AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO POPLITEAL EM RATOS

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO POPLITEAL EM RATOS RODRIGO NETTO COSTA Rio de Janeiro Setembro 2001

2 ii MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO POPLITEAL EM RATOS RODRIGO NETTO COSTA Monografia apresentada à disciplina de Análises Clínicas da Universidade do Rio de Janeiro como requisito parcial a aprovação no Curso de Ciências Biológicas Modalidade Médica. Rio de Janeiro Setembro 2001

3 iii FICHA CATALOGRÁFICA Costa, Rodrigo Avaliação do efeito imunossupressor mediado pela dexametasona, ciclofosfamida e talidomida no ensaio do linfono popliteal em ratos/ Rodrigo Netto Costa xvii, 68 f. Orientadora: Isabella Fernandes Delgado Monografia - Universidade do Rio de Janeiro, Centro de Ciências Biológicas. 1. Ensaio do Linfonodo Popliteal. 2. imunossupressão. 4. Imunotoxicologia. I. Delgado, Isabella Fernandes. II. Universidade do Rio de Janeiro. III. Título.

4 Monografia realizada sob orientação científica da Dra. Isabella Fernandes Delgado, pesquisadora do Laboratório de Toxicologia Ambiental da Escola Nacional de Saúde Pública, FIOCRUZ, e orientação acadêmica do Dr. Claude André Solari, responsável pelo Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Universitário Gaffreé e Guinle, UNIRIO. iv

5 v MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO POPLITEAL EM RATOS RODRIGO NETTO COSTA ORIENTADOR CIENTÍFICO:... Dra. Isabella Fernandes Delgado ORIENTADOR ACADÊMICO:... Dr. Claude André Solari Rio de Janeiro Setembro 2001

6 vi É melhor tentar e falhar, que preocupar-se em ver a vida passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver. (Martin Luther King)

7 Dedico este trabalho a Deus, que me formou e em sua infinita misericórdia resolveu me amar e dar sua vida por mim, me cobrindo de esperança, fé, amor e realizações. A Ti Senhor, dedico toda a minha gratidão, respeito e amor. vii

8 viii AGRADECIMENTOS A meus pais que me educaram com todo o amor e me sustentaram com total diligência, dando-me todo o exemplo e apoio necessários para que eu alcançasse mais esta realização. Amo vocês! A minha noiva Tatiana, que me cativou com seu amor, paciência e dedicação, tornandose o grande amor da minha vida. E também a seus pais e irmãos por quem eu tenho um grande carinho! A minha irmã e meu cunhado que, com certeza, sempre foram e sempre serão meus grandes amigos. E, obrigado pelo computador! A minha sobrinha Gabi, que me deu muita alegria em vir ao mundo no ano passado, justamente no período de início deste trabalho. A Isabella Delgado, por confiar em mim, me dando esta oportunidade não só de um estágio, mas de um aprendizado que levarei por toda minha vida profissional. Obrigado pela grande orientação, pelo exemplo e pela amizade. Este trabalho é nosso! Ao Dr. Francisco Paumgarttem por ter me recebido em seu laboratório, e por ter me auxiliado no que foi preciso para a elaboração deste trabalho.

9 ix Ao Dr. Claude por ter sido compreensivo com as nossas dificuldades no HUGG e por prontamente me ajudar no que foi preciso. A Karen e Márcia pela amizade, apoio e por me indicarem à vaga de estágio no laboratório. A Laísa e Erick pelo grande auxílio em toda a fase experimental deste trabalho. Sem vocês não iria ser possível! A Rosângela e Vanilda pelo grande exemplo de amizade, simpatia e prestatividade dedicados não só a mim, mas a todos do laboratório. A todos os demais profissionais e estagiários do Laboratório de Toxicologia que apesar de não terem sido mencionados individualmente, meu carinho e estima é por todos. Obrigado por serem tão profissionais e por fazerem um ambiente de trabalho tão agradável. A Marisa Soares e todo o pessoal do LAPSA por terem sido tão amigos e por terem me ajudado tanto no meu primeiro estágio. Aos amigos da faculdade que durante os anos da graduação fizeram esse tempo passar tão rápido. Obrigado a todos e, principalmente, à Larisse pela amizade contínua e duradoura. A todos os profissionais do Laboratório de Patologia Clínica do HUGG, em especial à Aninha da secretaria, por ter sido uma pessoa maravilhosa comigo.

10 x Aos professores da UNI-RIO, principalmente aqueles que foram conselheiros e que não se preocuparam apenas em ministrar o conteúdo programático básico de suas disciplinas, mas em mostrar a importância humanista da nossa profissão. A todos do Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Veterinária da UFF, em especial a Prof a Ignez Bittencourt de Araújo, por tornar possível a manutenção dos animais no biotério, durante toda a fase experimental desse trabalho. A todas as ratas de laboratório por doarem suas próprias vidas em prol da ciência! Enfim, obrigado a todos que de um jeito ou de outro foram responsáveis pela realização desse trabalho.

11 xi LISTA DE ABREVIATURAS ACTH adrenocorticotropina ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity Ad libitum com livre acesso AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida AZP azatioprina CAB carbamazepina CCL ciclosporina A CFA ciclofosfamida CPZ clorpromazina DMSO dimetil sulfoxido DNA ácido desoxirribonucleico DP desvio padrão DPH difenilhidantoína DXM dexametasona EBV Epstein-Barr virus e.g. por exemplo (exempli gratia) ELP Ensaio do Linfonodo Popliteal EST estreptozotocina et al. e colaboradores (et alii) EVH enxerto-versus-hospedeiro HDZ hidrazina IC índice de celularidade i.e. isto é ( id est ) Ig imunoglobulina

12 xii Il interleucina IP índice de peso LES lupus eritematoso sistêmico MHC complexo principal de histocompatibilidade MTX metrotexano NaCl clopreto de sódio ND não determinado NF-kB fator nuclear de transcrição Kapa B NK natural killer PA procainamida PBB bifenilas polibromadas PCB bifenilas policloradas PBS solução tampão-fosfato PD pata direita PE pata esquerda PLN popliteal lymph node PM peso molecular qsp quantidade suficiente para s.c. sub cutânea TAL talidomida TCDD 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina v.o. via oral ZMD zimeldina

13 xiii LISTA DE TABELAS E FIGURAS Tabela 1 Funções do sistema imune e possíveis reações inadequadas induzidas por xenobióticos. 02 Tabela 2 Incidência de tumores em indivíduos com imunodeficiência. 08 Figura 1 Efeito de corticosteróides sobre o número de leucócitos circulantes. 09 Figura 2 Efeito de corticosteróides e da ciclosporina sobre a produção de interleucinas. 11 Figura 3 Efeito de corticosteróides sobre a transcrição gênica de citocinas. 13 Figura 4 Fases do ciclo mitótico. 15 Figura 5 Eventos celulares associados a um estímulo antigênico: fase de indução e fase estabelecida ou efetora. 16 Figura 6 Efeito da ciclofosfamida sobre filamentos de DNA de linfócitos. 18 Figura 7 Aumento do linfonodo popliteal induzido por clorpromazina. 23 Tabela 3 Avaliação do efeito imunossupressor da dexametasona. 34

14 xiv Tabela 4 Avaliação do efeito imunossupressor da ciclofosfamida. 35 Tabela 5 Avaliação do efeito imunossupressor da talidomida. 36 Tabela 6 Esquema de tratamento com dexametasona, ciclofosfamida e talidomida. 37 Tabela 7 Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de peso. 41 Tabela 8 Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de celularidade. 42 Tabela 9 Efeito dos agentes imunossupressores sobre o peso dos órgãos imuno-relacionados. 43 Figura 8 Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP (índices de peso). 44 Figura 9 Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP (índices de celularidade). 45 Tabela 10 Aumento do linfonodo popliteal de ratos com substâncias (e hemácias) positivas no ELP em diferentes laboratórios. 58

15 xv ÍNDICE Lista de abreviaturas Lista de tabelas e figuras Índice Resumo Abstract xi xiii xv xvi xvii I. Introdução 01 I.1 Imunotoxicologia 01 I.2 Imunossupressão 03 I.3 Complicações decorrentes de imunossupressão 06 I.4 Terapia Imunossupressora 07 I. 4.1 Corticosteróides 08 I. 4.2 Agentes citotóxicos 14 I. 4.3 Talidomida 19 I.5 Ensaio do Linfonodo Popliteal 21 I.6 Importância do trabalho 24 II. Objetivo 26 III. Material e Métodos 27 III.1 Animais 27 III.2 Biotério 27 III.3 Fármacos e Reagentes 28 III.3.1 Controle positivo no ELP 28 III.3.2 Agentes imunossupressores 28 III.3.3 Outros 29 III.4 Preparo de soluções 30 III.5 Desenho experimental 31 III.5.1 DXM (Experimento 1) 34 III.5.2 CFA (Experimento 2) 35 III.5.3 TAL (Experimento 3) 35 III.6 Análise estatística 36 IV. Resultados 38 IV.1 Efeito da DXM 38 IV.2 Efeito da CFA 39 IV.3 Efeito da TAL 40 V. Discussão 46 VI. Conclusões 59 VII. Referências 61

16 xvi RESUMO O Ensaio do Linfonodo Popliteal (ELP) é usualmente empregado como teste preditivo da capacidade de indução de reações auto-imunes por xenobióticos. Estudos adicionais (e.g. com a ciclosporina A) sugerem que com pequenas modificações, o ELP pode ser também aplicado como ensaio preditivo de imunossupressão induzida. No presente estudo, investigamos se o ELP modificado é realmente sensível para este tipo de detecção. Ratas Wistar (N=81) receberam injeção subcutânea de 5mg de clorpromazina (CPZ) na pata posterior direita. A pata esquerda recebeu apenas veículo (salina). Cada animal recebeu tratamento adicional com um dos agentes imunossupressores estudados, i.e. dexametasona (DXM), ciclofosfamida (CFA) ou talidomida (TAL). Cada grupo experimental foi comparado com um grupo controle tratado apenas com veículo. Sete dias após o tratamento com CPZ, os linfonodos popliteais foram retirados e os índices (direito/esquerdo) de peso (IP) e celularidade (IC) determinados. Os pesos de baço, fígado e timo foram igualmente analisados. O aumento de IP (3,00±1,07) e IC (21,73±19,87) induzido por CPZ foi inibido pela DXM nas doses de 1,0 mg/animal (IP:1,56±1,17 e IC:2,20±2,73) e 0,2 mg/animal (IP:2,19±1,37 e IC:6,48±9,56). Animais tratados com 0,02mg DXM ou com CFA (10mg/animal) não apresentaram alterações estatisticamente significativas de IP e IC, apesar de apresentarem drástica redução de peso de timo e baço. TAL não induziu alterações de peso dos orgãos imuno-relacionados nem dos IP e IC. Concluiu-se que o ELP não foi sensível para detectar o efeito dos agentes imunossupressores aqui estudados, mesmo em doses em que sinais de toxicidade sistêmica (e.g. atrofia de timo e baço) já eram evidentes. Portanto, o ELP não pode ser usado como ensaio preditivo de reações imunossupressoras induzidas por xenobióticos.

17 xvii ABSTRACT The popliteal lymph node (PLN) assay is used as a predictive test for assessing the autoimmunogenic potential of xenobiotics. However, a quite different potential application of this assay is the rapid screening for immunosuppressive chemicals by assessing their effects on the PLN response to a known antigen. In this work we investigated whether this modified version of the PLN assay is really sensitive. Female Wistar rats (N=81) received subcutaneous injection of CPZ (5mg/animal) into the right hind footpad. The contralateral footpad was treated with saline only. All animals were additionally treated with an immunosuppresive drug, i.e. dexamethasone (DXM), cyclophosphamide (CFA) or thalidomide (TAL). Seven days after treatment with CPZ, the popliteal lymph nodes (PLN) were removed, and the weight (WI) and cellularity (CI) indices (right/left) were determined. The weights of spleen, liver and thymus were analyzed as well. The increase on PLN induced by CPZ (WI=3.00±1.07 and CI=21.73±19.87) was inhibited by DXM on doses of 1mg/animal (WI=1.56±1.17 and CI=2.20±2.73) and 0.2mg/animal (WI=2.19±1.37 and CI=6.48±9.56). Animals treated with 0.02mg/animal did not show statistically significant alterations (WI=2.81±1.50 and CI=8.76±5.87) when compared to the control group. All animals exposured to DXM (0.02; 0.2 or 1mg/animal) and CFA (10mg/animal) have shown a drastic reduction on thymus and spleen relative weights. CFA and TAL (10mg/animal) did not induce alterations on WI and CI. Our data show that the PLN assay is not sensitive for the detection of immunosuppressive effects, even when systemic toxicity (i.e. thymus and spleen atrophy) is already evident. Therefore, the PLN assay cannot be used as a predictive assay of induced immunossupression.

18 1 I. INTRODUÇÃO I.1 Imunotoxicologia Imunotoxicologia é a ciência que estuda a ação deletéria de xenobióticos sobre o sistema imune. Sendo um dos ramos mais recentes da toxicologia, esta ciência teve seu início relacionado ao cenário clínico da década de Neste período observa-se a introdução e ampla utilização de potentes drogas imunossupressoras, resultando nas primeiras descrições de efeitos adversos causados por estes novos tratamentos e, consequentemente, estimulando o interesse pela área de imunossupressão induzida por xenobióticos. Assim sendo, a introdução da terapia imunossupressora foi um marco importante que contribuiu não somente no progresso do campo de transplantes de orgãos, mas também colocou em evidência os efeitos adversos induzidos por substâncias imunossupressoras, gerando a preocupação com a possibilidade de que condições semelhantes de imunossupressão pudessem ser acidentalmente induzidas via exposição ocupacional ou ambiental. Isso fez com que nas décadas de 1970 e 1980, imunologistas e toxicologistas trabalhassem juntos na busca de estratégias para a avaliação não-clínica de imunotoxicidade. O produto final do esforço destas duas áreas foi o desenvolvimento de alguns modelos preditivos de imunossupressão induzida. Neste período, várias substâncias (entre elas, medicamentos, aditivos alimentares, pesticidas etc.) foram avaliados quanto ao seu potencial imunossupressor, enquanto outros aspectos menos estudados, porém de igual importância, e.g. indução de hipersensibilidade e auto-imunidade, foram posteriormente avaliados (Tabela 1).

19 2 Tabela 1: Funções do sistema imune e possíveis reações inadequadas induzidas por xenobióticos. Reação inadequada Função Natureza do Exemplo Exacerbada Ineficaz estímulo Defesa Exógeno Microorganismo Hipersensibilidade Imunodeficiência Homeostasia Endógeno ou Exógeno Remoção de células danificadas Autoimunidade... Imunovigilância Endógeno ou Exógeno Remoção de células mutantes... Transformação malígna Segundo Bellanti, 1991 Hoje, há diversos meios de se avaliar a indução de imunossupressão, entre eles, testes relacionados à imunidade não-específica (atividade das células natural killer (NK), fagocitose, etc), à imunidade humoral (e.g. ensaio das células formadoras de placa, proliferação de células B, etc) ou relacionados à imunidade mediada por células T (proliferação in vitro ou in vivo). Estas avaliações, via de regra, acompanham testes de toxicidade crônica, em que os animais são submetidos a longo período de exposição ao xenobiótico em questão, e então avaliados por meio dos testes acima relacionados. Tais estudos, além de longos, são bastante complexos. Freqüentemente envolvem mão de obra especializada, um grande número de animais, reagentes e sistemas caros, e ainda, devido a longa duração da exposição, representam um investimento alto na manutenção dos animais em teste. Diante disso, observa-se uma preocupação crescente com o desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos modelos que apresentem potencial preditivo para a avaliação de risco em imunotoxicologia. Tais modelos devem ser mais simples e contribuir num primeiro momento para a avaliação de risco de xenobióticos, permitindo uma análise inicial sobre o potencial imunomodulador de determinada substância e, desta forma

20 3 direcionando estudos posteriores mais complexos. Tais modelos atenderiam às necessidades rotineiras de avaliação de segurança e teriam aplicação importante, por exemplo, em estudos pré-clínicos de novos produtos. É neste contexto que o Ensaio do linfonodo popliteal (ELP) encontra aplicação. I.2 Imunossupressão Uma das funções essenciais do sistema imunológico é a defesa contra a infecção. Crianças nascidas com um defeito numa área crítica desse sistema sofrem infecções contínuas e, em muitos casos, dependendo do grau de comprometimento dos componentes imunológicos afetados ao nascimento, podem vir a morrer se não houver acesso à tecnologia médica avançada. A habilidade do organismo em responder de forma específica, flexível e mais eficaz à invasão de agentes estranhos ao organismo está filogeneticamente associada ao aparecimento dos vertebrados. Enquanto animais inferiores possuem os chamados mecanismos imunológicos inatos ou inespecíficos, tais como a fagocitose, animais superiores desenvolveram uma resposta imunológica adaptativa ou adquirida. A característica fundamental de componentes do sistema imune adaptativo, presente em vertebrados é a habilidade desenvolvida por membros deste filo no reconhecimento daquilo que não é próprio e na destruição/eliminação subseqüentemente do corpo estranho que pode representar risco ao organismo. Os mecanismos específicos de resistência do hospedeiro (memória, especificidade e capacidade de discriminar entre o que lhe é próprio e não-próprio) conferem aos organismos superiores importantes vantagens. Entretanto, esta reatividade imunológica contra agentes estranhos ao organismo pode estar comprometida em diversas situações. Um exemplo é o acometimento de

21 4 determinados indivíduos com conhecida predisposição genética para imunodeficiências específicas. A doença de Brutton (ou agamaglobulinemia ligada ao sexo), a deficiência isolada da IgA, a síndrome de DiGeorge (hipoplasia tímica), a imunodeficiência combinada grave (de células T e B), a síndrome de Wiskott-Aldrich (imunodeficiência com trombocitopenia), a síndrome do linfócito exposto, a deficiência de proteína de adesão leucocitária e as deficiências genéticas do sistema complemento são os exemplos deste grupo de doenças, comumente conhecidas como imunodeficiências primárias (Rey, 1999) e relacionadas a erros genéticos que afetam a imunidade específica (humoral ou celular) ou os mecanismos imunológicos inespecíficos do hospedeiro (i.e. mediados por proteínas do sistema complemento e células como os fagócitos e as células NK). As manifestações clínicas e o tratamento proposto para cada tipo de imunodeficiência primária dependem fortemente do componente do sistema imune por ela afetado. Assim sendo, não causa espanto a constatação de que as deficiências genéticas do sistema complemento, por exemplo, possam predispor o paciente a infecções piogênicas, ou seja, aquelas usualmente causadas por bactérias que só são fagocitadas com sucesso após opsonização (papel do complemento). Por outro lado, pacientes acometidos com deficiência seletiva de células T, e.g. síndrome de DiGeorge, apresentam vulnerabilidade a um padrão acentuadamente mais abrangente de infecções, sendo suscetíveis a aqueles vírus e fungos, que em indivíduos imunocompetentes seriam erradicados por componentes da imunidade do tipo celular. De um modo geral pode-se dizer que o estudo dos casos de imunodeficiência primária vem contribuindo muito para ampliar os conhecimentos sobre imunologia, tendo revelado as causas precisas de grande número de enfermidades devidas a erros genéticos. Entretanto, erros genéticos não são os únicos fatores que podem levar ao comprometimento de componentes do sistema imune. Também a presença de

22 5 determinados fatores exógenos pode induzir o aparecimento de imunodeficiências. A imunidade de tipo celular, por exemplo, pode estar comprometida em indivíduos desnutridos. A deficiência de ferro é particularmente importante neste contexto. Por outro lado, animais e pacientes humanos obesos mostram alterações em vários componentes da resposta imune, incluindo citotoxicidade, atividade das células NK e capacidade de fagócitos em destruir bactérias e fungos (Roitt et al., 1999). A imunossupressão é uma característica universal da infecção parasitária e compromete tanto as respostas mediadas por anticorpo como as mediadas por células. Com certa freqüência, infecções virais estão igualmente associadas à presença de imunodeficiência secundária. O sarampo no homem, a doença de Newcastle em aves e a peste bovina no gado são exemplos de condições patológicas associadas à imunossupressão, que nestes casos tem sido atribuída a um efeito citotóxico direto do vírus sobre as células linfóides (Roitt, 1989). Enquanto alguns vírus e outros agentes infecciosos (e.g. larvas jovens de T. spiralis liberam um fator solúvel linfocitotóxico) podem causar rompimento das células ou dos tecidos linfóides diretamente, muito da supressão pode resultar da interferência com a função macrofágica. Na hanseníase lepromatosa e na infecção malárica há provas de uma restrição na reatividade imunológica, imposta por uma distorção nas vias de tráfego normal dos linfócitos e, em última análise, a função dos macrófagos parece também ser aberrante. Fatores plasmáticos de pacientes com sífilis secundária bloqueiam in vitro a transformação de linfócitos de indivíduos normais pela fitoemaglutinina e podem ser os responsáveis pela redução geral da imunidade do tipo celular observada nesta doença. Muitos agentes, tais como raio X, drogas citotóxicas e os corticosteróides, embora freqüentemente empregados como agentes terapêuticos num contexto não-imunológico, podem não obstante, ter efeitos adversos severos sobre componentes do sistema imune.

23 6 I.3 Complicações decorrentes de imunossupressão A imunossupressão, sobretudo quando prolongada, pode acarretar em danos estruturais e/ou funcionais com conseqüências irreversíveis ao organismo. Alguns agentes imunossupressores são tóxicos para várias células, além de apresentarem o potencial de ativar infecções latentes e aumentar muito a susceptibilidade à infecções sérias, tais como aquelas provocadas por fungos, bactérias e vírus prevalecentes e que ordinariamente apresentam pouca patogenicidade (e.g. Candida, Nocardia, citomegalovírus, herpesvírus). Além disso, indivíduos submetidos a terapias que induzem imunossupressão crônica, assim como os que possuem imunodeficiências congênitas, apresentam um aumento de incidência de vários tipos de cânceres, especialmente linfomas e retículo-sarcomas. Embora haja uma incidência elevada de tumores em pacientes imunossuprimidos, o aumento mais drástico ocorre em tumores associados aos vírus oncogênicos (Tabela 2). Tal constatação apoia o conceito de que a vigilância imunológica provavelmente atue mais eficientemente contra os vírus do que contra os tumores (Roitt et al., 1999). Tabela 2: Incidência de tumores em indivíduos com imunodeficiência. Causa da imunodeficiência Tipos de tumores Vírus envolvidos Imunodeficiência congênita Linfoma EBV Linfoma EBV Imunossupressão por Câncer cervical Papilomavírus transplante de órgãos Câncer de Pele Papilomavírus (?) ou por AIDS Hepatoma Vírus da Hepatite B Sarcoma de Kaposi Herpes vírus humano 8 Segundo Roitt et al., 1999

24 7 I.4 Terapia Imunossupressora Somando-se ao interesse em relação à investigação dos efeitos adversos mediados por substâncias imunossupressoras; há um forte ímpeto pelo desenvolvimento de novos fármacos e de esquemas de tratamentos mais seguros e eficazes para a realização de transplantes de órgãos bem sucedidos e tratamento de muitas doenças provocadas por respostas imunológicas aberrantes. No decorrer das duas últimas décadas, houve considerável progresso na identificação de compostos capazes de produzir inibição inespecífica, ou seja, inibição da resposta imunológica independente de qual antígeno a inicia (Roitt et al., 1999). Com base em experimentos realizados com estes compostos em animais, descobriu-se que a resposta imunológica primária é mais facilmente inibida que uma reação secundária ou anamnéstica, ou seja, fármacos eficazes na supressão da resposta imune em animais não sensibilizados, geralmente só exibem atividade inibidora mínima no animal já sensibilizado. Além disso, a eficácia de um agente imunossupressor numa resposta primária depende fortemente do momento de sua administração em relação ao estímulo antigênico inicial. Com isso, agentes imunossupressores inespecíficos dividem-se em três grupos: I. Este grupo inclui formas de tratamento que exercem atividade imunossupressora máxima quando o fármaco é administrado imediatamente antes do antígeno, sendo menos eficaz quando utilizado após o estímulo imunológico. Neste grupo estão incluídos os corticosteróides, a irradiação e a citotoxina ciclo-inespecífica mostarda nitrogenada;

25 8 II. Este grupo inclui fármacos que só possuem atividade imunossupressora quando administrados imediatamente após o estímulo antigênico. Incluem-se aqui os agentes citotóxicos azatioprina (AZP) e o metrotexano (MTX); III. Este grupo inclui fármacos que exibem atividade inibidora quando administrados tanto antes quanto após a estimulação antigênica, entretanto possuem maior atividade imunossupressora após estímulo antigênico. A ciclofosfamida (CFA) constitui o principal agente imunossupressor deste grupo. I.4.1 Corticosteróides Os corticosteróides são hormônios esteróides amplamente utilizados para suprimir as manifestações de diversas reações inflamatórias e imunológicas. As pesquisas clínicas, porém, têm sido quase sempre um tanto confusas devido à dificuldade em reconhecer as diferenças na suscetibilidade à lise de línfócitos induzida por esteróides nas diferentes espécies de animais estudadas (Stites et al., 2000). Sabe-se que em camundongos, coelhos e ratos, estes hormônios provocam extensa destruição linfocitária (Burns et al., 1996), enquanto linfócitos normais de cobaias, macacos e seres humanos mostram-se altamente resistentes à lise. Entretanto, nem todos os linfócitos humanos são resistentes à lise induzida por esteróides. Estes hormônios destroem eficazmente as células da leucemia linfoblástica aguda e exercem efeitos citolíticos moderados sobre as células B neoplásicas na leucemia linfocítica crônica e nos linfomas não-hodgkin.

26 9 Um dos efeitos mais importantes dos corticosteróides consiste em alterar transitoriamente o número de leucócitos circulantes (Figura 1). Observa-se neutrofilia, podendo esta ser provocada por duas vias distintas: i. a liberação de neutrófilos maduros das reservas medulares e/ou, ii. a redução da saída de neutrófilos dos espaços intravasculares para exsudatos inflamatórios, com conseqüente aumento da meia-vida dos neutrófilos circulantes. Figura 1: Efeito de corticosteróides sobre o número de leucócitos circulantes. Segundo Stites et al., 2000 Em contraste com a neutrofilia induzida por corticosteróides, observa-se acentuada linfopenia. Este efeito resulta do seqüestro das células linfóides recirculantes para os tecidos linfóides, incluindo a medula óssea. As células T circulantes são as mais afetadas,

27 10 seguindo-se de uma redução moderada de células B. Entre as subpopulações de células T, há uma maior vulnerabilidade de células CD4 + em relação a células CD8 +. Monocitopenia, via de regra pronunciada, é uma das importantes alterações causadas por esteróides. A reduzida disponibilidade destas células foi considerada de suma importância no processo antiinflamatório mediado por esteróides. Verifica-se também uma redução no número de eosinófilos e basófilos circulantes, entretanto sem significado funcional conhecido até o momento. Além de alterar a distribuição de diferentes populações celulares, os corticosteróides alteram importantes funções de linfócitos e monócitos. A atividade de linfócitos T é consideravelmente afetada. As respostas linfoproliferativas in vitro são inibidas; em parte devido a uma redução na síntese de interleucina-2 (IL-2), essencial para a extenção clonal dos linfócitos ativados. A menor disponibilidade de IL-2 constitui, provavelmente, o resultado indireto da produção suprimida de IL-1 pelos monócitos (Figura 2). Corticosteróides exercem efeitos menores sobre linfócitos B. Pacientes tratados com doses moderadas de prednisona são capazes de responder normalmente a antígenos. Entretanto, a corticoterapia em altas doses reduz moderadamente as concentrações séricas de IgG e IgA. Células NK e efetores da citotoxicidade mediada por anticorpo (ADCC Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) não são significativamente alteradas por corticosteróides.

28 11 Figura 2. Efeito de corticosteróides e da ciclosporina sobre a produção de interleucinas. Segundo Stites et al., 2000 Em relação aos monócitos e macrófagos, os corticosteróides suprimem as atividades bactericidas desta linhagem celular, reduzindo a fagocitose e a resistência do hospedeiro à infecção. Além disso, os corticosteróides também interferem na função destas células como apresentadoras de antígeno. Outros efeitos observados incluem: i. bloqueio da diferenciação de monócitos em macrófagos, ii. diminuição da migração dirigida em resposta a fatores quimiotáticos e iii. supressão da capacidade de monócitos de apresentarem receptores de Fc e do complemento, dificultando ainda mais suas atividades fagocíticas. Atualmente, sabe-se que uma das principais atividades dos corticosteróides parece ser mediada pela diminuição da função do fator nuclear de transcrição Kapa B (NF-kB), que é um regulador comum de genes de diferentes citocinas e moléculas de adesão celular. Um mecanismo recém-descrito passível de contribuir para as propriedades imunossupressoras dos corticosteróides consiste na ligação direta destes hormônios ao NF-

29 12 kb, impedindo a sua entrada no núcleo. Entretanto, há um segundo mecanismo que parece ser ainda mais importante. No citoplasma das células ainda não estimuladas, o NF-kB ligase a uma segunda proteína IkBα, fosforilando-a. Então, após ser liberado, o NF-kB é translocado para o núcleo, onde ativa genes produtores de muitas citocinas. Os corticosteróides parecem aumentar a transcrição do gene que controla a IkBα, resultando em aumento de sua concentração citoplasmática uma situação que promove a sua ligação ao NF-kB. Consequentemente, há uma menor quantidade disponível para penetrar no núcleo e iniciar a transcrição dos genes das citocinas (Figura 3). Em suma, os corticosteróides em doses farmacológicas são capazes de inibir com eficácia um espectro de manifestações clínicas associadas a doenças imunologicamente mediadas. Seus efeitos benéficos resultam de uma associação das atividades imunossupressoras e antiinflamatórias inespecíficas que em numerosas circunstâncias podem salvar a vida do paciente. Entretanto, os corticosteróides apresentam efeitos adversos severos quando utilizados em altas doses e/ou em tratamentos prolongados. Nestes casos as manifestações clínicas incluem: a supressão das supra-renais (pela supressão da secreção do hormônio ACTH), efeitos metabólicos (inibição do crescimento, diabetes, osteoporose), retenção de sal e, até mesmo, psicoses (Katzung & Trevor, 1995). Contudo, as combinações farmacológicas contendo esteróides mostram-se extremamente úteis para suprimir as reações de rejeição de transplantes, bem como para inibir as manifestações das doenças auto-imunes (Stites et al., 2000).