Título: Aplicação da tecnologia Lab-on-Paper a biossensores colorimétricos para a detecção a tuberculose Entre os factores que mais contribuem para

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1 Título: Aplicação da tecnologia Lab-on-Paper a biossensores colorimétricos para a detecção a tuberculose Entre os factores que mais contribuem para uma prevenção e tratamento mais eficazes de doenças nos animais e nos humanos, incluindo doenças infecciosas, está o acesso a meios de diagnóstico simples e fiáveis que permitam detectar as mesmas o mais precocemente possível. Muito embora meios de diagnóstico eficazes estejam normalmente disponíveis em países economicamente desenvolvidos, o mesmo não se pode afirmar em relação aos países em vias de desenvolvimento. As pessoas que vivem nestes países não têm muitas vezes acesso a estes meios de diagnóstico nem às infraestruturas necessárias para os suportar. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) e, também, com a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), deve ser dada prioridade ao desenvolvimento de novos testes de diagnóstico para utilização em países em vias de desenvolvimento, que sejam acessíveis, sensíveis, fáceis de manusear, rápidos, robustos e sem que seja necessário o recurso a equipamentos complexos ou dispendiosos para a sua utilização. A utilização de microfluídica em papel é uma técnica muito recente que utiliza papel como suporte para se definirem microcanais e zonas de teste hidrófilas, delimitadas por paredes ou regiões hidrófobas. Por exemplo, quando amostras de sangue, urina, saliva ou outros fluidos são postos em contacto com estes microcanais hidrófilos, ocorre a sua absorção e condução por capilaridade através de zonas predefinidas, sem necessidade de se recorrer a bombas externas como acontece com a microfluídica convencional. A reacção de determinados componentes das amostras com reagentes imobilizados nas zonas de teste origina uma alteração na cor dessas zonas, cujo resultado pode ser facilmente comparado com uma referência de cores que pode estar impressa no próprio dispositivo. Depois de utilizados, estes dispositivos em papel podem ser facilmente eliminados através da sua queima, evitando contaminações. A microfluídica em papel está a dar os primeiros passos, mas revela-se uma tecnologia bastante promissora para o desenvolvimento de testes de diagnóstico baratos, simples e de fácil utilização, que terão um enorme impacto no melhoramento dos cuidados de saúde em regiões do globo mais desfavorecidas. Neste trabalho é proposto o desenvolvimento e optimização de procedimentos que permitam fabricar dispositivos microfluídicos em papel, baseados numa técnica bastante simples e de baixo custo. O processo de fabrico destes dispositivos envolve dois passos principais: (i) impressão de padrões de cera na superfície do papel; e (ii) aquecimento e difusão da cera para o interior do papel de forma a se formarem barreiras hidrófobas (que delimitam microcanais e zonas de teste). Este processo baseado na impressão de padrões de cera encontra-se esquematizado na Figura 1, é de baixo custo e pode ser utilizado para a produção rápida de centenas ou milhares de dispositivos baseados em microfluídica de papel. A grande vantagem da utilização de papel reside no facto de o papel ser bastante mais barato que outros materiais utilizados em dispositivos de diagnóstico e ser compatível com uma série de testes de diagnóstico já existentes. 1

2 A B C Figura 1. Representação esquemática do processo de fabrico de dispositivos microfluídicos em papel baseado na impressão de cera: (A) Desenho do padrão de microcanais e zonas de teste em programas informáticos simples; (B) Impressão dos padrões desenhados em papel hidrófilo, com uma impressora de tinta de cera; (C) Aquecimento do papel impresso, por exemplo numa placa térmica, fazendo com que a tinta de cera derreta e impregne o papel ao longo de toda a sua espessura, formando barreiras hidrófobas (adaptado de Carrilho et al. 2009). Os dispositivos microfluídicos em papel desenvolvidos neste trabalho serão testados numa prova de conceito, envolvendo a detecção específica de membros do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). As espécies deste complexo são agentes de tuberculose em diversos hospedeiros e incluem Mycobacterium tuberculosis, o principal agente da tuberculose humana, Mycobacterium bovis e Mycobacterium caprae, entre outras. As espécies M. bovis e M. caprae estão associadas a tuberculose em bovinos e caprinos, respectivamente, mas representam um elevado potencial zoonótico de transmissão ao Homem. Existem também algumas evidências que apontam para a possibilidade de transmissão pessoa a pessoa das espécies zoonóticas de Mycobacterium, mas as principais vias de transmissão são o contacto com animais infectados e a ingestão de lacticínios incorrectamente pasteurizados ou não pasteurizados. Objectivos a atingir (resumo): O objectivo global deste trabalho é produzir um protótipo de um biossensor baseado em microfluídica, tendo como suporte papel de origem celulósica, que permita identificar micobactérias do MTC. As reacções de bioreconhecimento vão basear-se na ligação de anticorpos anti-mtc, imobilizados nas zonas de teste na matriz de papel, a células das espécies do MTC (e/ou antigénios resultantes da sua lise). Na Figura 2 está esquematizado o funcionamento destas reacções de bioreconhecimento e a respectiva sinalização da ocorrência dessas reacções. Metodologia 1. Optimizar a impressão de cera, utilizando uma impressora de tinta de cera comercial, para desenhar padrões microfluídicos em papel hidrófilo. Para além da impressão na superfície do papel, será estudada e optimizada a difusão da cera para o interior do papel com recurso a tratamentos térmicos de baixa temperatura (< 160 C). Nesta fase serão estudados vários parâmetros tais como o tipo de papel e espessura, e a influência do tempo e temperatura na difusão da cera. Este trabalho engloba uma parte na área de caracterização de materiais das quais se destacam as seguintes técnicas: microscopia 2

3 óptica, de força atómica e electrónica de varrimento, e caracterização térmica dos suportes e da cera. 2. Optimizar a imobilização de anticorpos anti-mtc nas zonas de teste dos dispositivos microfluídicos em papel e testar a identificação de micobactérias do MTC. Neste trabalho será testada a imobilização de anticorpos na matriz de papel por adsorção simples. Soluções com várias concentrações de anticorpos comerciais anti-mtc serão testadas e depositadas nas zonas de teste do papel (Figura 2). A impregnação do papel com soluções de agentes de bloqueio (p.e. BSA) e de surfactantes (p.e. PVP) será avaliada, nomeadamente para diminuir a ocorrência de ligações não específicas. A identificação de células de Mycobacterium bovis e de outros membros do MTC, mortas ou lisadas, será testada no sistema desenvolvido. A sinalização da ocorrência de eventos de bioreconhecimento será sinalizada com recurso a anticorpos comercialmente disponíveis conjugados com nanopartículas de ouro coloidal (Figura 2). A Microcanal hidrófilo a b c d Fluxo dos fluidos por capilaridade Região hidrófoba B a b c d Fluxo dos fluidos por capilaridade Células de Mycobacterium Anticorpo secundário anti-coelho conjugado com nanopartículas de ouro Anticorpos primários anti-mtc (produzidos em coelho e ratinho) Figura 2. Esquema possível para a construção e funcionamento do dispositivo microfluídico em papel. (A) Uma suspensão de células de Mycobacterium é conjugada com anticorpos policlonais primários anti-mtc (produzidos em coelho) e depositada na zona de teste (a); Esta amostra vai difundir-se por capilaridade até à zona de conjugação (b), onde os anticorpos secundários anti-coelho conjugados com nanopartículas de ouro se ligam ao complexo. (B) Este complexo continua a migrar por capilaridade até à zona de teste (c), onde as células de Mycobacterium são aprisionadas por ligação a um segundo anticorpo primário anti-mtc aí imobilizado (produzido em ratinho); a concentração de nanopartículas de ouro na zona de teste vai provocar o aparecimento de uma cor vermelha; o aprisionamento subsequente dos anticorpos secundários anti-coelho conjugados com ouro na zona de controlo (d), por ligação a anticorpos primários produzidos em coelho aí imobilizados, permite verificar um desempenho correcto do teste. 3

4 Plano de trabalho resumido: 1. Revisão bibliográfica (1 mês) 2. Optimização do processo de impressão, incluindo a escolha e preparação do papel, e testes em tempo e temperatura de forma a se optimizar o processo de fabrico das regiões hidrófobas no interior do papel (1 mês) 3. Preparação dos dispositivos, incluindo o teste com diferentes configurações, orientações, espessura de linha e espaçamento entre linhas (2 meses). 4. Caracterização de vários tipos de papéis (SEM/DRX/ângulo contacto/dta-dsc) (1 mês). Ver papéis com diferentes superfícies e imprimir na parte posterior. 5. Desenvolvimento de um novo processo de fabrico de microfluidica em PDMS recorrendo à impressão de folha de acetato (1 mês) 6. Preparação dos dispositivos para detectar membros do MTC, incluindo testes de imobilização de anticorpos por adsorção na matriz de papel e optimização da concentração dos anticorpos repórter conjugados com nanopartículas de ouro (2 meses) 7. Discussão e interpretação dos resultados (1 mês) 8. Escrita da tese (1 mês) Bibliografia 1. Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D., Inkjet-printed paperfluidic immunochemical sensing device. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 398, Carrilho, E.; Martinez, A. W.; Whitesides, G. M., Understanding Wax Printing: A Simple Micropatterning Process for Paper-Based Microfluidics. Analytical Chemistry 2009, 81, (16), Martinez, A. W.; Phillips, S. T.; Whitesides, G. M.; Carrilho, E., Diagnostics for the Developing World: Microfluidic Paper-Based Analytical Devices. Analytical Chemistry 2010, 82, (1), Lu, Y.; Shi, W. W.; Jiang, L.; Qin, J. H.; Lin, B. C., Rapid prototyping of paperbased microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis 2009, 30, (9), Lu, Y.; Shi, W. W.; Qin, J. H.; Lin, B. C., Fabrication and Characterization of Paper-Based Microfluidics Prepared in Nitrocellulose Membrane By Wax Printing. Analytical Chemistry 2010, 82, (1), Dungchai, W.; Chailapakul, O.; Henry, C. S., A low-cost, simple, and rapid fabrication method for paper-based microfluidics using wax screen-printing. Analyst 2009, 136, (1), Diagnostics For 4

5 Nome dos orientadores: Elvira Maria Correia Fortunato (Departamento de Ciência dos Materiais) João Inácio (Departamento de Ciências da Vida) Contacto dos Orientadores: Ext Local de realização do trabalho: Centro de Investigação de Materiais - CENIMAT/I3N Departamento de Ciências da Vida 5