UTILIZAÇÃO DE DOSES REDUZIDAS DA ecg NA INDUÇÃO DE ESTRO APLICADAS PELA VIA SUBMUCOSA VULVAR EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS UTILIZAÇÃO DE DOSES REDUZIDAS DA ecg NA INDUÇÃO DE ESTRO APLICADAS PELA VIA SUBMUCOSA VULVAR EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS KARLA DIAS ANTUNES 2012

2 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS KARLA DIAS ANTUNES UTILIZAÇÃO DE DOSES REDUZIDAS DA ecg NA INDUÇÃO DE ESTRO APLICADAS PELA VIA SUBMUCOSA VULVAR EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agroecossistemas, área de concentração Produção em Agroecossistemas, para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Prof. Dr. Veronaldo Souza de Oliveira. Co-orientador: Prof. Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos SÃO CRISTOVÃO SERGIPE BRASIL 2012

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE A636u Antunes, Karla Dias Utilização de doses reduzidas da ecg na indução de estro aplicadas pela via submucosa vulvar em ovelhas da raça Santa Inês / Karla Dias Antunes ; orientador Veronaldo Souza de Oliveira. São Cristóvão, f. ; il. Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) Universidade Federal de Sergipe, O 1. Ovinocultura. 2. Inseminação artificial. 3. Ovino. 4. Aplicação via submucosa vulvar. 5. Hormônio. 6. Estresse. I. Oliveira, Veronaldo Souza de, orient. II. Título CDU:

4 KARLA DIAS ANTUNES UTILIZAÇÃO DE DOSES REDUZIDAS DA ecg NA INDUÇÃO DE ESTRO APLICADAS PELA VIA SUBMUCOSA VULVAR EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS APROVADA em 23 de fevereiro de Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agroecossistemas, área de concentração Produção em Agroecossistemas, para obtenção do título de Mestre em Ciências. Prof. Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos UFS (Co-orientador) Prof. Dr. Hymerson Costa Azevedo Embrapa Tabuleiros Costeiros Prof. Dr. Veronaldo Souza de Oliveira UFS (Orientador) SÃO CRISTOVÃO SERGIPE BRASIL

5 A meu avô José Dias da Costa (in memória), um homem inteligente e bem sucedido que me apoiou com muito carinho e preocupação nesta trajetória árdua. DEDICO

6 AGRADECIMENTOS Á Deus por me encorajar nos momentos em que me sentia fragilizada, por nunca me desamparar, por me amar tanto, e por me guiar à conclusão de mais uma preciosa etapa de minha vida; A meus pais Joscelina Dias Antunes e Raimundo Nonato Antunes, que me orientaram para a vida e que, com dedicação, confiança e amor, proporcionaram-me a realização deste sonho: AMO VOCÊS! Aos meus irmãos, Erick Dias Antunes e Fabricio Dias Antunes pelo apoio quando precisei e incentivo em todos os momentos; MUITO OBRIGADA MEUS QUERIDOS! A meu esposo, Osório Melo Neto, por ser do jeito que és, por estar ao meu lado durante todos esses anos e por esse amor que move a minha vida. TE AMO! A meus orientadores Veronaldo Souza de Oliveira e Anselmo Domingos Ferreira Santos que com seus conhecimentos souberam me guiar pelo melhor caminho, colaborando para a minha formação e qualificação profissional, muito obrigada por tamanha dedicação; A meu avô materno José Dias da Costa (in memória) por torcerem por mim em todos os momentos da minha vida, mas infelizmente não pode ver a conclusão de mais uma etapa árdua em minha vida; Ao corpo docente da Universidade Federal de Sergipe pelos ensinamentos passados em sala de aula me proporcionando um amadurecimento profissional; Aos meus colegas de turma que se tornaram meus grandes amigos, em especial a Lícia Mendes, Braz Melo, Mércia Freitas, Lucas Feitosa e Julianne Govéia pelos momentos de estudos e descontração, muito obrigada pela amizade de vocês; Aos estagiários que contribuíram para a execução desse trabalho Thiago Almeida, Raquel, Carol, Júlio, Bruno, Elisson,... As minhas amigas Caroline Maia, Heline Rocha, Lucélia Santos, Anna Cláudia, Roseane Nunes, Flávia Silveira, Lara Hora, Cláudia Fabiana e Solange Correia por me acompanharem nesta trajetória me dando bons incentivos e estando do meu lado neste importante momento; A minha querida afilhada, Letícia Helena por ter entendido a ausência da dinda. TE AMO MUITÃO! A todos que fariam enriquecer com seus nomes essa relação que, de uma forma ou de outra, contribuíram para meu êxito.

7 SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURAS... i LISTA DE TABELAS... RESUMO... ABSTRACT... ii iii iv 1. INTRODUÇÃO GERAL REFERENCIAL TEÓRICO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 1: Utilização de doses reduzidas da ecg na indução de estro aplicadas pela via submucosa vulvar em ovelhas da raça Santa Inês Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Resultados e Discussão Conclusões Agradecimentos Referências Bibliográficas CAPÍTULO 2: Determinação dos níveis séricos de cortisol em ovelhas da raça Santa Inês inseminadas pela via transcervical Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Resultados e Discussão Conclusões Agradecimentos Referências Bibliográficas... 54

8 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1 Distribuição do tempo transcorrido entre a remoção das esponjas e a primeira detecção de estro nos diferentes tratamentos em ovelhas da raça Santa Inês FIGURA 2 Distribuição dos níveis de cortisol de ovelhas da raça Santa Inês em diferentes momentos, antes, após e sete dias após a inseminação artificial i

9 LISTA DE TABELAS Página TABELA 1 Percentagem de animais em estro (AE), tempo transcorrido entre a remoção das esponjas e a primeira detecção de estro (TRE-DE horas ± DP), tempo médio gasto na inseminação artificial (TIA minutos ± DP) submetidos a protocolo de sincronização de estro em ovelhas da raça Santa Inês TABELA 2 Taxa de gestação e prolificidade em ovelhas da raça Santa Inês após tratamento hormonal com diferentes doses da ecg e vias de aplicação TABELA 3 Custo do protocolo hormonal com diferentes doses da ecg em ovelhas da raça Santa Inês em maio de TABELA 4 - Custo benefício (R$) por fêmea tratada com número de cordeiros produzidos em cada tratamento ii

10 RESUMO ANTUNES, Karla Dias. Utilização de doses reduzidas da ecg na indução de estro aplicadas pela via submucosa vulvar em ovelhas da raça Santa Inês. São Cristovão: UFS, iiip. (Dissertação Mestrado em Agroecossistemas). Os objetivos deste trabalho foram melhorar a relação custo benefício da aplicação da técnica de inseminação artificial pela via transcervical em tempo fixo (IATF) em ovinos, testando o efeito da redução da dose e da utilização da via submucosa vulvar (SMV) na aplicação da gonadotrofina coriônica eqüina (ecg) sobre a eficiência do protocolo de sincronização e fertilidade à inseminação artificial (IA), e mensurar o nível de estresse das ovelhas em conseqüência da aplicação desta biotécnica. Foram utilizados seis grupos de vinte animais, onde cada grupo receberam dosagens de 200, 300 e 400 UI da ecg pela via intramuscular (IM) e SMV. O estro foi detectado e 48 horas após feita as inseminações pela via transcervical. Das 120 ovelhas tratadas, 87,5% manifestaram estro. O percentual de deposição intra-uterina de sêmen foi de 88,3%. A taxa de gestação variou de 20 a 70% entre os tratamentos, obtendo-se média de 46,66%. A média dos resultados do cortisol foram significativos com 1,15, 2,86 e 0,52 µg/dl de acordo com os três momentos de coleta, sendo maior após o animal descer do cavalete ao término da IA. A via SMV pode ser utilizada para aplicação da ecg em doses de 300 e 400 UI em protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação em ovinos associados à IATF. A redução da dose da ecg para 200 UI pela via IM diminui os custos mantendo a eficiência dos protocolos de sincronização de estro e IATF apresentando melhor taxa de gestação e prolificidade em ovinos, porém não deve ser utilizada pela via SMV. De um modo geral os procedimentos relacionados á IA pela via transcervical provocam estresse nas ovelhas. Apesar da técnica de IA transcervical causar estresse nos animais, apresenta resultados satisfatórios de fertilidade em ovelhas multíparas da raça Santa Inês. Palavras-chave: estresse, hormônios, inseminação artificial, ovino, via de aplicação Comitê Orientador: Veronaldo Souza de Oliveira - UFS (Orientador), Anselmo Domingos Ferreira Santos - UFS (Co-orientador) iii

11 ABSTRACT ANTUNES, Karla Dias. Use of low doses of ecg in estrus induction applied route submucosis in Santa Ines sheep. São Cristovão: UFS, ivp. (Dissertation Master Program in Agroecosystems). The objectives were to improve the cost effectiveness of the technique of artificial insemination by transcervical fixed time (TAI) in sheep, testing the effect of dose reduction and use of the route submucosis (SMV) in the application of equine chorionic gonadotropin (ecg) on the efficiency of the synchronization protocol and fertility to artificial insemination (AI) and measure the stress level of the sheep as a result of the application of biotech. Were used six groups of twenty animals, where each group received doses of 200, 300 and 400 IU of ecg intramuscularly (IM) and SMV. Estrus was detected and made 48 hours after insemination by transcervical. Of the 120 treated ewes, 87.5% in estrus. The percentage of intra-uterine deposition of semen was 88.3%. Pregnancy rate ranged from 20 to 70% among the treatments, obtaining an average of 46.66%. The mean cortisol results were significant at 1.15, 2.86 and 0.52 µg/dl according to the three collections, being higher after the animal off the rack at the end of IA. The through SMV can be used to implement ecg at doses of 300 and 400 IU induction protocols and synchronizing estrus and ovulation in sheep associated TAI. The dose reduction to 200 IU ecg intramuscularly decreases the costs of maintaining the efficiency of estrus synchronization protocols and TAI showing better pregnancy rate and prolificacy in sheep, but should not be used route SMV. In general the procedures listed by the transcervical AI will cause stress in sheep. Although the technique of transcervical AI cause stress in animals produces satisfactory results in fertility multiparous ewes Santa Ines. Key-words: administration path, artificial insemination, hormones, ovine, stress Guidance Commitee: Veronaldo Souza de Oliveira - UFS (Orientador), Anselmo Domingos Ferreira Santos - UFS (Co-orientador) iv

12 1. INTRODUÇÃO GERAL A técnica de inseminação artificial (IA) em ovelhas existe a anos no Brasil, mas a sua utilização pelos criadores ainda é reduzida nos rebanhos quando relacionada a IA pela via transcervical em tempo fixo. Além da dificuldade anatômica da cérvix da ovelha em passar a pipeta inseminante, os altos custos dos hormônios utilizados nos protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação é o outro fator limitante neste procedimento. A inseminação artificial transcervical deve apresentar facilidades para que sua utilização seja disseminada. Portanto, antes da utilização desta biotécnica é de fundamental importância o conhecimento dos seus efeitos sobre a fisiologia reprodutiva das ovelhas. A dificuldade de passar a pipeta inseminante pela cérvix praticamente tem sido superada pela utilização da técnica de tracionamento e sua exteriorização, com relatos de depósitos intra-uterina do sêmen em inseminação na ordem de 84% das ovelhas multíparas (OLIVEIRA et al., 2010). Os custos com hormônios para indução e sincronização de estro e da ovulação de uma ovelha ficam em torno de 20 a 30 reais, dependendo do protocolo e das doses utilizadas. Os protocolos recomendados pelos fabricantes dos hormônios para sincronizar estro, utilizam doses muitas vezes elevadas baseadas em raças lanadas de grande porte, sendo às vezes desnecessárias, principalmente se levarmos em conta as particularidades de nossas raças nativas a exemplo da Santa Inês. A via de aplicação submucosa vulvar (SMV) rotineiramente não é muito indicada nos protocolos de sincronização de estro, entretanto, Gioso et al. (2005a) mostraram resultados satisfatórios em termos de respostas de expressão de estro utilizando esta via com doses reduzidas de cloprostenol (análogo da prostaglandina) em bovinos por facilitar com mais rapidez a ação dos hormônios na região dos ovários. Diante disto é possível que esta redução diminua os custos com os hormônios em protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação em ovelhas, e promova um grande incremento no percentual de utilização da técnica de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) pela via 1

13 transcervical em ovinos, permitindo desta forma, otimizar o potencial reprodutivo bem como acelerar o ganho genético nos rebanhos. Alguns autores questionam o fato da técnica de IA cervical causar estresse no animal levando ao aumento dos níveis de cortisol e consequentemente interferência nas taxas de ovulação, ocasionando baixas fertilidades nos protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação (HOUDEAU et al., 2002; BREEN et al., 2005). A inseminação artificial é uma biotecnologia que sofre grande influência de fatores indiretos, incluindo a anatomia cervical comparada á taxas de fertilidade, o estresse causado pela técnica (ANEL et al., 2005; KERSHAW et al., 2005). Podemos destacar também o manuseio das ovelhas, sistema da fazenda, elementos ambientais, saúde, estado fisiológico das ovelhas, etc. O estresse pode ser definido como a reação do organismo do animal a agentes nocivos que manifesta-se por alterações comportamentais e fisiológicas (MAFFEI, 2009), que levam a falha em atingir o potencial genético, por exemplo, a taxa de crescimento, resistência a doenças, produção de leite e a fertilidade (DOBSON & SMITH, 2000). Durante a IA cervical em ovelhas, para que ocorra o mínimo de estresse é importante que haja a rápida localização da entrada da cérvix, uma facilidade do local de deposição do sêmen e uma limitação na estimulação vaginal com o espéculo. No entanto, fatores como dificuldades em conter o animal após inserção do espéculo ou má acessibilidade do catéter no canal cervical são as difíceis condições para IA, e podem aumentar a intensidade de estimulação vaginal bem como o estresse (HOUDEAU et al., 2002). A concentração de cortisol é considerada um importante indicador do nível de estresse em que se encontra o indivíduo. Animais em estado de estresse procuram fazer os ajustes comportamentais e fisiológicos necessários para se adequarem às condições adversas do meio, minimizando seus efeitos e restabelecendo o equilíbrio (CHABEL et al., 2009). 2

14 É importante enfatizar que a reprodução bem-sucedida requer maturação folicular e biossíntese de estradiol, a indução de pico de hormônio luteinizante (LH), a ovulação, e expressão adequada do comportamento sexual num curto período (BREEN et al., 2005). Os objetivos deste trabalho foram melhorar a relação custo benefício da aplicação da técnica de inseminação artificial pela via transcervical em tempo fixo em ovinos, testando o efeito da redução da dose e da utilização da via submucosa vulvar (SMV) na aplicação da gonadotrofina coriônica eqüina (ecg) sobre a eficiência do protocolo de sincronização e fertilidade à inseminação artificial e mensurar o nível de estresse das ovelhas em conseqüência da aplicação desta biotécnica. 3

15 2. REFERENCIAL TEÓRICO O Brasil possui um rebanho ovino de cerca de 17,4 milhões de cabeças, distribuídos por todas as regiões do país. O Nordeste detém o maior efetivo (56,7%) do total nacional, seguido de 44,9% pela região Sul (IBGE, 2010). A ovinocultura nacional vive um momento de expansão, não só no tamanho do seu rebanho, como na propagação da genética de animais de qualidade superior. Entre os Estados nordestinos, Sergipe se destaca na criação da raça Santa Inês, não em termos numéricos, mas como um nicho da genética da raça, com um significativo número de criadores selecionadores. O Estado sempre foi considerado o berço da raça Santa Inês, sendo hoje esse material genético, disseminado por quase todos os estados brasileiros, sem nenhum problema de adaptação ou reprodução. Algumas centrais nacionais de sêmen já dispõem de material de reprodutores de elite, proveniente de vários criatórios nacionais, inclusive reprodutores oriundos de Sergipe. A raça deslanada Santa Inês, vem demonstrando ter um alto potencial de adaptação à região nordestina, mantendo bons índices produtivos e reprodutivos, com um diferencial em apresentar uma boa conformação de carcaça e por ser bastante fértil, prolífica, precoce, rústica e resistente a parasitas gastrointestinais. Essa raça vem adquirindo grande importância na ovinocultura moderna, sendo utilizada tanto pura quanto para cruzamentos industriais (SILVA et al., 2010) o que a destaca como excelente alternativa na produção de carne para quase todas as regiões tropicais do Brasil, notadamente as zonas semi-áridas nordestina. As ovelhas da raça Santa Inês são consideradas poliéstricas contínuas por apresentarem atividades reprodutivas durante todo o ano. O ciclo estral dessa espécie tem duração média de 17 dias, apresentando uma fase luteínica de 13 dias e uma fase folicular de 4 dias. Durante este período, os hormônios gonadotróficos folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), secretados pela hipófise ou pituitária, controlam o desenvolvimento folicular e esteroidogênese, culminando na secreção de estrógenos que levam ao 4

16 comportamento de estro dentre eles a receptividade sexual. Sob estímulo do FSH, emergem grupos de folículos em tempos variáveis, que caracterizam as ondas foliculares (FONSECA, 2005). Durante o ciclo estral, duas a quatro ondas (EVANS, 2003) foliculares podem estar presentes, mas apenas da última onda folicular deriva o folículo ovulatório que alcança maturação final e ovulação com predomínio de atividade estrogênica. A ovulação pode ser única ou múltipla e ocorre predominantemente no final do estro ou logo após o seu final. Após a ovulação, formam-se os corpos lúteos que aumentam de diâmetro e atividade progesterônica que será findada, a menos que ocorra o reconhecimento e manutenção da gestação. A prolificidade, conseqüente do número de ovulações, parece estar mais vinculada ao fator raça, tendo-se raças ovinas e caprinas com maior ou menor prolificidade. Além disso, fêmeas nulíparas apresentam menor prolificidade que fêmeas multíparas (FONSECA, 2005). O aumento da prolificidade em programas de inseminação artificial, geralmente está associado ao tratamento de indução e sincronização de estro e da ovulação, com a utilização de hormônios exógenos. Esta prática, gera um custo elevado para o produtor, quando comparado à inseminação com estro natural, levando muitos criadores a não utilizarem. Um protocolo de indução e sincronização de estro e da ovulação deve apresentar baixos custos com a aquisição de hormônios e ter resposta satisfatória em termos de expressão de estro e ovulação (DIAS et al., 2001; AMARAL et al. 2003; CARDOSO et al., 2009). O estro pode eficientemente ser sincronizado pela hormonioterapia que é um método que tanto promove indução de estro na fêmea como permite o estro e/ou ovulação de fêmeas de maneira simples e controlada. Geralmente os protocolos de sincronização de estro em ovinos, empregam hormônios como análogos de progesterona em esponjas vaginais impregnadas, associada à aplicação da gonadotrofina coriônica eqüina (ecg) que aumenta a ocorrência de ovulação e, esta sincronia permite o emprego da inseminação artificial em horário pré-fixado (OLIVEIRA et al., 2009). 5

17 O desenvolvimento folicular sendo manipulado com o uso de gonadotrofinas e progestágenos exógenos altera o número e o tempo de persistência dos folículos em desenvolvimento. A ovulação de folículos envelhecidos não é desejável e compromete a fertilidade, fazendo com que protocolos de curta duração sejam mais eficientes que os de longa duração (VIÑOLES et al., 2001). A sincronização de estro, a identificação do momento da ovulação e a determinação da correlação entre a duração do estro e o momento da ovulação são de fundamental importância para o estabelecimento de protocolos efetivos de inseminação artificial em tempo fixo, que resultem em bons parâmetros reprodutivos como, por exemplo, a máxima fertilidade ao parto (LEITE et al., 2006). A inseminação artificial por via transcevical permite o uso de sêmen congelado em ovinos com o tracionamento e exteriorização da cérvix. O sêmen é depositado diretamente no útero pela passagem de uma pipeta de inseminação através do canal cervical transpondo todos os anéis, mas este procedimento exige bastante habilidade, pois a anatomia da cérvix das ovelhas limita o desenvolvimento dessa técnica (LEETHONGDEE, 2010). Segundo Kershaw et al. (2005) o sucesso da inseminação artificial por via transcevical em ovelhas é altamente dependente da anatomia da cérvix e da fase do ciclo estral, mas, algumas pipetas para IA podem superar o lúmen cervical tortuoso e ajudar a sua transposição, melhorando assim as taxas de fertilidade com sêmen congelado. Registrando o local de deposição do sêmen congelado em cervical superficial, cervical médio, cervical profundo e intra-uterina (RABASSA et al., 2007), Taqueda et al. (2011) realizaram inseminação artificial transcervical em ovelhas Santa Inês e apresentaram taxas de prenhez satisfatórias de 45,8% com a deposição intra-uterina. De acordo com Dias et al. (2001), no Nordeste, a técnica de sincronização de estro e de ovulação tem seu uso limitado pelo elevado custo e pequena disponibilidade de hormônios no mercado nacional, dificultando a popularização da técnica. Amaral et al. (2003) relatam que as despesas com tratamento hormonal, em IATF de bovinos, oscilam 6

18 entre 41 e 60% no custo total entre insumos e serviços. No experimento realizado por Cardoso et al. (2009) o valor do tratamento hormonal em ovinos da raça Santa Inês foi de R$ 10,33 por fêmea tratada, sendo os custos da esponja vaginal e da ecg de R$ 3,24; R$ 6,24, respectivamente. Recentemente Ferreira et al. (2011) calcularam o valor de uma sincronização de estro que, a depender do protocolo hormonal utilizado, variou entre R$ 14,65 a 16,30 por ovelha tratada. Ainda hoje, são poucos os trabalhos avaliando os protocolos com doses reduzidas ou diferentes vias de aplicação dos hormônios com ovelhas deslanadas. Tentativas de minimizar custos nos programas de IA, têm sido feitas em diversas espécies como bovinos, caprinos e ovinos, seja reduzindo a dose aplicada ou modificando a via de aplicação dos hormônios. Fonseca et al. (2005) obtiveram bons resultados de sincronização de estro em cabras com uso de esponjas intravaginais associado à aplicação de prostaglandina (PGF2α) pela via SMV 24 horas antes da retirada das esponjas. Esta via de aplicação faz com que o hormônio chegue ao seu local de ação, o ovário, mais rapidamente, reduzindo a taxa de metabolização sistêmica. Resultados positivos com a utilização de PGF2α pela via SMV também foram obtidos por Oliveira e Visintin (1993) utilizando doses reduzidas (125; 62,5 e 31,25 microgramas) em programas de sincronização de estro em cabras mestiças. Os autores não observaram diferenças significativas em termos de expressão de estro entre os grupos estudados. O custo relativamente elevado da dose convencional do tratamento aplicado via intramuscular (IM) é fator limitante ao uso intensivo dos agentes luteolíticos, inviabilizando a utilização em larga escala a campo (GIOSO et al., 2005a). Resultados de aplicação de doses fracionadas de PGF2α e ecg pela via SMV em ovelhas, não foram encontrados na literatura, necessitando serem testadas e avaliadas, quanto à sua eficiência bem como o seu custo benefício. Formas sintéticas da PGF2α foram desenvolvidas e podem ser usadas para induzir a regressão lútea na maioria das ovelhas tendo como conseqüência o estro (RUBIANES et al., 2003). Em associação muitos dos tratamentos de sincronização de estro utilizam uma 7

19 única injeção da ecg, objetivando aumentar a ocorrência e a velocidade de ovulação, além de favorecer a fertilidade (AMER & HAZZAA, 2009). A ecg é um hormônio essencial nos protocolos de sincronização de estro e após tratamento com progestágenos pode aumentar a resposta ovariana, taxa de concepção e porcentagem de nascimentos múltiplos por indução da ovulação (MOEINI et al., 2007). Esse hormônio atua simulando a atividade das gonadotrofinas FSH e LH, e consegue provocar o incremento do desenvolvimento de folículos, mesmo durante os períodos de inatividade hipofisária nesses animais (HUSEIN & ABABNEH, 2008). Os fabricantes dos hormônios comerciais a base da ecg encontrados no mercado brasileiro, recomendam sua aplicação para a ovulação em ovinos e caprinos na sua maioria variando entre 400 a 500 UI (Unidades Internacionais), sendo a via de aplicação indicada a IM. Como é um hormônio que tem como alvo o ovário, é possível, obter respostas ovulatórias com doses reduzidas pela via SMV, resposta esta, ainda não relatada na literatura com ovelhas. Gioso et al. (2005b) investigaram a angioarquitetura venosa da genitália de fêmeas bovinas não prenhes, para avaliar a presença de possíveis anastomoses dos vasos provenientes da região da vulva e da vagina com a veia útero-ovariana. Um ramo da veia vaginal caudal, infundido com contraste radiográfico intravascular, foi submetido à radiografia tendo sido observada que a veia vaginal forma intensa rede de anastomoses na superfície ventral do útero, entre os antímeros direito e esquerdo. As genitálias apresentaram anastomoses dos vasos vulvares e vaginais com vasos da cérvice, corpo e cornos uterinos, sugerindo que parte de um agente luteolítico administrado via SMV pode ser transportado diretamente aos ovários por uma rota local, sem atingir a circulação sistêmica diferente da via IM (GIOSO et al., 2005a). Ainda não há um consenso entre os pesquisadores, sobre qual a dose resposta ideal da ecg, em termos de unidades internacionais a ser utilizada nos protocolos de IATF em ovelhas, que proporcione boas respostas em termos de indução e sincronização de estro e da ovulação, associado a um baixo custo. Nos protocolos utilizados em ovelhas as doses 8

20 variam entre 100 a 600 UI, entretanto as respostas quanto à taxa de ovulação são as mais variadas possíveis, podendo ser influenciada pela raça, via de aplicação, estado nutricional e época do ano. Os primeiros relatos do uso da ecg em protocolos de sincronização de estro em caprinos, foram descritos por Gonzalez Stagnaro (1974), utilizando 600UI da ecg para indução da ovulação, comparando ao grupo não tratado, onde encontrou resultados mais satisfatórios em termos de estro e fertilidade no grupo tratado (100 e 67%) e não tratado (40 e 50%), respectivamente. Para Hashemi et al. (2006) os tratamentos hormonais de sincronização de estro com progestágenos associados a ecg, tem apresentado bons resultados, uma vez que esta gonadotrofina atua no recrutamento folicular ovariano de fêmeas cíclicas ou acíclicas. Barbas et al. (2002), trabalhando com doses de 250 e 500 UI da ecg em ovelhas nativas portuguesas não observaram diferenças significativas nos parâmetros estudados como a fertilidade, prolificidade e fecundidade (número de óvulos que atingem a maturidade durante o estro) na inseminação cervical com sêmen refrigerado, recomendando o uso da dose reduzida (250 UI) sem que a eficiência reprodutiva seja afetada já que obteve 87,5% de fecundidade. Resultados positivos foram observados por Guimarães et al. (2008) em ovelhas da raça Santa Inês tratadas com doses reduzidas da ecg de 150 e 200 UI por via IM, não encontrando diferença significativa na expressão de estro (95% e 78%), respectivamente, porém, não avaliando a taxa de gestação e via de aplicação. O resultado de gestação tem apresentado grande variação na IA quando se trabalha com sêmen congelado pela via cervical. Segundo Rabassa et al. (2007), utilizando dose de 500 UI da ecg em protocolo de sincronização de estro em 70 ovelhas Corriedale em anestro estacional inseminadas em tempo fixo com sêmen congelado e, comparando a técnica de IA transcervical, utilizando tracionamento cervical, com a laparoscopia, encontraram resultados semelhantes entre os métodos em relação aos índices de prenhez (40%). Resultado semelhante foi encontrado por Gilberti e Monreal (2008) (42,9%) com 9

21 IATF em ovelhas Santa Inês, inseminadas por laparoscopia 48 horas após a retirada do progestágeno com reduzida dose da ecg (200 UI/IM) utilizando sêmen congelado durante a estação reprodutiva. Não se pode afirmar que baixos índices de gestação após inseminação artificial laparoscópica ou transcervical são devidos exclusivamente ao sêmen congelado, à dose de sêmen empregada, local de deposição do sêmen, efeito raça, protocolo de sincronização utilizado ou a tantos outros fatores estudados, mas é preciso investigar se existe uma causa comum dentre as metodologias empregadas. O estresse pode ser essa causa, por exemplo á maioria das inseminações laparoscópicas realizadas de forma comercial não fazem uso da anestesia geral nos animais. A resposta ovariana nas ovelhas submetidas à sincronização de estro e subsequentes taxas de fertilidade e fecundidade variam com o estresse, meio ambiente, raça, tipo de progestágeno entre outros (MOEINI et al., 2007). No entanto o estresse pode ser definido como a reação do organismo do animal a agentes nocivos que manifesta-se por alterações comportamentais e fisiológicas (MAFFEI, 2009). Khalid et al. (1998) pesquisaram a resposta de cortisol em ovelhas submetidas à inseminação cervical ou laparoscópica e os procedimentos de manipulação associados com tais técnicas detectaram que o pico na concentração de cortisol foi similar após ambos os tratamentos, o que sugere que os dois procedimentos são estressantes. Podemos destacar também o manuseio das ovelhas, sistema da fazenda, elementos ambientais, saúde, estado fisiológico das ovelhas, etc., que levam a falha em atingir o potencial genético, por exemplo, a taxa de crescimento, resistência a doenças, produção de leite e a fertilidade (DOBSON & SMITH, 2000). Durante a IA cervical em ovelhas, para que ocorra o mínimo de estresse é importante que haja a rápida localização da entrada da cérvix, uma facilidade do local de deposição do sêmen e uma limitação na estimulação vaginal com o espéculo. No entanto, fatores como dificuldades em conter o animal após inserção do espéculo ou má 10

22 acessibilidade do catéter no canal cervical são as difíceis condições para IA, e podem aumentar a intensidade de estimulação vaginal bem como o estresse (HOUDEAU et al., 2002). Um fácil procedimento da IA cervical é comumente observado em ovelhas multíparas porque o alto grau de distensibilidade do canal cervical depois de nascimentos múltiplos, muitas vezes permite rápida localização da entrada da cérvix. Em contra partida, um difícil procedimento na IA é frequentemente encontrado em ovelhas primíparas e nulíparas (HOUDEAU et al., 2002). A concentração de cortisol é considerada um importante indicador do nível de estresse em que se encontra o indivíduo. Animais em estado de estresse procuram fazer os ajustes comportamentais e fisiológicos necessários para se adequarem às condições adversas do meio, minimizando seus efeitos e restabelecendo o equilíbrio (CHABEL et al. 2009). Quando o estresse é prolongado ou crônico resulta em secreção suprimida de gonadotrofinas e inibição da reprodução, mas, quando a duração da resposta ao estresse é transitória ou aguda, as consequências não são claras; há relatos de ausência de efeito, seja este efeito estimulante ou inibitório na reprodução (TILBROOK et al., 2000). O estresse agudo pode ocorrer devido a manejos de rotina relativamente rápidos como IA com tração cervical em ovelhas, coleta de sêmen com eletroejaculação, exame ginecológico e andrológico por palpação transretal em grandes animais (COSTA-SILVA et al., 2010). Quando um animal sente dor ocorre liberação de opióides endógenos que bloqueiam o LH, consequentemente atrasando ou bloqueando a ovulação (BREEN et al., 2005). Portanto, eventos dolorosos e estressantes no período de reprodução também têm efeitos deletérios na fertilidade diminuindo a eficiência reprodutiva (DOBSON & SMITH, 1998). 11

23 Para Costa-Silva e Russi (2005), o estresse afeta a reprodução pela diminuição na expressão de estro o que implica na diminuição da eficiência de sua detecção em sistemas que adotam a inseminação artificial, também pode comprometer a maturação final dos folículos e atrasar ou impedir a ovulação ou mesmo levar ao aumento de perdas embrionárias. Hormônios relacionados ao estresse podem influenciar a função reprodutiva em todos os três níveis do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG): no cérebro inibindo o estímulo a secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), na pituitária interferindo na indução do GnRH para a liberação de LH, e nas gônadas alterando o efeito estimulatório das gonadotrofinas na secreção dos esteróides sexuais. Os efeitos do estresse na função reprodutiva e os mecanismos que mediam esses efeitos dependem do tipo, da duração e frequência do estímulo (RIVIER & RIVEST, 1991). O estresse ativa o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) levando a alta secreção de glucocorticóides e ao mesmo tempo inibindo a secreção de gonadotrofina e interrompendo a ciclicidade ovariana. Quando prolongado afeta a função reprodutiva por meio da ação do cortisol que interfere na maturação folicular reduzindo a freqüência dos pulsos de LH, ao diminuir a freqüência secretória de GnRH. Com isso, há um atraso ou bloqueio do estradiol, assim como de FSH e no pico de LH (DOBSON & SMITH, 1998; DALEY et al., 1999; TILBROOK et al., 2000; BREEN et al., 2005; BREEN & KARSCH, 2006; OAKLEY et al., 2008). Uma variedade de estressores inibe a secreção de gonadotrofina e interrompe a ciclicidade ovariana. Por exemplo, a contenção agressiva e o isolamento reduzem as concentrações plasmáticas e a secreção pulsátil de LH em ratos, ovelhas e macacos. O transporte inibe a secreção pulsátil e atrasa e atenua o pico de LH em ovelhas e vacas (TILBROOK et al., 2000; BREEN et al., 2005). Estes estressores são definidos como estressores agudos (DOBSON & SMITH, 2000). 12

24 Estudos recentes têm determinado que a secreção aumentada de cortisol é necessária para que haja a rápida (dentro de 30 minutos) supressão da capacidade de resposta da pituitária ao GnRH em ovelhas expostas a um estresse psicossocial agudo. Este efeito é bloqueado por antagonismo do receptor glicocorticóide (GR) do tipo II (BREEN et al., 2007). É importante enfatizar que a reprodução bem-sucedida requer maturação folicular e biossíntese de estradiol, a indução de pico de LH, a ovulação, e expressão adequada do comportamento sexual num curto período (BREEN et al., 2005). Embora estudos anteriores indiquem que os glicocorticóides podem bloquear ou atenuar o estradiol, Wagenmaker et al. (2009) revelam que um estresse que promova a elevação do cortisol plasmático pode mudar o tempo de resposta de feedback positivo por um sinal fixo de estradiol, como é visto em resposta a fatores de estresse. A interferência na resposta ao estradiol constitui um mecanismo pelo qual o cortisol compromete a fase folicular do ciclo estral, e provavelmente contribui para que agentes estressores graves tais como a endotoxina perturbe a ciclicidade do ovário. Isto poderia ter valor adaptativo de reduzir a probabilidade de gravidez nos animais com doença infecciosa ou imunológica / inflamatória ou com distúrbios adrenais que cronicamente elevam cortisol a exemplo da doença de Cushing, assim permitindo que a energia metabólica possa ser participada de uma maneira que otimize a sobrevivência. 13

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31 CAPÍTULO 1 Utilização de doses reduzidas da ecg na indução de estro aplicadas pela via submucosa vulvar em ovelhas da raça Santa Inês 20

32 1.1. Resumo ANTUNES, Karla Dias. Utilização de doses reduzidas da ecg na indução de estro aplicadas pela via submucosa vulvar em ovelhas da raça Santa Inês. São Cristovão: UFS, p. (Dissertação Mestrado em Agroecossistemas). O objetivo deste trabalho foi melhorar a relação custo benefício da aplicação da técnica de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) pela via transcervical em ovinos, testando o efeito da redução da dose e da utilização da via submucosa vulvar (SMV) na aplicação da gonadotrofina coriônica equina (ecg) sobre a eficiência do protocolo de sincronização e fertilidade à inseminação artificial. Foram utilizados seis grupos de vinte animais, onde cada grupo receberam dosagens de 200, 300 e 400 UI da ecg pela via intramuscular (IM) e SMV. O estro foi detectado e 48 horas após feita as inseminações pela via transcervical. Das 120 ovelhas tratadas, 87,5% manifestaram estro. O percentual de deposição intrauterina de sêmen foi de 88,3%. A taxa de gestação variou de 20 a 70% entre os tratamentos, obtendo-se média de 46,66%. O que demonstra que a via SMV pode ser utilizada para aplicação da ecg em doses de 300 e 400 UI em protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação em ovinos associados à IATF. A redução da dose da ecg para 200 UI pela via IM diminui os custos mantendo a eficiência dos protocolos de sincronização de estro e IATF apresentando melhor taxa de gestação e prolificidade em ovinos, porém não deve ser utilizada pela via SMV. Palavras-chave: hormônios, inseminação artificial, ovino, via de aplicação Comitê Orientador: Veronaldo Souza de Oliveira UFS (Orientador), Anselmo Domingos Ferreira Santos - UFS (Co-orientador) 21

33 1.2. Abstract ANTUNES, Karla Dias. Use of low doses of ecg in estrus induction applied route submucosis in Santa Ines sheep. São Cristovão: UFS, p. (Dissertation Master Program in Agroecosystems). The objective of this study was to improve the cost effectiveness of the technique of artificial insemination in fixed time (TAI) in sheep route transcervical, testing the effect of dose reduction and use of the route submucosis (SMV) in the application of equine chorionic gonadotropin (ecg) on the efficiency of the synchronization protocol and fertility to artificial insemination. Were used six groups of twenty animals, where each group received doses of 200, 300 and 400 IU of ecg intramuscularly (IM) and SMV. Estrus was detected and made 48 hours after insemination by transcervical. Of the 120 treated ewes, 87.5% in estrus. The percentage of intra-uterine deposition of semen was 88.3%. Pregnancy rate ranged from 20 to 70% among the treatments, obtaining an average of 46.66%. This demonstrates that the route SMV can be used to implement ecg at doses of 300 and 400 IU induction protocols and synchronizing estrus and ovulation in sheep associated with the TAI. The dose reduction to 200 IU ecg intramuscularly decreases the costs of maintaining the efficiency of estrus synchronization protocols and TAI showing better pregnancy rate and prolificacy in sheep, but should not be used route SMV. Key-words: administration path, artificial insemination, hormones, ovine Guidance Commitee: Veronaldo Souza de Oliveira UFS (Orientador), Anselmo Domingos Ferreira Santos - UFS (Co-orientador) 22

34 1.3. Introdução A ovinocultura nacional vive um momento de expansão, não só no tamanho do seu rebanho, como na propagação da genética de animais de qualidade superior. O Nordeste brasileiro é visto como região de vocação para a exploração de pequenos ruminantes, a exemplo dos caprinos e ovinos. A raça deslanada Santa Inês, vem demonstrando ter um alto potencial de adaptação à região nordestina, mantendo bons índices produtivos e reprodutivos, com um diferencial em apresentar uma boa conformação de carcaça e se destaca por ser bastante fértil, prolífica, precoce, rústica e resistente a parasitas gastrointestinais. Essa raça vem adquirindo grande importância na ovinocultura moderna, sendo utilizada tanto pura quanto para cruzamentos industriais (SILVA et al., 2010) o que a destaca como excelente alternativa na produção de carne para quase todas as regiões tropicais do Brasil, notadamente as zonas semi-áridas nordestina. Estas ovelhas são consideradas poliéstricas contínuas por apresentarem atividades reprodutivas durante todo o ano (FONSECA, 2005). A inseminação artificial com tracionamento e exteriorização da cérvix em ovelhas da raça Santa Inês, vem apresentado índices satisfatórios de fertilidade com uso de sêmen congelado (ALMEIDA et al., 2011), apesar de alguns autores citarem a dificuldade na passagem do catéter pelo canal cervical devido a sua anatomia ser composta de anéis tortuosos, e associarem isto com a dificuldade de disseminação da inseminação cervical (LEETHONGDEE, 2010; KERSHAW et al. 2005). Outro fator limitante que leva a dificuldade do uso da inseminação artificial em tempo fixo (IATF), são os altos custos dos hormônios utilizados nos protocolos de indução e sincronização de estro e da ovulação. O custo com hormônios para sincronização de estro de uma ovelha fica em torno de 20 a 30 reais, dependendo do protocolo e das doses utilizadas. Os protocolos recomendados pelos fabricantes dos hormônios para sincronizar estro, utilizam doses elevadas geralmente baseadas em raças lanadas de grande porte, sendo às vezes desnecessárias, principalmente se levarmos em conta as particularidades de nossas raças nativas a exemplo da Santa Inês. 23