hipofagia (Carmona et al., 2005), mas isto não ocorreu no presente estudo. Assim, a menor massa corporal e adiposa vista no grupo HFHS-Fe não foi resultado de uma ingestão alimentar reduzida. Provavelmente, os fibratos aumentaram o gasto energético, resultando assim na ausência de ganho de massa corporal. Uma vez que o aumento da oxidação de ácidos graxos é o principal efeito do fenofibrato, a diminuição nos processos de captação e síntese de ácidos graxos, associado com a mobilização dos lipídios no tecido adiposo (Ferreira et al., 2006) pode explicar a parada no ganho de massa corporal e adiposidade por este medicamento. A ativação do PPARβ/δ pelo bezafibrato também pode aumentar a capacidade de oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético, a qual é acompanhada pela redistribuição do fluxo de ácidos graxos do tecido adiposo em direção ao músculo esquelético (Wang et al., 2003; Fredenrich e Grimaldi, 2005). O somatório da ativação do PPARα e PPARβ/δ pelo bezafibrato poderia talvez ser a razão da perda de peso nos camundongos tratados com bezafibrato. Na maioria dos trabalhos experimentais, os fibratos são administrados na ração. A concentração do bezafibrato costuma variar entre 0,2 e 0,5% (p/p) (Peters et al., 2003; Kjorholt et al., 2005), enquanto a concentração do fenofibrato varia entre 0,1 e 0,5% (p/p) (Koh et al., 2003; Choi et al., 2005). É provável que a diferença na resposta da massa corporal entre os fibratos no presente estudo não seja devida a quantidade de medicamento administrada, mas sim devido a uma ativação diferencial dos isotipos do PPAR por estes medicamentos, uma vez que as quantidades utilizadas no presente estudo estão dentro do intervalo utilizado na maioria dos trabalhos.

84 84 Em relação ao pâncreas, o acúmulo ectópico de gordura no grupo HFHS não tratado se localizou principalmente nos espaços interlobular (ao redor dos vasos de maior calibre e ductos) e perilobular (na periferia do lóbulo pancreático). Os animais tratados apresentaram este mesmo padrão, com exceção da rosiglitazona, que também apresentou um aumento marcante na infiltração de células adiposas no espaço intralobular (entre os ácinos exócrinos). A exacerbação do acúmulo de gordura no pâncreas dos animais HFHS-Ro é provavelmente resultado da maior massa adiposa encontrada nestes animais comparado ao grupo HFHS não tratado, em lugar de uma ação específica do medicamento sobre o tecido pancreático. O bezafibrato induziu perda de peso nos animais do grupo HFHS-Bz, e apesar de não apresentar diferença estatística, o acúmulo de gordura em seu pâncreas foi ligeiramente menor do que no grupo HFHS não tratado, reforçando mais uma vez uma possível correlação positiva entre a massa adiposa corporal e a infiltração pancreática de gordura. A presença de pequenas quantidades de gordura no pâncreas é comum em pessoas obesas ou em idade avançada (Walters, 1966; Haaga e Alfidi, 1977; Itai et al., 1995), ou em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (Fraulob et al., 2010; Nascimento et al., 2010) e esta condição é revertida após a perda de peso (Patel et al., 1980). Entretanto, o acúmulo excessivo de gordura no pâncreas pode ter significância patológica, uma vez que ele pode deprimir a função exócrina substancialmente, resultando em má-absorção. Não foram encontradas alterações na lipase e amilase sérica entre os grupos estudados, sugerindo que a função exócrina ainda estava preservada. Entretanto, os animais HFHS e HFHS-Fe não tratados já apresentavam sinais microscópicos de lesão acinar compatível com pancreatite. Apesar dos fibratos poderem causar pancreatite como efeito colateral (Sgro e Escousse, 1991; Brown, 2007), apenas os animais tratados com fenofibrato apresentaram certo grau de lesão acinar. Não existem trabalhos que analisem o papel in vivo das células adiposas intrapancreáticas na função endócrina e/ou exócrina do pâncreas. Entretanto, é sabido que sob condições de estresse oxidativo, citocinas secretadas pelos adipócitos são liberadas localmente e levam a um processo inflamatório com disfunção do órgão

85 85 (Mathur et al., 2007), e camundongos obesos tem significativamente mais TNF-α e IL- 1β em seu pâncreas (Pitt, 2007). Adicionalmente, o próprio ácido graxo livre circulante em níveis elevados está implicado na disfunção da célula β, causando um aumento da secreção basal de insulina e prejuízo na secreção de insulina estimulada pela glicose (Grill e Bjorklund, 2000; Yoshikawa et al., 2001b; Prentki et al., 2002). A rosiglitazona é capaz de melhorar tanto a secreção basal de insulina quanto a secreção de insulina estimulada pela glicose em ilhotas cultivadas em meio contendo palmitato (Tian et al., 2006). Entretanto, apesar desse efeito protetor, é possível que as citocinas inflamatórias liberadas pelas células adiposas intrapancreaáticas in vivo atenuem a extensão dos efeitos benéficos da rosiglitazona sobre a função da célula β. Os isotipos do PPAR são expressos nas ilhotas pancreáticas de roedores e humanos, onde o PPARβ/δ apresenta a maior expressão, seguido do PPARα e PPARγ (Braissant et al., 1996). Entretanto, o papel de cada isotipo na regulação da função das células endócrinas pancreáticas ainda não é completamente entendido. No presente estudo foi visto uma fraca expressão do PPARα no grupo SC, a qual não foi alterada no grupo que recebeu a dieta HFHS. Esta falta de ação sobre a expressão do PPARα está em acordo com um trabalho prévio que mostrou que ilhotas pancreáticas em cultura com palmitato por 8 horas apresentam aumento da expressão de RNAm para o PPARα, mas após longos períodos de incubação a expressão do PPARα, assim como do RNAm para o GLUT2, são inibidos (Yoshikawa et al., 2001b). De forma interessante, no presente estudo o tratamento com ambos os fibratos não aumentou a densidade de coloração do PPARα na ilhota pancreática, apesar de os fibratos serem conhecidos por sua capacidade de ativar a expressão do RNAm e proteína do PPARα (Krey et al., 1997; Yoshikawa et al., 2001a; Inoue et al., 2002). Camundongos PPARα -/- ob/ob desenvolvem uma hiperglicemia severa e dependente da idade, além de disfunção da célula β caracterizada pela redução da área média da ilhota pancreática e prejuízo da secreção de insulina estimulada pela glicose in vivo e in vitro (Lalloyer et al., 2006), sugerindo um papel para o PPARα na função normal das células β. Por outro lado, Yoshikawa e col. mostraram que a exposição da ilhota pancreática de rato ao bezafibrato diminui a secreção de insulina estimulada pela glicose (Yoshikawa et al., 2001a). No presente estudo, o aumento da densidade de imunocoloração para

86 86 insulina na ilhota pancreática do grupo HFHS-Bz mostra que estes animais sintetizam bastante insulina, mas talvez aja alguma alteração em sua secreção, uma vez que a insulina sérica destes animais é baixa. O PPARβ/δ apresentou expressão moderada no grupo SC, e sua expressão foi afetada apenas pelo tratamento com bezafibrato. Trabalhos recentes têm mostrado que o bezafibrato pode atuar como agonista dos três isotipos do PPAR (Krey et al., 1997; Inoue et al., 2002), e no presente estudo foi demonstrado pela primeira vez que o bezafibrato ativa a expressão do PPARβ/δ nas células endócrinas da ilhota pancreática. Higashiyama e col. mostraram que a expressão do PPARβ/δ nas ilhotas pancreáticas de camundongos é restrita ao citoplasma das células δ (Higashiyama et al., 2007), porém em outro estudo, Braissant e col. mostraram um padrão de imunocoloração do PPARβ/δ em ilhotas de rato semelhante ao visto no presente estudo (Braissant et al., 1996). No presente estudo não foi feito a identificação do tipo celular PPARβ/δ-positivo como feito por Higashiyama e col. (Higashiyama et al., 2007), mas pode-se afirmar, baseando-se no padrão de imunocoloração, que as células β expressam a proteína PPARβ/δ. O papel do PPARβ/δ nas células endócrinas da ilhota pancreática ainda é desconhecido e estudos adicionais são necessários. No presente estudo, apenas o bezafibrato foi capaz de prevenir a hipertrofia das ilhotas pancreáticas, e outros trabalhos têm mostrado que ele é capaz de inibir a inflamação pancreática, prevenir a degeneração pancreática (Jia e Otsuki, 2003) e suprimir a expressão da α-actina de músculo liso (Jia et al., 2004), preservando assim a morfologia do tecido pancreático. O quanto estes efeitos são devidos à ativação dos diferentes isotipos do PPAR ou são apenas resultado da melhora do perfil metabólico sistêmico ainda permanece a ser elucidado. As células endócrinas da ilhota pancreática expressam normalmente tanto o RNAm quanto a proteína do PPARγ (Dubois et al., 2000). Adicionalmente, os ácidos graxos livres inibem a expressão do RNAm do PPARγ2 em ilhotas pancreáticas in vivo, e esse efeito é inibido pela rosiglitazona (Lupi et al., 2004), assim a ativação do PPARγ nas células endócrinas pancreáticas pode explicar parcialmente a conexão entre a rosiglitazona e a melhora na homeostase da glicose. Apesar de o PPARγ ser expresso nas células BRIN-BD11 (uma linhagem clonal de células β), estas células são

87 87 relativamente resistentes à ativação pela rosiglitazona quando esta é administrada em concentrações terapêuticas (Welters et al., 2004), assim é difícil dizer se a melhora na função da célula β reportada após o tratamento está relacionada a ação direta da rosiglitazona sobre a função da célula β ou um efeito secundário da ativação do PPARγ em outros tecidos. Adicionalmente, a deleção seletiva do PPARγ nas células β de camundongos não afeta a homeostase da glicose (Rosen et al., 2003), assim a ação antidiabética da rosiglitazona talvez independa da modulação da expressão do PPARγ na célula β. O GLUT2 e a glicoquinase trabalham como sensores de glicose para a secreção de insulina estimulada pela glicose na célula β em condições fisiológicas. Em células β de diabéticos, a expressão do RNAm para o GLUT2 está diminuída, e como consequência a secreção basal de insulina está aumentada (Kim e Ahn, 2004). No presente estudo, a dieta HFHS reduziu a densidade de imunocoloração para GLUT2 na ilhota, enquanto todos os tratamentos mantiveram este parâmetro semelhante ao grupo SC, sugerindo indiretamente que estes medicamentos melhoraram a função da célula β. Sun e col. mostraram que a ativação do PPARα nas células β de ratos pelo fenofibrato aumenta a expressão do RNAm para o GLUT2 (Sun et al., 2008). Adicionalmente, há melhora da secreção de insulina estimulada pela glicose que antes estava diminuída por exposição à ácidos graxos em células isoladas de ilhotas de rato e em células INS-1 (Sun et al., 2008), efeitos também compartilhados pela rosiglitazona (Lalloyer et al., 2006). Por outro lado, Yoshikawa e col. mostraram que a exposição de ilhotas pancreáticas de rato ao bezafibrato diminui a secreção de insulina dependente de glicose (Yoshikawa et al., 2001a). Quando o bezafibrato é adicionado à terapia com pioglitazona porém, há aumento da secreção de insulina estimulada pela glicose quando comparado ao tratamento com pioglitazona isolado, apesar de não haver diferença identificável na imunocoloração para o GLUT2 entre estes dois grupos (Yajima et al., 2003).

88 Considerações finais O tratamento combinado com agonistas PPARα e PPARγ parece promissor no combate à resistência à insulina, dislipidemia aterogênica e obesidade em pacientes com síndrome metabólica. Além disso, a adição da propriedade agonista PPARβ/δ poderia prevenir o desenvolvimento do sobrepeso que tipicamente acompanha a administração de agonistas PPARγ puro como a rosiglitazona, ou até mesmo combater a obesidade. Estudos adicionais sobre a biologia dos PPARs irão aumentar a nossa compreensão com relação a sua significância a nível fisiológicoe farmacológicas, e fornecerão conhecimento adicional para o desenvolvimento de ligantes PPAR superiores e com melhores índices terapêuticos. O bezafibrato é candidato potencial como molde para o desenvolvimento de pan-agonistas PPAR mais eficientes, e que não apresentem os efeitos adversos vistos com os duploagonitas PPAR muraglitazar e tesaglitazar.

89 89 CONCLUSÃO O bezafibrato apresenta um efeito mais amplo sobre as alterações metabólicas, morfológicas e biométricas decorrentes da ingestão de dieta rica em lipídios e sacarose em camundongos C57BL/6, sugerindo que a inibição dos três isotipos do PPAR seja melhor do que a inibição de apenas um isotipo. Além disso, ele também é capaz de aumentar a imunocoloração para o PPARβ/δ nas células endócrinas pancreáticas. A rosiglitazona exacerba o ganho de massa corporal, a infiltração de gordura no pâncreas e induz hipertrofia cardíaca, o que deve ser levado em conta, na medicina, quando da prescrição deste medicamento a pacientes obesos.

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109 ANEXOS 109

110 110 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOLOGIA ROBERTO ALCANTARA GOMES COMISSÃO DE ÉTICA PARA O CUIDADO E USO DE ANIMAIS EXPERIMENTAIS CERTIFICADO Certificamos que o Protocolo nº CEA/176/2008 sobre Alterações metabólicas, estruturais e moleculares em órgãos-alvo de camundongos C57BL/6J com regime alimentar hiperlipídico e diferentes tratamentos sob a responsabilidade de Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido aprovado pela Comissão de Ética Para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da UERJ (CEA), em 22/03/2008. Este certificado expira em 22/03/2010, podendo ser renovado. Rio de Janeiro, 22 de Março de 2008.