ACTINOBACTÉRIAS DA CAATINGA PRODUTORAS DE METABÓLITOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO VEGETAL

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1 ACTINOBACTÉRIAS DA CAATINGA PRODUTORAS DE METABÓLITOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO VEGETAL Lins, M.R.C.R. (1) ; Corrêa, G.G. (1) ; Vasconcellos, N.M. (1) ; Fontes-Vieira, J.M. (1) ; Araújo, E.A. (1) ; Silva, D.T.F. 1 ; Lima, G.M.S. (1) ; Araújo, J.M. (1) milca.biomed@gmail.com (1) Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco UFPE, Recife - PE, Brasil. RESUMO As actinobactérias podem sintetizar muitos metabólitos de importância biotecnológica representando desta forma uma fonte de grande impacto para a agricultura. Entre os metabólitos estão as enzimas fosfatases e a amônia, que são sintetizados por estes micro-organismos e favorecem o crescimento vegetal. Diante deste fato, o presente trabalho teve como objetivo analisar 80 actinobactérias isoladas de rizosferas da Caatinga que produzam estas substâncias bioativas. A produção de fosfatases foi avaliada e foi observado que 97,5% (78) das actinobactérias são produtoras desta enzima. Análises qualitativa e quantitativa da produção de amônia foram realizadas e foi observado que 80% (64) das linhagens testadas produzem amônia em concentrações variando de 3,59 a 292,31 µg.ml -1. Posteriormente, serão realizados testes com sementes de feijão caupi (Vigna unguiculata L. (Walp.)), em casa de vegetação, para confirmar o potencial destas actinobactérias em promover o crescimento desta planta. Palavras-chave: Desenvolvimento de Plantas, Rizobactérias, Fosfatases e Amônia.

2 INTRODUÇÃO Buscas por alternativas para tentar diminuir a aplicação de produtos químicos são realizadas em todo mundo com a finalidade de reduzir os impactos causados ao meio ambiente por esses agentes que além de poluir, causam desequilíbrio ecológico (LIMA, 2009). Várias bactérias podem promover o crescimento vegetal e são denominadas Rizobactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (RPCP). Dentro do grupo Bacteria, o filo Actinobacteria se destaca como biofertilizante, promovendo o crescimento vegetal e atuando no controle biológico. Estas actinobactérias têm sido amplamente estudadas nas últimas décadas como uma alternativa ao uso de agrotóxicos (OLIVEIRA et al., 2003). As actinobactérias RPCP promovem o crescimento vegetal através de mecanismos diretos e indiretos, dentre os quais se destacam a solubilização de fósforo pelas fosfatases e fixação biológica de nitrogênio (N 2 ), além da produção de substâncias antimicrobianas (NIMNOI et al., 2010; SOLANS et al., 2011). As actinobactérias que apresentam mais de uma característica para a promoção de crescimento vegetal, como por exemplo, a produção de fosfatases para solubilização de fósforo e/ou produção de amônia são importantes para aplicação no campo visando o desenvolvimento sustentável da agricultura. 2

3 Por este motivo, análises das actinobactérias isoladas da rizosfera da Caatinga são importantes para se conhecer o seu papel ecológico neste bioma inexplorado permitindo assim um melhor conhecimento entre o habitat e estes micro-organismos. Além disto, é possível avaliar o potencial das actinobactérias em produzir substâncias que podem ser aplicadas na agricultura visando à diminuição do uso de agrotóxicos na agricultura brasileira para melhoramento da qualidade de produtos agroindustriais. MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismos Foram utilizadas 80 linhagens de actinobactérias isoladas de diferentes amostras da rizosfera da Caatinga (Melocactus sp, Pereiro e Terminalia fagifolia) pertencentes à Coleção de Cultura de Microrganismos (UFPEDA) do Departamento de Antibióticos. Avaliação da produção de fosfatases A produção de fosfatases pelas actinobactérias foi observada por meio da metodologia de Ribeiro e Cardoso (2012) com pequenas modificações. Cada linhagem foi cultivada em placas de Petri contendo meio ISP-2 ou ISP-3. Após cultivo, blocos de gelose de cada actinobactéria foram 3

4 transferidos para o meio ISP-2 suplementado com solução de difosfato de fenoftaleína (0,5%) e cultivadas por cinco dias a 37 C. Para revelação foram adicionadas gotas da solução de hidróxido de amônio (8,4%) nas tampas das placas e após 15 minutos, observado se as linhagens produzem fosfatases pela formação de uma zona rosa ao redor das colônias. Os experimentos foram realizados em triplicata. Avaliação da produção de amônia (NH 3 ) qualitativa e quantitativa A produção de amônia pelas actinobactérias foi realizada segundo a metodologia descrita por Kavamura et al. (2012). Inicialmente, cada linhagem foi cultivada em água peptonada por 48 horas a 37 C sob agitação de 180 rpm. Após o cultivo, 10% (v/v) de cada pré-inóculo foram transferidos para outros tubos contendo água peptonada e cultivados por cinco dias nas mesmas condições anteriormente citadas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas e ao sobrenadante foi adicionado o reagente de Nessler na proporção de 1,0:0,5 (v/v). O desenvolvimento de cor amarela claro indicou baixa produção de amônia e a coloração amarronzada indicou uma alta produção. Para quantificação da amônia produzida foi realizada uma curva-padrão com concentrações conhecidas de sulfato de amônio. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. 4

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados mostram que 97,5% (78) das actinobactérias produzem fosfatases pela formação de zona rosa ao redor das colônias após a adição de hidróxido de amônio. Os resultados obtidos foram expressos de acordo com Kavamura et al. (2012). Das linhagens produtoras de fosfatases, 75,64% (59) mostraram halo maior que 10 mm, representado por duas cruzes (++) e 24,36% (19) das actinobactérias apresentaram zonas menores que 10 mm (+). A principal fonte de fosfatases no solo é de origem microbiana, e sua atividade aumenta substancialmente na rizosfera, tornando necessário o conhecimento de quais micro-organismos produzem estas enzimas para elucidar os mecanismos de ação destas enzimas (RIBEIRO; CARDOSO, 2012). No estudo realizado por Meena et al. (2013) foi observado que dentre as 26 actinobactérias isoladas de ambiente marinho, 30,77% (8) produzem fosfatases, além de outras enzimas importantes que podem ser utilizadas na indústria. Ribeiro e Cardoso (2012) observaram que das 96 bactérias associadas a raízes da Araucaria angustifolia, 85% (83) dos isolados produzem fosfatases. 5

6 Os resultados obtidos neste trabalho mostram o grande potencial das actinobactérias isoladas da rizosfera da Caatinga em relação à produção de fosfatases, pois confirmam e se correlacionam com os resultados analisados na solubilização de fosfato. Do total de actinobactérias testadas, foi observado que 80% (64) produzem NH 3 em concentrações que variam de 3,59 a 292,31 µg.ml -1. Em trabalho similar, Arun et al. (2012) avaliaram qualitativamente a promoção do crescimento de plantas pela produção de amônia de 35 bactérias com morfotipos diferentes isoladas da rizosfera de Cassia occidentalis, e observaram que 85,71% (30) produzem esta substância, além de apresentar outros mecanismos de promoção do crescimento vegetal. De acordo com Nimnoi et al. (2010), 10 actinobactérias endofíticas da planta Aquilaria crassna Pierre ex Lec foram isoladas, e todas apresentaram produção de amônia que variou de 2 a 60 mg.ml -1, sugerindo que estas linhagens apresentam potencial em promover o desenvolvimento de plantas. Portanto, os resultados obtidos neste estudo evidenciam altas concentrações de amônia produzida pelas actinobactérias rizosféricas do Melocactus sp., Pereiro e Terminalia fagifolia, indicando que podem exercer um papel fundamental na fixação biológica do nitrogênio e 6

7 também possivelmente influenciar a antibiose frente aos fitopatógenos, pois é um composto volátil. Outros mecanismos para promoção do crescimento vegetal foram avaliados previamente por nosso grupo de pesquisa com estas 80 linhagens isoladas de rizosferas da Caatinga e foi observado que todas as actinobactérias apresentaram pelo menos dois mecanismos ou mais de promoção de crescimento vegetal. Estes micro-organismos que tenham capacidade em exercer vários mecanismos para a promoção de crescimento vegetal são importantes, pois possuem um alto potencial e podem ser utilizados na agroindústria. Testes in vivo em casa de vegetação utilizando sementes de feijão-caupi (Vigna unguiculata L. (Walp.)) serão realizados visando a confirmação a característica destes micro-organismos em promover o desenvolvimento desta planta. CONCLUSÃO Das actinobactérias isoladas de rizosferas da Caatinga, 97,5% (78) apresentam produção de fosfatases, sendo um importante mecanismo de promoção vegetal desempenhado por estas bactérias filamentosas. Dentre as linhagens avaliadas, 80% (64) produzem amônia em concentrações variando de 3,59 a 292,31 µg.ml -1, sugerindo assim que 7

8 estas actinobactérias têm um papel importante no ciclo do nitrogênio além de apresentar atividade antimicrobiana frente fitopatógenos. REFERÊNCIAS ARUN, B.; GOPINATH, B.; SHARMA, S. Plant growth promoting potential of bacteria isolated on N free media from rhizosphere of Cassia occidentalis. World journal of microbiology & biotechnology, 28 (9): KAVAMURA, V. N.; SANTOS, S. N.; SILVA, J. L.; PARMA, M. M.; AVILA, L. A.; VISCONTI, A.; ZUCCHI, T. D.; TAKETANI, R. G.; ANDREOTE, F. D.; MELO, I. S. Screening of Brazilian Cacti Rhizobacteria for Plant Growth Promotion Under Drought. Microbiological Research, 168 (4): LIMA, G. M. S. Toxinas Recombinantes Cry2Aa e Cry11A de Bacillus thuringiensis Expressas Em Células de Inseto São Tóxicas Para Larvas de Lepidoptera e Diptera. Tese de Doutorado. Departamento de Biologia Celular. Universidade de Brasília MEENA, B.; RAJAN, L. A.; VINITHKUMAR, N. V.; KIRUBAGARAN, R. Novel Marine Actinobacteria from Emerald Andaman & Nicobar Islands: a Prospective Source for Industrial and Pharmaceutical Byproducts. BMC Microbiology, 13: NIMNOI, P.; PONGSILP, N.; LUMYONG, S. Endophytic Actinomycetes Isolated from Aquilaria crassna Pierre Ex Lec and Screening of Plant Growth Promoters Production. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26 (2): OLIVEIRA, A. L. M.; URQUIAGA, S.; BALDANI, J. I. Processos e Mecanismos Envolvidos Na Influência de Microrganismos Sobre o Crescimento Vegetal. Embrapa Agrobiologia, 161. Seropédica RIBEIRO, C. M.; CARDOSO, E. J. B. N. Isolation, Selection and Characterization of Root-associated Growth Promoting Bacteria in Brazil Pine (Araucaria angustifolia). Microbiological Research, 167 (2):

9 SOLANS, M.; VOBIS G.; CASSÁN, F.; LUNA, V.; WALL, L. G. Production of Phytohormones b,y Root-associated Saprophytic Actinomycetes Isolated from the Actinorhizal Plant Ochetophila trinervis. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27 (9):