EXERCÍCIO FÍSICO REDUZ A PARASITEMIA E ESTIMULA A PRODUÇÃO DE TNF-α E TGF-β EM CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS POR Trypanosoma cruzi

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1 25 a 28 de Outubro de 2011 ISBN EXERCÍCIO FÍSICO REDUZ A PARASITEMIA E ESTIMULA A PRODUÇÃO DE TNF-α E TGF-β EM CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS POR Trypanosoma cruzi Neide Martins Moreira 1 ; Carina Ribeiro Lopes 2 ; Caroline Felício Braga 2, Silvana Marques de Araújo 3 RESUMO: Este trabalho teve como objetivo verificar a influência do exercício físico aeróbio sobre o curso da infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos discutindo a relação entre parasitemia, peso corporal e citocinas pró e antiinflamatórias. Foram utilizados 49 camundongos suíços machos, 30 dias de idade. O exercício físico consistia em atividade de intensidade moderada em esteira rolante. Os animais foram inoculados com 1300 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de Trypanosoma cruzi. A parasitemia foi avaliada entre o 4º e 32º dias após inoculação (dpi). A indução da fase crônica foi obtida pela administração de três doses de 100mg e duas de 250mg/Kg/peso de benzonidazol aos 11, 15, 22, 18 e 41 dias de infecção, respectivamente. Os animais foram pesados semanalmente durante todo o experimento. As dosagens de citocinas foram realizadas com plasma sanguíneo coletado no 75 dia de infecção. Para a dosagem de TNF-α, IFN-γ, IL-10 e TGF-β, foi utilizada a técnica de ELISA de captura. O exercício físico induziu redução do pico de parasitos e parasitemia total e aumentou a produção de TNF-α (p<0,05) e TGF-β (p>0.05) nos animais treinados em relação aos sedentários (p<0,05), com manutenção do peso corporal, trazendo benefícios ao hospedeiro com infecção aguda por T. cruzi. PALAVRAS-CHAVE: Camundongos; exercício físico; TGF-β; TNF-α; Trypanosoma cruzi 1 INTRODUÇÃO A doença de Chagas é causada por Trypanosoma cruzi e atinge cerca de 16 milhões de pessoas na América Latina, onde, milhões estão expostas ao risco de contrair a infecção (Coura; Dias, 2009). O T. cruzi ao infectar o hospedeiro entra em contato com inúmeras células do hospedeiro provocando o desenvolvimento de um processo inflamatório. Conseqüentemente, o sistema imunológico se regula para destruição do parasito. No entanto, o T. cruzi não é detido e invade aleatoriamente outros órgãos, entre eles, coração, intestinos/esôfago e sistema nervoso central (Neves et al., 2005). O exercício físico moderado representa um fator de resistência para o desenvolvimento de infecções causadas por vírus e protozoários por estimular a resposta imunológica (Soares et al., 2010). Contudo, embora existam trabalhos sobre exercício físico na infecção experimental de camundongos por T. cruzi (Schebeleski-Soares et al., 1 Doutoranda pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. neidemartinsenf@yahoo.com.br 2 Mestranda pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. carinaedaniel@hotmail.com; cfeliciobraga@htmail.com 3 Orientadora, Professora Doutora da Disciplina de Parasitologia da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. smaraujo@uem.br

2 2009, Soares et al., 2010), relato correlacionando a parasitemia, peso corporal e produção de várias citocinas, não estão disponíveis. Sendo assim, este trabalho objetivou verificar a influência do exercício físico aeróbio sobre o curso da infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos discutindo a relação entre parasitemia, peso corporal e citocinas pró e antiinflamatórias. 2 MATERIAIS E MÉTODOS Utilizou-se 49 camundongos suíços machos, 30 dias de idade, distribuídos em quatro grupos: Treinado Controle (TC), Treinado Infectado (TI), Sedentário Controle (SC) e Sedentário Infectado (SI). Os grupos TC e TI foram submetidos ao exercício físico moderado (esteira rolante programável, sensibilidade 2m/minuto) durante 5dias/semana, de segunda a sexta, por minutos na primeira semana, minutos na segunda e 60 minutos nas demais, velocidade 13-17m/min, durante 8 semanas.três dias após o término do exercício, TI e SI foram inoculados com 1300 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi. A parasitemia foi avaliada entre o 4º e 32º dias após inoculação (dpi). A indução da fase crônica foi obtida pela administração de três doses de 100mg e duas de 250mg/Kg/peso de benzonidazol aos 11, 15, 22, 18 e 41 dpi, respectivamente. Os animais foram pesados semanalmente durante todo o experimento. Aos 75 dpi, os animais foram submetidos à eutanásia com uma overdose de éter etílico por via inalatória para a obtenção de plasma para dosagens de citocinas TNF-α, INF-γ, TGF-β e IL-10. Utilizou-se a técnica de ELISA (Enzyme Linked ImmuneSorbent Assay) de captura. Os resultados foram expressos em pg/ml para IL-10, IFN-γ e TNF-α e em ng/ml para TGF-β. Os dados foram analisados utilizando o teste ANOVA Tukey e KrusKall-Wallis, considerando nível de significância de 5%. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados mostram que o exercício físico reduziu a curva de parasitemia em animais treinados quando comparados a curva observada em animais sedentários. Os animais do grupo TI apresentaram pico de parasitos (8 dia/infecção) e parasitemia total menores 59% (p=0,0132) e 44% (p=0,0307), respectivamente que SI. (Tabela 1). Schebeleski-Soares et al. (2009), ao avaliarem a influência do exercício físico crônico préinfecção sobre a curva de parasitemia, de camundongos BALB/c fêmeas infectados com a cepa Y de T. cruzi, fase aguda, observaram redução significante da parasitemia apenas no pico do parasitos. A redução da parasitemia parece ser resultante do aumento da produção de TNF-α. Segundo alguns autores, esta citocina associada ao IFN-γ estimula os macrófagos a produzirem óxido nítrico (NO), o principal efetor que controla a replicação intracelular do T. cruzi (Machado et al., 2000). Tabela 1 Parâmetros parasitológicos avaliados em camundongos, suíços, submetidos (TI) ou não (SI) ao exercício físico crônico, e posteriormente infectados com 1300 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi. Grupo Infectividade (%) Período Pré- Patente (dias) Período Patente (dias) Pico de Parasitos (tripomastigotas/ml X 10 6 ) Parasitemia Total (tripomastigotas/ml X 10 6 ) TI 100 5,0 ± 1,1 13,0 ± 8,0 4,0 ± 3,4 9,4 ± 4,6 SI 100 4,2 ± 0,4 13,4 ± 9,0 9,8 a ± 6,3 16,9 b ± 9,5 Dados apresentados como média ± desvio-padrão seguidos de letras diferentes numa mesma coluna apresentam diferença significante entre TI e SI (a: p=0,0132; b: p= 0,0307).

3 No presente estudo, os animais do grupo TI produziram 193,0% mais TNF-α que os animais do grupo SI (p<0,05) e 123,4% mais que os animais do grupo TC (p>0,05) (Tabela 2) levando a conclusão que a infecção associada ao treinamento físico promove aumento da produção de TNF-α, mesmo na fase crônica da infecção quando foi medida a citocina. A curva de parasitemia foi investigada durante a fase aguda da infecção por T. cruzi e o TNF-α, na fase crônica aos 75 dias de infecção, sugerindo que, o aumento significante desta citocina na fase crônica seja herança da ativação de sua síntese durante a fase aguda da infecção o que justifica a redução da curva de parasitemia na fase aguda. Os animais do grupo SI apresentaram diminuição de 59% nas concentrações de TNF-α em relação aos do grupo SC (p>0,05) (Tabela 2). Essa diminuição é justificada pelo fato do TNF-α ser uma citocina pró-inflamatória, ou seja, produzido na fase aguda da infecção (Abbas et al., 2008). No presente estudo o TNF-α foi investigado na fase crônica da doença aos 75 dias. Isso leva a crer que, o fator de maior contribuição para o aumento do TNF-α nos animais do grupo TI foi o exercício físico e não a infecção por T. cruzi. Soares et al. (2010) ao trabalharem com animais treinados e posteriormente infectados com a cepa Y de T. cruzi no 13º dia de infecção, observaram aumento significante na produção de TNF-α em animais sedentários infectados em relação ao seu controle (SI x SC). No entanto, deve ser destacado que as dosagens de Soares et al. (2010) foram realizadas no sobrenadante de cultivo de macrófagos peritoneais e no presente trabalho foram realizadas utilizando plasma. Tabela 2 Média e desvio-padrão dos níveis detectados de TNF-α e TGF-β em camundongos suíços, machos, treinado controle (TC), treinado infectado (TI), sedentário controle (SC) e sedentário infectado (SI), infecção com 1300 formas sanguíneas da cepa Y de T. cruzi durante 75 dias. Citocina Crupo TC TI SC SI TNF-α 107,0 ± 51,0 132,0 a ± 89,0 77,0 ± 46,0 45,0 b ± 34,0 TGF-β 22,0 ± 11,0 18,0 ± 10,0 19,0 ± 9,0 11,6 ± 6,0 Dados apresentados como média ± desvio-padrão seguidos de letras diferentes numa mesma linha apresentam diferença significante entre (p<0,05). No presente estudo, ao término do treinamento físico (8 semanas), os animais do grupo treinado apresentaram redução do peso corporal de 13,5% em relação ao grupo sedentário (p<0,01) (Figura 1). Esta diminuição de peso pode estar relacionada às maiores concentrações de TNF- α, já que concentrações elevadas desta (2008), ao estudar os efeitos do treinamento físico e o consumo da dieta de citocina levam à caquexia, e consequentemente a perda de peso corporal (Anker; Coats, 1999). Almeida cafeteria após lactação em ratos adultos também observou redução significante no peso corporal nos animais do grupo treinado controle em relação o grupo sedentário alimentado com uma dieta de cafeteria. Neste estudo, após a infecção (8 semanas e meia de experimento) o peso corporal dos animais dos diferentes grupos manteve-se estável até o término do experimento para os diferentes grupos avaliados (p=0.6914), (Figura 1).

4 Figura 1 Peso corporal de camundongos, suíços, machos, 30 dias de vida, durante 11 semanas, Treinado Controle (TC), Treinado Infectado (TI), Sedentário Controle (SC) e Sedentário Infectado (SI). Infecção com 1300 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y do T. cruzi, durante 74 dias. (*) = (P<0,01). A estabilidade de peso corporal dos animais após a infecção pode estar relacionada ao TGF-β. Esta citocina inibe a resposta imune do hospedeiro, particularmente as que envolvem macrófagos (Abbas et al., 2008). Consequentemente impede a evolução para um quadro de caquexia com perda de peso corporal. No presente estudo, aos 75 dias de infecção embora não significante, os animais do grupo TI produziram 52,2% mais TGF-β que os animais do grupo SI (p>0,05) (Tabela 2), mostrando uma tendência para um aumento significante da síntese dessa citocina nos animais do grupo TI, enfatizando a importância da prática do exercício físico para a regulação imune e controle da ativação de macrófagos em resposta a infecção por T. cruzi no hospedeiro. A infecção promoveu diminuição de 39,0% nas concentrações de TGF-β nos animais do grupo SI em relação aos do grupo SC (p>0,05) (Figura 2). Investigações realizadas em fragmentos do miocárdio de pacientes humanos com cardiopatia chagásica crônica e insuficiência cardíaca congestiva, após irem a óbito, mostraram que o TGF-β estava pouco expresso, sugerindo a existência de algum fator inibitório atuando sobre macrófagos, podendo corresponder à imunodepressão devido à presença de T. cruzi (Reis et al., 2000). Não foram observados níveis detectáveis para IFN-γ e IL-10, nas condições experimentais avaliadas, ou seja, em animais suíços machos com 160 dias de idade, treinados ou sedentários, infectados (75 dias de infecção) ou não com T. cruzi. 4 CONCLUSÃO Neste trabalho foi demonstrado que o exercício físico traz benefícios ao hospedeiro com infecção aguda por T. cruzi, reduzindo a curva de parasitemia com aumento na produção de TNF-α e TGF-β e manutenção do peso corporal. REFERÊNCIAS Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. Imunologia celular e molecular. 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008: 564. Almeida, F. N. Efeitos do treinamento físico aeróbio e do consumo da dieta de cafeteria após a lactação em características morfológicas e metabólicas apresentadas no fenótipo adulto de ratos Wistar. Maringá Dissertação (Mestrado). Universidade Estadual de Maringá, Maringá, 2008.

5 Anker, S. D.; Coats, A. J. S. A syndrome with impaired survival and immune and neuroendocrine ativation. Chest, v, 115, p , Coura, J. R.; Dias, J. C. P. Epidemiology control and surveillance of Chagas disease 100 years after its Discovery. Mem Inst Oswald Cruz, v, 104, p , Machado, F. S.; Martins, G. A.; Aliberti, J. C.; Mestriner, F. L.; Cunha, F. Q.; Silva, J. S. Trypanosoma cruzi-infected cardiomyocytes produce chemokines and cytokines that trigger potent nitric oxide-dependent trypanocidal ativity. Circulation, v, 24, p , Neves, D. P.; De Melo, A. L.; Linardi, P. M.; Vitor, R. W. A. Parasitologia humana. 11 edição. São Paulo: Atheneu, Reis, M. M.; Higuchi, M. L.; Aiello, V. D.; Benvenuti, L. A. Fatores de crescimento presentes no miocárdio de pacientes com cardiopatia chagásica crônica. Rev Soc Bras Med Trop. v, 33, p , Schebeleski-Soares, C.; Occhi-Soares, R. C.; Franzoi de Moraes, S. M.; De Oliveira Dalálio, M.; Almeida, F. N.; De Ornelas, T. M. J.; Araújo, S. M. Preinfection aerobic treadmill training improves resistance against Trypanosoma cruzi infection in mice. Appl Physiol Nut Metab, v, 34, p , Soares, C.S.; Occhi, R.C.; Carvalho, L.G.L.; Moraes, S.M.F.; Dalário, M.M.O.; Araújo, S.M. Produção de fator de necrose tumoral-alfa e peróxido de hidrogênio na infecção pelo Trypanosoma cruzi em camundongos submetidos ao exercício. Acta Scientiarum. Health Sciences. v, 32, p , 2010.