IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DOMÍNIOS TNP1 E TNP2 DO ELEMENTO TRANSPONÍVEL CACTA EM TRANSCRITOS DE FEIJÃO-CAUPI

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1 Área: Biotecnologia IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DOMÍNIOS TNP1 E TNP2 DO ELEMENTO TRANSPONÍVEL CACTA EM TRANSCRITOS DE FEIJÃO-CAUPI Bruna Piereck Moura 1 ; Luis Carlos Belarmino 1 ; Lidiane Lindinalva Barbosa Amorim 1, João Pacifico Bezerra Neto 1 ; Ana Carolina Wanderley Nogueira 1 ; Valesca Pandolfi 1 ; Ana Cristina Brasileiro-Vidal 1 ; Ana Maria Benko-Iseppon 1 1 Biólogo, Pesquisador, Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética Av. Professor Moraes Rego, 1235, , Recife - PE, Brasil. brunapiereck@yahoo.com.br Resumo- Elementos transponíveis (TEs) são abundantes nos genomas e possuem interação com genes, sendo seu conhecimento essencial para uma boa anotação dos genomas e para um melhor conhecimento sobre seu potencial na geração de polimorfismos em estudos genéticos. CACTA é uma das famílias de TEs que se mostrou abundante em feijão-caupi, sendo as enzimas TNP1 e TNP2 juntas responsáveis pela sua transposição. Domínios dessas enzimas foram observados em sequências genômicas de feijão-caupi, demandando a averiguação no banco de ESTs desta espécie, potencialmente indicando a provável atividade desses elementos. O presente estudo revelou apenas um domínio completo de TNP2 no banco de ESTs, observando-se uma completa ausência de domínios semelhantes a TNP1. Tal constatação indica baixa ou nenhuma atividade destes TEs em feijãocaupi. Tais dados serão reamostrados em breve após a reclusterização do banco de feijão-caupi, com o acréscimo de bibliotecas de RNAseq, permitindo uma avaliação mais segura face à grande abundância de dados disponíveis em breve. INTRODUÇÃO Elementos transponíveis (TEs) são sequências de DNA abundantes na maioria dos genomas (KWON et al., 2005), capazes de migrar de uma região genômica a outra se inserindo próximo ou mesmo no interior de genes. Durante esse processo, os TEs podem transportar fragmentos de genes ou genes completos, muitas vezes gerando mutações sendo, portanto, um produtor ativo de variabilidade genética e agente na formação de novos genes. Existem evidências de que os TEs também participam da regulação da expressão gênica, sendo, portanto, seu conhecimento essencial para uma boa anotação genômica e entendimento de suas interações com os genes (DU et al.,2010). Geralmente, TEs são classificados segundo seu mecanismo de transposição em dois grandes grupos: TEs da Classe I, ou retrotransposons, que se movimentam por intermédio de sua transcrição em RNA, gerando cópias que se inserem em outras regiões. Por sua vez, TEs da Classe II, ou transposons, se movimentam diretamente via DNA, retirando-se de uma região e inserindo-se em outra (PING-FANG, 2006), de uma forma de transposição considerada conservativa. Uma das famílias de elementos da Classe II é nomeada segundo o motivo de nucleotídeos 'CACTA', conservado em suas repetições terminais invertidas (Terminal Inverted Repeats, TIRs). A família CACTA possui caracteristicamente TIRs que variam entre 10 e 30 pb, duplicações de sítios alvo (Target Site Duplication, TSD) 1

2 com apenas 3 pb e regiões subterminais (Subterminal Repeats, STR) com repetições diretas e inversas (TAKAHASHI et al., 2012). A depender da presença de regiões codificantes para duas transposases (TNPs), a família CACTA pode conter elementos autônomos, que possuem regiões codificantes para as transposases TNP1/TNPA e TNP2/TNPD (principais TNPs dessa família) e não autônomos, nos quais uma ou ambas estão ausentes, sendo necessário o uso da transposase de um elemento autônomo e ativo para sua movimentação (WANG et al., 2003; KWON et al., 2005; PING-FANG, 2006). Acredita-se que ambas as transposases sejam necessárias para promover a migração do elemento, entretanto, vários estudos registraram um maior nível de RNAm codificantes para a TNP1 (MASSON et al.,1991; WANG et al.,2003). Dado que o elemento CACTA foi um dos mais abundantes em estudos anteriores no genoma disponível de feijão-caupi, a identificação dos genes relacionados à suas enzimas pode indicar a presença de elementos ativos neste organismo. Material e Métodos sequências de feijão-caupi foram compiladas do NCBI para compor um banco de dados local, sendo processadas usando-se um script desenvolvido em PERL e montadas usando CAP3 com os parâmetros padrão objetivando formar um banco de dados local. Em seguida foram baixadas sequências de transposons classe II provenientes do SoyTEdb.org (Soybean Transposable Element Database) para uso como sondas (seed sequences) em uma busca tblastx contra o banco local, resultando em sequências candidatas de feijão-caupi. Os candidatos foram posteriormente submetidos a um BLASTn contra o banco de SoyTEdb.org possibilitando a primeira classificação comparativa de TEs relacionados entre feijão-caupi e soja. A seguir realizou-se um BLASTn dos candidatos a TE de feijão-caupi contra o banco local permitindo a identificação de elementos mais distantemente relacionados. Todos os candidatos identificados foram submetidos a um BLASTx contra o banco de dados nr-protein do NCBI com anotação automática gerada pelo programa AutoFACT seguida de seleção manual. O grupo final de TEs teve suas ORFs identificadas pelas ferramentas ORFfinder (ncbi.nlm.nih.gov) e EMBOSS (ebi.ac.uk/tools), sendo seus domínios conservados determinados pelo CDSearch Batch (ncbi.nlm.nih.gov). Dentre as sequências com domínios identificados, foram escolhidas as de TNP1 e TNP2 para mineração no banco de ESTs (NordEST) através de um tblastn. Os candidatos de TNP1 e TNP2 tiveram suas ORFs inferidas também pelo ORFfinder e tiveram seus domínios conservados evidenciados pelo CDSearch. Vale ressaltar que o banco de dados NordEST está sendo atualizado e reclusterizado, permitindo, em breve, uma melhora quantitativa e qualitativa dos dados aqui apresentados. Resultados e Discussão Após processadas, as sequências compiladas foram submetidas a uma montagem pelo CAP3 compuseram sequências únicas, representadas por contigs e singlets. As buscas por método baseado em homologia com soja fizeram uma primeira determinação da abundância de TEs classe II em feijão-caupi onde representantes de todas as famílias de elementos transponíveis classe II puderam ser 2

3 encontradas (Figura 1), entre os quais a família CACTA, que está entre os mais abundantes em feijão-caupi e que, por isso, foram selecionadas para análises complementares. Entre os domínios conservados foram observados domínios completos e incompletos referentes às transposases de cinco famílias classe II (Figura 2). Das quais, Transposase_23 superfamília (TNP1), com apenas um representante incompleto na região N (amino) foi encontrado e Transposase_21 superfamília (TNP2), com 26 representantes sendo apenas cinco com domínio completo. Além desses, outros domínios não representativos de TEs foram encontrados na sua vizinhança e, tendo em vista que essa família possui interação com genes (LI, 2009), estes podem relacionar-se em algum aspecto como fragmentos capturados, por exemplo. Figuram entre estes o grupo das Pkcs (kinases) com 188 representantes, LRR (repetição rica em leucina) com 60 representantes eap2 (fator de transcrição) com 36 representantes. Figura 1: Comparação da prevalência de elementos transponíveis classe II em Vigna unguiculata e Glycine max. Ao contrário de outros organismos estudados, nos quais TNP1 era o transcrito mais abundante (MASSON, 1991), em feijão-caupi nenhuma sequência similar foi encontrada no banco de ESTs, sendo possível que isso ocorra devido ao número limitado de sequências usadas como sonda (uma única sonda de TNP1) e ao fato de que a sonda usada tem domínio incompleto. Com a disponibilização de novas sequências de feijão-caupi nos bancos de dados, melhores análises poderão em breve ser realizadas para confirmar ou não essa possibilidade. A enzima TNP2 teve apenas um domínio completo identificado no banco de ESTs, com 913 nucleotídeos, muito menor do que já descrito anteriormente onde TNP2/TNPD foi descrita com mais ou menos 2 kb (MASSON, 1991), mostrando que dentre as sequências até então conhecidas de feijão-caupi é improvável a existência de elementos CACTA ativos especulando-se que a quantidade de elementos transponíveis inativos provavelmente é maior que a de elementos ativos. Sendo assim a busca por TEs a partir de características estruturais pode levar a um resultado quantitativo mais acurado, podendo fornecer parâmetros para o desenvolvimento de marcadores moleculares para fins de mapeamento e posteriormente para inferências de seleção assistida por marcadores. 3

4 Figura 2: Quantidade de domínios completos e incompletos das transposases das famílias de TE classe II identificados. Família PIF (PIF1), família Mutator (MULE superfamília; ZnF_PMZ superfamília; DBD_Tnp_Mut superfamília), família CACTA (Transposase_21 superfamília; Transposase_23 superfamília; Transposase_24 superfamília), família Helitron (Helitron_like_N superfamília) e família hat (Dímer_Tnp_hAT superfamília). Conclusão O estágio atual das pesquisas indica uma baixa prevalência ou mesmo ausência de elementos CACTA no feijão-caupi, com a observação apenas de sequencias com o domínio TNP2 e uma completa ausência de domínios semelhantes a TNP1. Porém, são necessárias análises de um maior número de transcritos para que os resultados sejam conclusivos, bem como um refinamento das metodologias baseadas em características estruturais não codificantes conservadas, como TIRs, TSD, STR, dos elementos CACTA. Referências DU, J.; GRANT, D.; ZHIXI, T.; NELSON, R. T.; LIUCUN, Z.; SHOEMAKER, R. C.; JIANXING, M. SoyTEdb: A comprehensive database of transposable elements in the soybean genome. BMC Genomics, v. 11 Special section p , KWON, S-J.; PARK, K-C.; KIM, J-H.; LEE, J. K.; KIM, N. Rim 2/Hipa CACTA transposon display; A new genetic marker technique in Oryza species. BMC genetics, v. 6, p , QING, L.; JING-RUI, D.; JIAN-SHENG, L.; JIANG-BING, Y. Identification and characterization of CACTA transposable elements capturing gene fragments in maize. Chinese Science Bulletin. v. 54, p , 2009 MASSON, P.; STREM, M.; FEDOROFF, N. The tnpa and tnpd gene products of the Spm element are required for transposition in tobacco. The plant cell, v. 3, p , PING-FANG, T. Progress in Plant CACTA Elements. Acta Genetica Sinica, v. 33, p ,

5 TAKAHASHI, R.; MORITA, Y.; NAKAYAMA, M.; KANAZAWA, A.; ABE, J. Na active CACTA-Family Transposable Element is Responsible for Flower Variegation in Wild Soybean Glycine soja. The plant Genome, v. 5, p , WANG, G-D.; TIAN, P. F.; CHENG, G. W.; JIANG, J. M.; LI, D-B.; HE, Z. H. Genomic characterization of Rim2/Hipa element reveals a CACTA-like transposon superfamily with unique features in the rice genome. Mol. Gen. Genomics, v. 270, p , WICKER, T.; SABOT, F.; HUA-VAN, A.; BENNETZEN, J. L.; CAPY, P.; CHALHOUB, B.; FLAVELL, A.; LEROY, P.; MORGANTE, M.; PANAUD, O.; PAUX, E.; SANMIGUEL, P. E SCHULMAN, A. H. A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nat. Rev. Genet., v. 8, p ,