UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE BIOMEDICINA ANTONIO ROBERTO GOMES JUNIOR

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE BIOMEDICINA ANTONIO ROBERTO GOMES JUNIOR ANÁLISE DA VIRULÊNCIA E DE ALTERAÇÕES MORFOMÉTRICAS DE ISOLADOS DE Toxoplasma gondii OBTIDOS DE GALINHAS CAIPIRAS NA REGIÃO METROPOLITANA DE GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL. Goiânia 2018

2 ANTONIO ROBERTO GOMES JUNIOR ANÁLISE DA VIRULÊNCIA E DE ALTERAÇÕES MORFOMÉTRICAS DE ISOLADOS DE Toxoplasma gondii OBTIDOS DE GALINHAS CAIPIRAS NA REGIÃO METROPOLITANA DE GOIÂNIA, GOIÁS, BRASIL. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenação do Curso, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria de Castro. Coorientador: Prof. Dr. Hanstter Hallison Alves Rezende. Goiânia 2018

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4 Dedico esta monografia à minha família pelo apoio incondicional e confiança. Sem vocês nada disso seria possível. Aos amigos que sempre estiveram ao meu lado durante os momentos difíceis e não deixaram esquecer meu propósito.

5 AGRADECIMENTOS Primeiramente quero agradecer aos meus pais (Antonio e Francisca) pela vida e pelo empenho em tudo que se referiu a mim durante minha trajetória até aqui. Sem o apoio incondicional de vocês com certeza nada disso seria possível. Agradeço à toda minha família de uma maneira geral, por ser meu porto seguro de todas as horas, meu refúgio, minha base. Obrigado pelos conselhos, pelas conversas, pelos puxões de orelha, pelas risadas e todos os momentos de descontração. Vocês foram e sempre serão meu bem mais precioso. Agradeço também aos amigos que fiz durante a minha caminhada até aqui, alguns desde que cheguei a Goiânia, outros do ensino fundamental e médio, cursinho, UFG - Jataí, UFG Goiânia e Atlética (principalmente para o meu time esportividade : Mariana, Renata e Amanda). Cada um de vocês faz parte da minha história, do que me tornei e me motiva a seguir em frente. Gostaria de agradecer aos professores que dedicaram seu tempo e conhecimento para minha formação acadêmica, em especial ao professor Thiago Lopes Rocha, que muito me auxiliou nessa reta final, com as tão temidas análises estatísticas. Quero agradecer imensamente ao Laboratório de Estudos da Relação Parasito-Hospedeiro LAERPH, pela experiência das iniciações científicas, fundamentais para a vivência na área da pesquisa acadêmica, às minhas colegas de laboratório pela convivência e aprendizado (Juliana, Geisa, Guará, Nayana, Profa. Marina e Daniela), em especial à Jaqueline, que muito tem auxiliado com a saída do Hânstter, à Jade, pela parceria de Pibic, e à Heloísa, Taynara e Jéssica, pela convivência e parceria no laboratório. Agradeço também a minha orientadora Profa. Ana Maria, pela oportunidade do estágio em seu laboratório, pela confiança que sempre teve em mim e por nunca desistir mesmo quando deixo tudo para a última hora e quase matar todo mundo do coração. Agredeço pela compreensão, pela paciência e por todos os ensinamentos nesses anos de convivência. A senhora é uma inspiração tanto profissional quanto pessoal, um ser humano incrível que tive o prazer de conhecer e de ser orientado. E por fim, um agradecimento especial ao, agora Doutor, Coorientador, Professor, mas acima de tudo, ao amigo Hânstter, que nunca mediu esforços para me auxiliar e que mesmo com a distância sempre esteve presente. Obrigado pela parceria de sempre! Sei que ainda teremos muito trabalho pela frente, mas isso só foi possível por conta de todo trabalho desenvolvido até hoje. Gratidão.

6 O mundo está nas mãos daqueles que têm a coragem de sonhar e de correr o risco de viver seus sonhos. Paulo Coelho

7 RESUMO A toxoplasmose é uma zoonose parasitária causada pelo Toxoplasma gondii, com importância humana e animal por sua elevada prevalência. Há escassez de estudos na literatura avaliando a morfometria e virulência dos isolados de T. gondii, portanto, avaliar os isolados correlacionando o comportamento biológico com as diferenças morfométricas é de suma importância para se compreender melhor o prognóstico da infecção em humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar diferenças morfométricas e a análise da virulência em isolados de Toxoplasma gondii obtidos de galinhas caipiras na região metropolitana de Goiânia, Goiás, Brasil. Os parasitos utilizados no estudo foram previamente isolados de galinhas caipiras por Rezende (2018). Para análise morfométrica foram confeccionadas lâminas a partir do lavado peritoneal de camundongos infectados com cada isolado, fixados e corados pelo Panótico. Os taquizoítos foram fotografados com utilização de fotomicroscópio e as imagens analisadas através do programa Image J para avaliação de diferenças na distância do núcleo ao complexo apical, comprimento longitudinal e largura na altura do núcleo e, posteriormente foram realizadas análises de correlação entre os parâmetros de cada isolado e da cepa padrão RH. Para análise de virulência, foram preparadas cinco diluições dos lavados peritoneais de cada isolado em ordem crescente, a partir de 10 2 parasitos/ml, inoculadas em grupos de três camundongos da linhagem BALB/c e observados diariamente até o óbito. Foram analisados sete isolados com característica de fase aguda, que apresentaram taquizoítos no lavado peritoneal. A morfometria dos taquizoítos obtidos dos isolados foram comparados com a cepa padrão RH e demonstraram diferença significativa em pelo menos uma das variáveis analisadas, e em cinco dos sete isolados analisados houve correlação significativa em pelo menos uma das combinações dos parâmetros morfométricos. Na avaliação da virulência, quatro isolados foram caracterizados como virulentos e três com virulência intermediária, nos quais foram observadas diferenças morfométricas e no padrão de mortalidade em camundongos. O estudo da morfometria e virulência de isolados de T. gondii poderão auxiliar na compreensão da complexa relação parasito-hospedeiro, podendo assim ser relacionada com diferenças na clínica apresentada em infecções em seres humanos. Palavras-chave: Alterações morfométricas, virulência, galinhas caipiras, Toxoplasma gondii.

8 ABSTRACT Toxoplasmosis is a zoonosis caused by Toxoplasma gondii, with human and animal importance due to its high prevalence. There is a shortage of papers in the literature evaluating the morphometry and virulence of T. gondii isolates. Therefore, evaluating the isolates correlating biological behavior with morphometric differences is of paramount importance in order to better understand the prognosis of infection in humans. The objective of this study was to evaluate morphometric differences and the virulence analysis of Toxoplasma gondii isolates collected from hens in the metropolitan region of Goiânia, Goiás, Brazil. The parasites used in the study were previously isolated from hens by Rezende (2018). For morphometric analysis, plates were prepared from the intra-peritoneal fluid of mices infected with each isolate, fixed and stained by Panótico. The tachyzoites were photographed with the use of photomicroscope and the images were analyzed with the Image J software for evaluating differences in distance from the apical complex to the nucleus, longitudinal length, width from the nucleus site and, subsequently, correlation analysis was performed between the parameters of each isolate and the standard RH strain. For virulence analysis, five dilutions of the intra-peritoneal fluids of each isolate were prepared in ascending order from 10 2 parasites/ml, inoculated in groups of three BALB/c mice and observed daily until death. Seven isolates with acute phase characteristics were analyzed, presenting tachyzoites in the intra-peritoneal fluid. The morphometry of the tachyzoites obtained from the isolates were compared with the standard strain RH and showed a significant difference in at least one of the analyzed variables, and in five of the seven isolates analyzed, there was a significant correlation in at least one of the combinations of the morphometric parameters. For virulence analysis, four isolates were characterized as virulent and three with intermediate virulence, in which morphometric differences and in the mortality pattern were observed in mice. The study of the morphometry and virulence of T. gondii isolates may help to understand the complex parasite-host relationship, and may be related to differences in the clinical presentation of human infections. Key words: Morphometric changes, virulence, hens, Toxoplasma gondii.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figura demonstrativa do convívio entre o hospedeiro definitivo (felídeo) e o hospedeiro intermediário (galinha) em propriedade rural, na região metropolitana de Goiânia, Goiás Figura 2 - Roedor Ctenodactyllus gundi, primeiro hospedeiro de onde foi isolado o Toxoplasma gondii Figura 3 - Estágios evolutivos do Toxoplasma gondii Figura 4 - Ciclo evolutivo de Toxoplasma gondii: Figura 5 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados da cepa padrão RH e do isolado TgCkBrGO Figura 6 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolado TgCkBrGO04 e TgCkBrGO Figura 7 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolados TgCkBrGO06 e TgCkBrGO Figura 8 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolados TgCkBrGO10 e TgCkBrGO Figura 9 - Mortalidade de camundongos BALB/c inoculados via intraperitoneal com diferentes concentrações de taquizoítos de Toxoplasma gondii dos isolados virulentos de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, realizada através do teste de Kaplan-Meier (TgCkBrGO05, TgCkBrGO06, TgCkBrGO10, TgCkBrGO13 e cepa padrão RH) Figura 10 - Mortalidade de camundongos BALB/c inoculados via intraperitoneal com diferentes concentrações de taquizoítos de Toxoplasma gondii dos isolados virulentos intermediários de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, realizada através do teste de Kaplan-Meier (TgCkBrGO02, TgCkBrGO04 e TgCkBrGO09)

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Análise morfométrica de isolados de Toxoplasma gondii obtidos de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, em comparação com a cepa padrão RH, realizada através do programa ImageJ Tabela 2 Análise da correlação entre os parâmetros de medida de isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras na região metropolitana de Goiânia, Goiás, demonstrando os valores de R

11 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA HISTÓRICO ETIOLOGIA E CLASSIFICAÇÃO CICLO EVOLUTIVO DO Toxoplasma gondii VARIEDADE GENÉTICA DE Toxoplasma gondii JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS METODOLOGIA ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DO CICLO IN VIVO DOS PARASITOS UTILIZADOS NO ESTUDO: ANÁLISE DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS/CURVAS DE SOBREVIDA: CONFECÇÃO DAS LÂMINAS PARA ANÁLISE MORFOMÉTRICA: ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS ISOLADOS: ANÁLISE ESTATÍSTICA: RESULTADOS E DISCUSSÕES CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 33

12 11 1. INTRODUÇÃO A toxoplasmose é uma zoonose parasitária causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, um coccídeo de importância médica e veterinária. Em seu ciclo biológico, possui como hospedeiro definitivo os felídeos e como hospedeiros intermediários outros animais, como mamíferos e aves (SU et al., 2010; DUBEY et al., 2013). A principal forma de transmissão do parasito é pela ingestão de água e/ou alimentos contaminados com oocistos esporulados e carnes malcozidas com cistos teciduais viáveis. Portanto, a infecção por T. gondii depende principalmente de fatores alimentares e comportamentais. (DUBEY; LAPPIN, 2006; ROSSO et al., 2008; MONCADA; MONTOYA, 2012; AVELINO et al., 2014). O parasito pode se apresentar na forma de taquizoíto, importante na disseminação da infecção e representando a fase aguda; bradizoíto, na forma de cistos nos tecidos, característicos na fase crônica da infecção nos hospedeiros vertebrados e os esporozoítos, presentes nos oocistos eliminados pelas fezes de felídeos infectados. Esta infecção é uma das parasitoses humana e animal mais importante, por sua elevada prevalência, estimando-se que até um terço da população mundial já tenha sido exposta ao T. gondii (DUBEY, 2009). Figura 1 Figura demonstrativa do convívio entre o hospedeiro definitivo (felídeo) e o hospedeiro intermediário (galinha) em propriedade rural, na região metropolitana de Goiânia, Goiás. Fonte: Rezende (2018).

13 12 As galinhas (Gallus gallus) são consideradas indicadoras de contaminação ambiental pelo fato de se alimentarem diretamente no solo, estando assim constantemente expostas à contaminação por oocistos (DUBEY et al., 2003a; ZHU et al., 2008). As galinhas caipiras possuem soropositividade maior que as galinhas criadas de forma intensiva, confirmando a exposição ambiental aos oocistos (DUBEY et al., 2010). Esses animais podem ainda servir como fonte de infecção para humanos, e já foi demonstrada a associação entre a alimentação e manipulação de sua carne, principalmente nas propriedades rurais (Figura 1) (ALVARADO- ESQUIVEL et al., 2009). 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1. HISTÓRICO Toxoplasma gondii foi primeiramente descrito em São Paulo no ano de 1908 por Alfonso Splendore, quando observou que um coelho de laboratório faleceu com paralisia, classificando o parasito como uma espécie do gênero Leishmania (SPLENDORE, 1908; DUBEY, 2008). No mesmo ano na África, Charles Nicolle e Louis Manceaux identificaram estágios do parasito em um roedor da espécie Ctenodactylus gundi (Figura 2), denominando-o de Leishmania gondi. Em 1909 perceberam que haviam descoberto um novo organismo, e o denominaram de Toxoplasma gondii, sendo a palavra Toxoplasma derivada da sua forma em crescente (do grego, toxon = arco e plasma = forma) e gondii derivada do roedor do qual foi identificado (NICOLLE; MANCEAUX, 1908; DUBEY, 2008).

14 13 Figura 2 - Roedor Ctenodactyllus gundi, primeiro hospedeiro de onde foi isolado o Toxoplasma gondii. Fonte: birdsanimals.wordpress.com Apesar de T. gondii ser o parasito com a maior distribuição no mundo e com a maior gama de hospedeiros susceptíveis de acordo com Sabin (1939), baseado em estudos de semelhanças biológicas e imunológicas, há apenas uma espécie no gênero Toxoplasma, dado este confirmando na literatura. (SABIN, 1939; DUBEY, 2008). Na América do Sul, que é considerada um hotspot para a diversidade genética do parasito, acredita-se que os hospedeiros não sejam totalmente adaptados às cepas do parasito e por isso possam apresentar uma clínica mais severa que em outras regiões (DUBEY, 2008; RUDZINSKI et al., 2016; BERTRANPETIT et al., 2017). Isso se deve possivelmente por dois motivos: Primeiro por uma série de recombinações sexuadas que ocorrem nos hospedeiros definitivos, principalmente os silvestres que existem em grande variedade no continente, e também pela manutenção de genes com vantagens seletivas, mas que ainda possuem mesma ancestralidade dos genótipos europeus e norte-americanos (MINOT et. al., 2012) 2.2. ETIOLOGIA E CLASSIFICAÇÃO T. gondii se encontra em três formas infectantes distintas: Taquizoíto, bradizoíto (em cistos teciduais) e esporozoíto (dentro dos oocistos). Ambos os hospedeiros (intermediário e definitivo) são susceptíveis a qualquer um dos três estágios do parasito, sendo capazes de adquirir a infecção tanto horizontal quanto verticalmente. Por via horizontal, a transmissão ocorre pela ingestão de oocistos esporulados presentes no meio ambiente, principalmente na água, pela ingestão de cistos teciduais em carnes cruas e/ou malcozidas, ingestão de alimentos

15 14 embutidos contaminados, por transfusão sanguínea ou transplante de órgãos. Já a transmissão vertical pode ocorrer principalmente pela passagem transplacentária de taquizoítos, mas também pelo aleitamento materno. Assim sendo, o parasito pode ser transmitido entre hospedeiros definitivos e intermediários, independente da presença dos dois tipos de hospedeiros para que o ciclo se estabeleça (SANTOS et. al., 1983; TENTER; HECKEROTH; WEISS, 2000; MONTOYA; LIESENFELD, 2004; DUBEY, 2008; SÁ, 2011). Os taquizoítos (Figura 3-A) representam a forma de multiplicação rápida, podendo ser encontrados dentro do vacúolo parasitóforo de vários tipos celulares. Possuem o formato de lua crescente e medem 2 µm x 6 µm de tamanho. Se multiplicam assexuadamente por meio de endodiogenias repetidas até que a célula se rompa, sendo neste momento onde o parasito pode ser encontrado nos diversos líquidos corporais, evento que causa intensa reação inflamatória e destruição tecidual, gerando as sintomatologias clássicas da toxoplasmose aguda, como febre, cefaleia, mialgia, artralgia e adenomegalia (cervical ou cervical/axilar) (BONAMETTI, A. M., 1997). Após um número desconhecido de divisões, passam para o estágio de bradizoítos, dentro dos cistos tissulares, e essa diferenciação ocorre por fatores endógenos e exógenos do hospedeiro, como imunidade, ph, temperatura e falta de nutrientes (DUBEY et al., 2004c; MONTOYA; LIESENFELD, 2004; SKARIAH; MCINTYRE; MORDUE, 2010). Figura 3 - Estágios evolutivos do Toxoplasma gondii. A) Taquizoítos de Toxoplasma gondii (seta) obtidos de lavado peritoneal de camundongos da linhagem BALB/c, corados por Panótico, em aumento de 1000x. B) Cisto encontrado no cérebro de um camundongo infectado com Toxoplasma gondii, cepa cistogênica ME-49, a fresco entre lâmina e lamínula, ampliação de 400x. C) Oocisto de Toxoplasma gondii esporulado em fezes a fresco, ampliação de 1000x, escala de 10µm. Fonte: Rezende (2018). Os bradizoítos medem de 1,5 µm a 7 µm de tamanho e ficam retidos em cistos tissulares (Figura 3-B) que variam de 5 µm a 70 µm, apresentam uma membrana dupla elástica, contendo de poucos a várias centenas de bradizoítos. Já os cistos são as formas de

16 15 resistência do parasito, permanecem intactos e inofensivos ao longo da vida do hospedeiro. São mais prevalentes nos tecidos musculares e neural, incluindo o cérebro, olhos, músculos cardíaco e esquelético (DUBEY; MILLER; FRENKEL, 1970; DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; TAYLOR et al., 2006). Os oocistos (Figura 3-C) são revestidos por uma dupla membrana que possui formato esférico, com diâmetro de 12 µm, sendo a forma de resistência encontrada no ambiente. São eliminados no meio ambiente por gatos doméstico e felídeos silvestres na forma não esporulada, e no intervalo de cinco dias ocorre o processo de esporulação, em fator de condições de aeração e temperatura adequadas. Os oocisto esporulados contêm dois esporocistos elipsoides com quatro esporozoítas cada, sendo esta a formas infectante, medindo 2 µm de largura por 6 µm de comprimento, em torno de 10 milhões de oocistos são eliminados por um único gato em uma defecação. Estes oocistos (não esporulados) podem sobreviver pelo menos três meses no meio ambiente e conservar sua capacidade de infecção (DUBEY; MILLER; FRENKEL, 1970; DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; WEBSTER, 2010) CICLO EVOLUTIVO DO Toxoplasma gondii O ciclo de T. gondii é bastante complexo (Figura 4), possuindo duas fases distintas: Uma assexuada que pode ocorrer em praticamente todos os tecidos dos diversos hospedeiros intermediários, incluindo o homem; e uma fase sexuada, que ocorre apenas no intestino de seus hospedeiros definitivos, os felídeos. Estes animais se infectam naturalmente por meio da ingestão de alimentos contaminados com oocistos presentes no solo, além da ingestão de roedores infectados com cistos teciduais (pelo hábito da caça), bem como carcaças e vísceras fornecidos pelo homem como forma de alimento (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Com a ingestão de oocistos e/ou cistos teciduais, a parede que reveste estas formas evolutivas são digeridas por enzimas proteolíticas presentes no estômago e no intestino delgado, liberando os esporozoítos e bradizoítos, infectando os hospedeiros vertebrados (DUBEY, 2009).

17 16 Figura 4 - Ciclo evolutivo de Toxoplasma gondii: (1) Felinos são os hospedeiros definitivos; (2) Rompimento de cistos e infecção de células intestinais; (3) Formação de merozoítos; (4,5) Início da fase sexuada com formação de macrogametas e microgametas flagelados de merozoítos; (6) Fusão de micro e macrogametas; (7) Liberação de oocisto no ambiente pelas fezes; (8) Oocistos não esporulados tornam-se infectivos e contaminam o ambiente; (9) Oocistos esporulados podem causar infecção animal via consumo de água e comida contaminada e iniciar a fase assexuada (10,11) Infecção humana ocorre principalmente por ingestão de carne crua ou mal cozida de animais infectados contendo cistos de T.gondii; (12) Multiplicação de taquizoítas no hospedeiro intermediário; (13) Diferenciação de taquizoítas em bradizoítas e formação de cistos em tecidos; (14) Transmissão transplacentária de taquizoítas. Setas longas indicam a transmissão do parasito entre os hospedeiros enquanto que as setas curtas indicam o estágio de desenvolvimento de T.gondii dentro do hospedeiro. Fonte: Adaptado de Duque et. al. (2013) Nos felídeos, as formas infectantes penetram os enterócitos, onde ocorre o processo chamado esquizogonia, uma intensa multiplicação intracelular, que dá origem a milhares de merozoítos que por sua vez penetram em novas células, se transformando em gametócitos, que após um período de maturação formam os microgametas (gametas masculinos) e macrogametas (gametas femininos) (CENCI-GOGA et. al., 2011). Os microgametas, que são móveis, entram nas células epiteliais do intestino do hospedeiro a fim de fecundar os macrogametas (imóveis), formando os zigotos que formarão os oocistos. Milhões de oocistos são liberados para o meio externo através das fezes dos felídeos durante a fase aguda, e entre três a cinco dias após a eliminação apresenta dois esporocistos contendo quatro esporozoítos cada, em um processo denominado esporogonia (REY, 2010).

18 17 Durante a fase assexuada o hospedeiro intermediário (susceptível) se infecta principalmente através da ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos, pelo contato com o solo (podendo ser disseminados por vetores), pela ingestão de cistos tissulares encontrados em carne crua ou mal passada, principalmente as de porco, cabra, carneiro ou carne de caça e mais raramente por taquizoítos presentes no leite de animais contaminados (JONES; DUBEY, 2012). Através da ingestão destas formas evolutivas e por ação do suco gástrico, as formas infectantes (no caso dos bradizoítos e esporozoítos) são liberadas no organismo do hospedeiro, sofrendo diferenciação para taquizoítos e, após a fase proliferativa que se inicia no interior do vacúolo parasitóforo, são liberados novos taquizoítos que buscam penetrar novamente nas mais variadas células do organismo, reiniciando o ciclo (SKARIAH et. al., 2010) VARIEDADE GENÉTICA DE Toxoplasma gondii Em estudos realizados nos Estados Unidos e na Europa foi demonstrada a existência de três tipos clonais principais: Tipo I, II e III (DARDÉ; BOUTEILLE; PESTRE- ALEXANDRE, 1992; HOWE; SIBLEY, 1995; AJZENBERG et al., 2002; SU; ZHANG; DUBEY, 2006). Neste contexto, a variedade genética entre as cepas de T. gondii representava apenas em 1%, considerando que a progênie do parasito teria se expandido nos últimos anos, originando uma população extremamente clonal (AJIOKA; FITZPATRICK; REITTER, 2001; ROBERT-GANGNEUX; DARDE, 2012) Estas três linhagens possuem uma ampla distribuição geográfica, sendo capazes de infectar diferentes espécies animais, incluindo o homem. As cepas do tipo I estão associadas à ocorrência da toxoplasmose humana congênita, e apresentam virulência aguda em camundongos; cepas do tipo II associam-se aos casos de reativação da infecção crônica em humanos; e cepas do tipo III estão mais relacionadas às infecções animais (HOWE; SIBLEY, 1995; DUBEY et al., 2002). A explicação para a existência de uma população clonal envolvia diversos mecanismos. Primeiramente, a transmissão através da alimentação, que pode ocorrer com estágios intermediários do desenvolvimento do parasito, não sendo assim o ciclo sexual obrigatório (TENTER; HECKEROTH; WEISS, 2000; SIBLEY et al., 2009), bem como macrogametas infertilizados podem se diferenciar em oocistos, a fim de completar o ciclo no intestino do hospedeiro definitivo (felídeos), pelo processo de partenogênese (FERGUSON,

19 ). Além disso, pelo fato da coinfecção por várias cepas fosse muito rara, a complexidade genética limitada se mantinha, fazendo com que os felídeos liberassem oocistos com descendência genética idêntica. Portanto, para que felídeos pudessem liberar oocistos com características genéticas mistas, seria necessária uma ingestão de cepas de genótipos distintos, dentro de um intervalo de tempo bem reduzido (AJZENBERG et al., 2004; SIBLEY et al., 2009). No entanto, a partir de uma série de genotipagens (multilocal e multicromossomal) de isolados de T. gondii no mundo todo, revelou-se uma estrutura populacional bastante complexa (AJZENBERG et al., 2004; LEHMANN et al., 2004). Para mais, com a evolução das técnicas moleculares, bem como a utilização de microssatélites e análise de polimorfismos de fragmentos de DNA, a teoria da clonalidade foi desconsiderada, uma vez que estudos mais aprofundados demonstraram uma elevada diversidade genética entre as cepas de T. gondii, sobretudo pela detecção de cepas atípicas (BRANDÃO et al., 2006; LEHMANN et al., 2006; PENA et al., 2008). Na América do Sul, a grande maioria dos isolados não se encaixa em nenhum dos três arquetipos principais, com excessão do Tipo III, que é cosmopolita (KHAN et al., 2007; PENA et al., 2008). No Brasil, apesar de ser mais comum e endêmica a presença de halogrupos, é bem esclarecido que frequentes trocas gênicas tem gerado uma ampla diversidade genotípica (AJZENBERG et al., 2004; PENA et al., 2008). Novos genótipos vêm sendo constantemente identificados em várias espécies animais, demonstrando assim uma elevada variabilidade genética de T. gondii, enquanto que o Tipo II se mantém muito raro no continente latino americano (AJZENBERG et al., 2004; PENA et al., 2011). Quando observado na região selvagem da Amazônia, esses níveis aumentam, ainda mais pela presença de polimorfismos únicos (AJZENBERG et al., 2004). Portanto, o conhecimento dessas linhagens atípicas é de suma importância, tendo em vista que podem ser responsáveis por infecções graves até mesmo em indivíduos imunocompetentes, causando pneumonia, miocardite, meningoencefalite ou polimiosite (ROBERT-GANGNEUX; DARDE, 2012).

20 19 3. JUSTIFICATIVA Trabalhos avaliando a morfometria de isolados de T. gondii correlacionando aos resultados de virulência são escassos na literatura. Assim sendo, avaliar os isolados obtidos na região metropolitana de Goiânia, correlacionando o comportamento biológico (análise da virulência) com as diferenças morfométricas poderá ser de suma importância para se compreender melhor o prognóstico da infecção em humanos. Para o estudo de isolados de outros animais, como as galinhas caipiras, podem ser utilizados animais experimentais, como os camundongos. A alteração do comportamento biológico do parasito nestes animais varia de acordo com suas características genéticas: Enquanto certos genótipos são letais para qualquer linhagem de camundongo, outros genótipos podem apenas estabelecer infecção crônica. Portanto, o conhecimento das características moleculares, biológicas e genéticas de T. gondii se faz necessário para a compreensão da complexa relação parasito-hospedeiro, e a determinação da virulência do isolado em camundongos poderá auxiliar na predição da infecção em humanos (SARAF et al., 2017).

21 20 4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GERAL Realizar a análise da virulência de isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras na região metropolitana de Goiânia, Goiás, Brasil e correlacionar os dados morfométricos aos do comportamento biológico OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Caracterizar morfometricamente os isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras da região metropolitana de Goiânia, Goiás, Brasil. - Pesquisar a existência de diferenças morfométricas dos parâmetros isolados, em comparação com a cepa padrão RH e entre os parâmetros de cada isolado de T. gondii obtidos de galinhas caipiras da região metropolitana de Goiânia, Goiás, Brasil, além da cepa padrão RH. - Determinar a virulência dos isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras da região metropolitana de Goiânia, Goiás, Brasil, a partir de ensaios em camundongos da linhagem BALB/c.

22 21 5. METODOLOGIA 5.1. ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DO CICLO IN VIVO DOS PARASITOS UTILIZADOS NO ESTUDO: Os parasitos utilizados neste estudo foram previamente isolados de galinhas caipiras obtidas em diferentes propriedades da região metropolitana de Goiânia, Goiás (REZENDE, 2018). Foram utilizados camundongos machos e/ou fêmeas da linhagem Swiss, com aproximadamente dois meses de idade, provenientes do Biotério Central do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Os camundongos foram acompanhados diariamente, para observação de sinais de toxoplasmose aguda, bem como letargia, pelo arrepiado, e diarreia. Os animais sintomáticos foram sacrificados e realizado o lavado intraperitoneal com salina, para a observação de taquizoítos. Os lavados quando positivos foram novamente inoculados por via intraperitoneal, em um outro grupo de camundongos, para a manutenção do isolado. Os camundongos que não apresentaram sinais agudos de infecção foram eutanasiados após 60 dias de inoculação, sendo realizada a sorologia por Imuno-Fluorescência Indireta (IFI) para confirmação da soroconversão, e a pesquisa de cistos teciduais contendo brazoítos do T. gondii em fragmentos de cérebro, para confirmar a infecção. Os isolados foram nomeados segundo normas definidas previamente no Toxoplasma Centennial Congress (Buzios, RJ, 2009) como TgCkBrGO 01 até 15 (Tg = Toxoplasma gondii; Ck = Chicken; Br = Brasil; GO = Goiás) ANÁLISE DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS / CURVAS DE SOBREVIDA: Para avaliar a virulência das cepas, foram preparadas diluições dos lavados peritoneais de cada isolado em ordem crescente, sendo 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 e 10 6 taquizoítos/ml. A contagem foi realizada em câmara de Neubauer, adicionando-se 10μL entre a câmara e lamínula. Posteriormente, foram contados os taquizoítos presentes em cinco quadrantes (cantos e central), a fim de estabelecer uma média e estimar a quantidade de parasitos por ml e preparar as diluições. De cada diluição, foi inoculado 1,0 ml/camundongo em um grupo de três animais da linhagem BALB/c que foram observados diariamente até o óbito (SARAF et al., 2017). Com os resultados dos intervalos de óbito, foram delineadas curvas de virulência de cada isolado e comparadas com a curva da cepa padrão (RH), obtida seguindo o mesmo protocolo proposto para os isolado, para se estabelecer o comportamento biológico dos isolados.

23 CONFECÇÃO DAS LÂMINAS PARA ANÁLISE MORFOMÉTRICA: Após a manutenção do parasito em camundongos (in vivo), foram confeccionadas lâminas a partir do lavado peritoneal de cada isolado que apresentou taquizoítos. Os esfregaços foram realizados com uma gota de aproximadamente 25μL do lavado, espalhados delicadamente e secos em estufa (24 horas à 25 ºC) para fixação. Posteriormente foi realizada a coloração pelo Panótico conforme orientação do fabricante (Instant Prov, Pinhais, PR, Brasil) ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS ISOLADOS: Os taquizoítos foram fotografados com utilização de fotomicroscópio Zeiss acoplado a uma câmera digital Sony para registro e digitalização dos resultados obtidos. As imagens foram analisadas através do programa Image J a partir da avaliação de características morfológicas dos parasitos como: distância entre núcleo e complexo apical, diferenças no comprimento longitudinal e largura na altura do núcleo. Estes parâmetros foram avaliados nos isolados e na cepa controle (RH). Para cada analise foram utilizados aproximadamente 100 taquizoítos do mesmo isolado e os valores de cada parâmetro foi salvo em planilha para calcular médias das medidas dos isolados. Não foi realizada a análise da morfometria das cepas cistogênicas ANÁLISE ESTATÍSTICA: Os dados morfométricos dos isolados foram comparadas com os da cepa padrão através do programa Sigma Stat 3.2, todas as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea, utilizando o teste t. Em seguida foram realizadas análises de correlação e regressão linear entre os parâmetros de cada isolado e da cepa padrão RH (Distância Núcleo-Complexo Apical x Comprimento, Distância Núcleo-Complexo Apical x Largura e Comprimento x Largura), através do programa GraphPad Prims, obtendo a equação da reta e os valores de R 2 e de p (p-value). As curvas de virulência foram analisadas por meio do teste de Kaplan-Meier através do programa SPSS (SPSS, INC.), onde foi comparada a taxa de sobrevida entre os camundongos inoculados com os isolados e a cepa padrão. Os gráficos das regressões e das curvas foram construídos no programa GraphPad Prism. Foram consideradas diferenças significativas quando p<0,05.

24 23 6. RESULTADOS E DISCUSSÕES A partir dos bioensaios realizados com amostras de tecidos de galinhas soropositivas, foi possível a obtenção de 15 isolados (31,3%), destes, oito apresentaram taquizoítos no lavado peritoneal em camundongos com sintomatologia aguda (letargia, pelo arrepiado, e diarreia) e sete isolados foram confirmados em camundongos assintomáticos, pela visualização de cistos teciduais, após 30 dias da inoculação e realização da necropsia. Foi possível realizar a análise morfométrica e de virulência em 7/8 isolados de característica aguda, por apresentarem taquizoítos no lavado peritoneal, utilizando a comparação com a cepa padrão RH. Assim, foi encontrada diferença significativa em pelo menos uma das variáveis analisadas em cada isolado, como demonstrado na Tabela 1. Tabela 1 - Análise morfométrica de isolados de Toxoplasma gondii obtidos de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, em comparação com a cepa padrão RH, realizada através do programa ImageJ. Isolado Distância núcleocomplexo apical (µm) Comprimento (µm) Largura (µm) Cepa padrão RH 2,29 ± 0,76 10,42 ± 1,13 2,12 ± 0,31 TgCkBrGO02 2,67 ± 0,63 10,09 ± 1,23 2,26 ± 0,38* TgCkBrGO04 3,06 ± 0,69* 10,81 ± 1,13 2,24 ± 0,40* TgCkBrGO05 2,67 ± 0,56* 10,50 ± 1,25 2,14 ± 0,40 TgCkBrGO06 3,04 ± 0,42 10,85 ± 0,60 2,19 ± 0,19* TgCkBrGO09 2,59 ± 0,58 9,89 ± 0,94 2,26 ± 0,27* TgCkBrGO10 2,50 ± 0,65* 10,76 ± 0,86 2,18 ± 0,32 TgCkBrGO13 2,50 ± 0,72* 9,72 ± 1,08* 2,03 ± 0,30 Os valores representam média ± desvio padrão de medidas; * p 0,05 (Teste t) comparando as cepas isoladas com a cepa padrão RH. A partir destes dados morfométricos, novas análises estatísticas foram realizadas, observando se haveria correlação entre as medidas dos parâmetros de cada isolado e da cepa padrão RH: Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento, Distância do núcleo ao complexo apical x Largura e Comprimento x Largura. Assim, foi possível observar que dos sete isolados analisados, cinco apresentaram correlação em pelo menos uma das combinações investigadas (Tabela 2).

25 24 Tabela 2 Análise da correlação entre os parâmetros de medida de isolados de T. gondii obtidos de galinhas caipiras na região metropolitana de Goiânia, Goiás, demonstrando os valores de R 2. R 2 Isolado Distância Núcleo Complexo Apical x Comprimento (µm) Distância Núcleo Complexo Apical x Largura (µm) Comprimento x Largura (µm) Cepa padrão RH 0,08122* 0, , TgCkBrGO02 0,4151* 0,2365 0,2451 TgCkBrGO04 0, , ,1488** TgCkBrGO05 0, , ,303** TgCkBrGO06 0,4151* 0, ,1793 TgCkBrGO09 0,2266 0, ,1273 TgCkBrGO10 0,0993 0, , TgCkBrGO13 0,09458* 0, ,08296* Os valores representam o valor de R 2 das regressões entre as medidas dos parâmetros dos isolados e da cepa padrão RH; Em negrito os resultados que apresentaram significância; * p<0,05, com intervalo de confiança de 95%; ** p<0,0001, com intervalo de confiança de 99%; Os isolados TgCkBrGO04 e TgCkBrGO05 demonstraram forte correlação quando comparados os parâmetros Comprimento x Largura (p<0,0001) (Figura 6E e 6F). O isolado TgCkBrGO13 apresentou correlação significativa quando avaliadas as medidas da Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento (Figura 8B) e Comprimento x Largura (Figura 8F), enquanto os isolados TgCkBrGO02, TgCkBrGO06 expressaram correlação entre as medidas da Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento (Figuras 5B e 7A). Resultado semelhante ao dos isolados TgCkBrGO02, TgCkBrGO06 foi encontrado com a análise da cepa padrão RH, que também apresentou correlação entre as medidas da Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento (Figura 5A). Os isolados TgCkBrGO09 e TgCkBrGO10 não demonstraram nenhum tipo de correlação entre os parâmetros analisados.

26 Figura 5 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados da cepa padrão RH e do isolado TgCkBrGO02. A e B) Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento; C e D) Distância do núcleo ao complexo apical x Largura; E e F) Comprimento x Largura; OBS: A diferença observada nas quantidades de taquizoítos analisados para a avaliação da morfometria se deve basicamente ao parasitismo que cada isolado pode apresentar. Enquanto já é conhecido o elevado parasitismo da cepa padrão RH, sendo possível a obtenção de grande quantidade de taquizoítos no lavado, outros isolados podem apresentar um parasitismo menor, dificultando a obtenção de taquizoítos para confecção das lâminas e das imagens, sendo assim, menor quantidade de taquizoítos analisados. 25

27 26 Figura 6 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolado TgCkBrGO04 e TgCkBrGO05. A e B) Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento; C e D) Distância do núcleo ao complexo apical x Largura; E e F) Comprimento x Largura;

28 27 Figura 7 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolados TgCkBrGO06 e TgCkBrGO09. A e B) Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento; C e D) Distância do núcleo ao complexo apical x Largura; E e F) Comprimento x Largura;

29 28 Figura 8 Análise de regressão linear entre os parâmetros morfométricos analisados dos isolados TgCkBrGO10 e TgCkBrGO13. A e B) Distância do núcleo ao complexo apical x Comprimento; C e D) Distância do núcleo ao complexo apical x Largura; E e F) Comprimento x Largura;

30 29 Da Silva et al. (2018), após a avaliação de três isolados obtidos de gestantes e recémnascidos observaram diferenças estatísticas nas medidas de área e maior diâmetro em um dos isolados, em comparação com a cepa padrão RH, em nosso estudo também foi possível verificar que todos os isolados analisados apresentaram diferenças morfométricas em pelo menos um dos parâmetros utilizados seja na distância do núcleo ao complexo apical, comprimento ou largura, corroborando assim com os dados da literatura. Foi possível também observar a existência de correlação entre os parâmetros dos isolados quando analisados entre si, podendo ser este um indicativo para uma possível associação entre as variações morfométricas com o comportamento biológico dos isolados. Estes achados não são descritos na literatura para o T. gondii, reforçando a ideia de que, bem como variações genéticas e diferenças no comportamento biológico, existem variações no padrão da morfometria (SILVA et al., 2018), e a relação entre estes parâmetros podem estar associados com a virulência das cepas. Na avaliação da virulência, os isolados TgCkBrGO05, TgCkBrGO06, TgCkBrGO10 e TgCkBrGO13 apresentaram 100% de mortalidade com o inóculo de 10 2 em até 10 dias após infecção, sendo assim caracterizados como isolados virulentos. Os camundongos infectados com os demais inóculos destes quatro isolados apresentaram 100% de mortalidade em até 11 dias, sendo mais virulentos que a própria cepa padrão RH, que apresentou 100% de mortalidade em 12 dias com todos os inóculos (Figura 9). Os isolados TgCkBrGO02, TgCkBrGO04 e TgCkBrGO09 foram caracterizados com virulência intermediária, pois a mortalidade dos camundongos variou de acordo com a concentração do inóculo utilizado, sendo as menores concentrações não letais. Com os animais sobreviventes foi realizada a IFI do soro, a partir de punção cardíaca, após 60 dias de infecção, sendo todos soro não-reagente (SNR). Posteriormente, foi feita a pesquisa e visualizados cistos teciduais no cérebro destes camundongos, confirmando a infecção crônica. (Figura 10).

31 Figura 9 - Mortalidade de camundongos BALB/c inoculados via intraperitoneal com diferentes concentrações de taquizoítos de Toxoplasma gondii dos isolados virulentos de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, realizada através do teste de Kaplan-Meier (TgCkBrGO05, TgCkBrGO06, TgCkBrGO10, TgCkBrGO13 e cepa padrão RH). 30

32 31 Figura 10 - Mortalidade de camundongos BALB/c inoculados via intraperitoneal com diferentes concentrações de taquizoítos de Toxoplasma gondii dos isolados virulentos intermediários de galinhas caipiras, na região metropolitana de Goiânia, Goiás, realizada através do teste de Kaplan-Meier (TgCkBrGO02, TgCkBrGO04 e TgCkBrGO09). Com essas características observadas sugere-se que existam diferenças fenotípicas mesmo dentro de um único genótipo. Um resultado semelhante foi descrito na China avaliando comportamento fenotípico do genótipo 9 (WANG, 2013). A identificação desses isolados indica que podem existir outros vários genótipos no ambiente que ainda são totalmente desconhecidos, de forma que não se sabe o real risco de infecção tanto em animais quanto em humanos (REZENDE, 2018), e as diferenças levantadas neste estudo podem estar relacionadas com a sintomatologia da infecção.

33 32 7. CONCLUSÕES Nos isolados analisados foi possível verificar diferenças significativas no padrão de virulência, dos quais os isolados TgCkBrGO05, TgCkBrGO06, TgCkBrGO10 e TgCkBrGO13 foram caracterizados virulentos, sendo mais elevada que a própria cepa padrão RH, enquanto que os isolados TgCkBrGO02, TgCkBrGO04 e TgCkBrGO09 foram caracterizados com virulência intermediária. A partir da análise morfométrica dos taquizoítos foram detectadas diferenças significativas em pelo menos uma das variáveis analisadas, tanto quando comparados com os da cepa padrão RH, quanto na análise dos parâmetros entre si. Portanto, a associação dos estudos morfométricos à análise da virulência demonstra que existem diferenças fenotípicas dentro de um mesmo genótipo, o que pode significar uma adaptação do parasito ao hospedeiro, relação esta que deve ser melhor compreendida para que estas informações possam ser relacionadas ao prognóstico da infecção nos seres humanos.

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