UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS SIMONE VIEIRA CASTRO CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES FORTALEZA 2011

2 SIMONE VIERA CASTRO CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Co-orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo FORTALEZA 2011

3 Xxxxx Castro, Simone Vieira Criopreservação De Tecido Ovariano Caprino: Eficiência De Diferentes Agentes Crioprotetores /Simone Vieira Castro Fortaleza, Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Dissertação de Mestrado (Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 1. Folículo pré-antral. 2. Solução de congelação. 3. Agente crioprotetor.

4 SIMONE VIEIRA CASTRO CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: / / BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Universidade Estadual do Ceará (Orientadora) Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Universidade Estadual do Ceará (Co-orientador Examinador) Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci Universidade de Brasília (Examinadora)

5 Aos meus pais, Diomar Felicíssimo de Castro e Maria Divina Vieira da Mota Castro. Dedico

6 17 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-gaduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), que me proporcionou a realização de um curso de pós-graduação de reconhecida qualidade. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro por meio da concessão da bolsa. À banca examinadora, por ter aceitado prontamente o convite, sobretudo pela colaboração na correção deste trabalho. À Dr. Ana Paula Ribeiro Rodrigues e Dr. José Ricardo de Figueiredo, pela orientação na realização deste trabalho, pela oportunidade e pela confiança em mim depositada. Obrigada por todos os ensinamentos. Ao professor Dr. Cláudio Cabral Campello, tanto pelo precioso auxilio na análise estatística, quanto pela dedicação e atenção sempre que solicitado. Ao professor Dr. Kalil Skeff e seu filho Murad Skeff, por me acolherem carinhosamente e pelo privilégio de fazer parte da família Skeff durante minha estadia em Brasília. Aos companheiros do instituto de ciências biológicas da UnB, Dra. Carolina Madeira Lucci, Dra. Sônia Nair Báo, Natalia Lemos Chaves, Felipe Coutinho, Misléia Rodrigues e Ingrid Gracielli, que demonstraram como é importante a parceria entre instituições no mundo acadêmico. Aos professores Dra. Tânia Vasconcelos, Dra. Helciléia Dias Santos e Dr. Marcello Otake Sato, que acreditaram em mim e guiaram meus primeiros passos na vida acadêmica. A todos os membros da equipe LAMOFOPA que me deram apoio e contribuíram de forma direta ou indireta para a execução deste trabalho. Em especial a

7 18 Luciana Rocha Faustino, pelo apoio e grande amizade desde minha chegada à Fortaleza. À Adeline de Andrade Carvalho, inseparável companheira de bancada nesta árdua caminhada, muito obrigada. À minha família cearense Cleidson Manoel Gomes da Silva, Liliane Moreira Silva e Oscar Oliveira Brasil, pelo apoio indispensável, por todas as horas compartilhadas em nosso lar e pela grande amizade. Agradeço imensamente a toda minha família que sempre me deu força e carinho para suportar a saudade e superar a enorme distância que nos separa. Aos meus amados pais Diomar e Divina, meus primeiros e eternos mestres, pelo amor infinito, apoio incondicional, por me ensinarem as lições mais valiosas e importantes da vida que me permitiram chegar até aqui. Agradecimento mais que especial aos meus queridos irmãos Diogo e Eudes Vieira Castro, que sempre me protegeram e dos quais sinto imenso orgulho e admiração. Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para esta conquista. Muito obrigada!

8 19 Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer. Mahatma Gandhi

9 20 RESUMO A criopreservação de tecido ovariano tem sido alvo de intensos estudos com finalidade de auxiliar na tecnologia de reprodução assistida em animais e humanos. Para o sucesso da criopreservação, a composição da solução de congelação, especialmente o agente crioprotetor intracelular utilizado, é de fundamental importância. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo definir uma solução de congelação lenta para o tecido ovariano caprino. Para isso, foram realizados dois experimentos. No experimento I, fragmentos de córtex ovariano de cabras foram submetidos à congelação lenta na presença de 12 diferentes soluções contendo 1,0 M de etilenoglicol (EG), propanodiol (PROH) ou dimetilsulfóxido (DMSO) como agentes crioprotetores intracelulares, associados ou não à sacarose e/ou soro fetal bovino (SFB). No experimento II, fragmentos previamente congelados em soluções contendo DMSO suplementado ou não com sacarose e/ou SFB foram submetidos ao cultivo in vitro por 48 horas. Para avaliação folicular pós-descongelação foi utilizada a histologia clássica e teste de viabilidade por marcadores fluorescentes (etidio homodimero-1 e calceína-am), nos experimentos I e II, além da análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão no experimento II. No tocante à análise estatística do efeito dos diferentes agentes crioproterores e a interação com os suplementos foi utilizada ANOVA seguida de teste SNK, enquanto os dados referentes à viabilidade foram comparados pelo teste Qui-quadrado. Os valores foram considerados significativos quando p<0,05. O experimento I demonstrou que apenas as soluções contendo DMSO foram capazes de manter a morfologia folicular semelhante à observada no tecido fresco. Não foram observadas diferenças entre o percentual de folículos morfologicamente normais no tecido somente criopreservado e criopreservado seguido do cultivo in vitro. A análise da viabilidade realizada após o cultivo in vitro de tecido ovariano revelou que apenas a solução de congelação composta por DMSO adicionado de SFB (75,6%) foi capaz de manter o percentual de folículos viáveis semelhante ao verificado no tecido cultivado sem prévia congelação (89,3%). Folículos pré-antrais caprinos considerados morfologicamente normais após a análise ultraestrutural foram encontrados somente em tecido ovariano fresco, cultivado sem prévia congelação e congelados com DMSO+SFB. Em conclusão, a solução de congelação composta por DMSO associado ao SFB garantiu a manutenção da viabilidade, bem como da ultraestrutura folicular após 48 horas de cultivo in vitro. Palavras-chave: Folículo pré-antral. Solução de congelação. Agente criprotetor.

10 21 ABSTRACT The cryopreservation of ovarian tissue has been the target of intense study with the purpose of assisting in the technology of assisted reproduction in animals and humans. For the success of cryopreservation, the composition of the freezing solution, especially the intracellular cryoprotectant agent used is of fundamental importance. Thus, this study aimed to define a solution for slow freezing of ovarian tissue goat. For this, two experiments were conducted. In experiment I, fragments of goat ovarian cortex were subjected to slow freezing in the presence of 12 different solutions containing 1.0 M ethylene glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO) as intracellular cryoprotectants, associated or not sucrose and / or fetal calf serum (FCS). In experiment II fragments previously frozen in solutions containing DMSO supplemented or not with sucrose and / or FCS were cultured in vitro for 48 hours. To assess follicle after thawing was used histology and viability test by fluorescent markers (ethidium homodimer-1 and calcein-am) in experiments I and II, in addition, to ultrastructural analysis by transmission electron microscopy in experiment II regarding the statistical analysis, the effect of different cryoprotectant agents and interaction with supplements was used ANOVA followed by SNK test, while data concerning the viability were compared by chi-square. Values were considered significant when p <0.05. The first experiment showed that only solutions containing DMSO were able to maintain follicular morphology similar to that observed in fresh tissue. No significant differences were observed among the percentage of morphologically normal follicles in ovarian tissue cryopreserved before and after in vitro culture. After in vitro culture of ovarian tissue, the viability analysis showed that only the freezing solution composed by DMSO and FCS (75.6%) maintained the percentage of viables follicles similar to that observed after culture without cryopreservation (89.3%). Preantral follicles considered morphologically normal after ultrastructural analysis were found out in the fresh control, fragments cultured before and after cryopreservation with DMSO and FCS. In conclusion, the freezing solution containing DMSO and FCS guarantee the maintenance of viability as well as the follicular ultrastructure after short-term in vitro culture. Key-words: Preantral follicle. Freezing solution. Cryoprotectant agente.

11 22 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilato aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase) Adaptado de Corley et al. [25] Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase) Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75] Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabólicos Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et al.,[91]) CAPÍTULO 2 Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-am (green flourescence) (A) and non-viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer-1 (red fluorescence) (B) Figure 2 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles before (fresh control) and after slow-freezing. *Differs significantly from the fresh control (P < 0.05) Figure 3 Goat preantral follicles from the fresh control (A, B) and cultured control (C, D). In A, a well-preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high magnification, note that ooplasm is finely granular and the mitochondria are well-

12 23 preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC: granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; * vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C) 1µm (B, D) 102 Figure 4 Goat preantral follicles after cryopreservation with freezing solution containing DMSO alone (A, B) and DMSO added by sucrose (C, D), fetal calf serum alone (E, F) or fetal calf serum in combination with sucrose (G, H), followed by in vitro culture for 48 h. In A, normal granulosa cells are showed; however a vacuolated ooplasm can be observed. In B and C, note alterations as detachment between granulosa cells and oocyte, in D irregular mitochondria and swollen endoplasmic reticulum are showed in the oocyte, besides the nuclear membrane thickening. (E) Note normal ooplasm finely granulated and abundant organelles. (F) Intact nuclear membrane and normal mitochondria and endoplasmic reticulum. (G) Normal granulosa cell and oocyte with an irregular nucleus. (H) Oocyte with swollen mitochondria and vacuolated ooplasm. GC: granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; * vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C, E, G) 1µm (B, D, F, H)

13 24 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 Tabela 1: Principais resultados com a utilização de diferentes agentes crioprotetores na criopreservação de tecido ovariano e oócitos CAPÍTULO 2 Table 1 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in goat ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by short-term in vitro culture (48 h). *Differs significantly from the fresh control (P < 0.05) Table 2 Percentage (mean ± SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48 h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose and/or fetal calf serum. a,b,c Differs significantly (P <.05)

14 25 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS C Graus Celsius a.c. Antes de cristo Ac. Acido ACP Agente(s) crioprotetor(es) ADH Álcool desidrogenase AGAT Alanina glioxilato aminotrasferase ALDH Aldeído desidrogenase AM Grupamento acetoximetil AMPc Adenosina monofosfato cíclico AO Aldeído oxidase ATP Adenosina trifosfato BSA Albumina sérica bovina Ca 2+ - Cálcio cm - Centímetros CO 2 Gás carbônico CPA Cryoprotectant agent DMS - Dimetilsulfuro DMSO - Dimetilsulfóxido DMSO 2 - Dimetilsulfona DNA Ácido desoxirribonucléico EG - Etilenoglicol FSC Fetal calf serum g - Grama GD- Glicolato desidrogenase GLI - Glicerol GLM General linear models GLUr Glutationa reduzida GO Glicolato oxidase h Hora(s) HE Hematoxylin - eosin HEPES Ácido (N-[2-Hidroximetil] Piperazina-N`-[2-Etanosulfônico]4-(2- hydroxythyl)

15 26 HMEM- Meio essencial mínimo tamponado com HEPES ITS- Insulina transferrina selênio K + - Potássio kg- Quilograma kv Quilo volts LDH Lactato desidrogenase M - Molar MAPK Proteína quinase ativadora de mitose MEM - Meio essencial mínimo MET Microscopia eletrônica de transmissão mg Miligrama min Minuto(s) ml - Mililitro mm - Milimolar mm 3 - Milímetro cúbico MOIFOPA Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais MPF Fator promotor de mitose MSM - Metilsulfonilmetano Na + - Sódio ph Potencial hidrogeniônico PROH - Propanodiol SAC - Sacarose SAS Statistical analysis system SD Standard deviation SFB Soro fetal bovino SH Soro humano SSS Substituto sintético do soro TEM Trasmission electron microscopy v:v Volume/volume µl Microlitro µm Micrômetro µmol - Micromolar

16 27 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Ovário dos mamíferos: organização morfológica e folicular Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido ovariano Agentes crioprotetores Agentes crioprotetores intracelulares Agentes crioprotetores extracelulares Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação CAPITULO 1. (Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos) JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS Geral Específicos CAPÍTULO 2. (Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum maintains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue) CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106 APÊNDICE A 128

17 1 INTRODUÇÃO A biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos ovariano pré-antrais (MOIFOPA) compreende três diferentes processos: o isolamento, a preservação e o cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2008). O isolamento folicular já está bem estabelecido, enquanto que a preservação e o cultivo ainda necessitam de ajustes para a determinação de um protocolo ideal a fim de que se possa obter oócitos viáveis e competentes, aptos a serem fertilizados e produzirem embriões in vitro. Especificamente, com relação à preservação, que é o tema principal desta dissertação, essa técnica pode ser realizada por um período curto (resfriamento) ou prolongado (criopreservação). A criopreservação é uma ferramenta de grande interesse para a reprodução assistida, uma vez que a preservação de gametas femininos pode assegurar a conservação de espécies animais, além de ser uma estratégia para possibilitar a restauração da fertilidade, por meio de transplante, tanto na espécie humana (BEDAIWY & FALCONE, 2004) como em linhagens especiais de animais de laboratório (camundongo:liu et al, 2008) ou de produção (ovino: BORDES et al 2005). De um único ovário podem ser recuperados milhares de folículos pré-antrais, e consequentemente os oócitos neles contidos. Esta prática seria uma fonte potencialmente rica de material genético para a reprodução animal se os oócitos pudessem ser preservados e, posteriormente, crescidos e maturados após cultivo folicular in vitro visando a produção in vitro de embriões. Contudo, não é possível, em um único momento, a manipulação da totalidade de folículos pré-antrais que se pode recuperar de um único ovário (35.000/ovário caprino LUCCI et al., 1999) sem comprometer a viabilidade folicular. Portanto, o desenvolvimento de protocolos para a preservação desses folículos é de fundamental importância com o intuito de permitir a implantação de bancos de reservas genéticas, até que sejam desenvolvidos protocolos ideais capaz de promover o completo desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro. Neste contexto, vários protocolos de criopreservação de tecido ovariano, utilizando a congelação lenta, têm sido empregados no intuito de assegurar a viabilidade de folículos pré-antrais após criopreservação do tecido ovariano de animais domésticos (ovino: PINTO et al., 2008; caprino: LUZ et al., 2009; bovino: CELESTINO et al., 2008). Entretanto, um protocolo eficiente para tecido ovariano caprino ainda não foi

18 17 desenvolvido e muitas questões referentes à criopreservação de folículos pré-antrais ainda precisam ser elucidadas, como por exemplo, o efeito da associação de crioprotetores intracelulares aos extracelulares e a adição de macromoléculas à solução de criopreservação. O presente trabalho inicialmente apresenta uma descrição geral sobre o ovário mamífero e a estrutura folicular; criopreservação de tecido ovariano; agentes crioprotetores, bem como a avaliação de folículos ovarianos pré-antrais criopreservados. Esse estudo também traz uma vasta revisão a cerca dos Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos. Além disso, a contribuição científica para o campo da criopreservação de material genético de fêmeas, utilizando o ovário caprino como modelo experimental. 2 - REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Ovário dos mamíferos: Organização morfológica e folicular O ovário mamífero não é apenas a gônada feminina que contém o suprimento de células germinativas para produzir as próximas gerações (função exócrina ou gametogênica-produção e liberação dos gametas), mas é também a glândula reprodutiva feminina que controla alguns aspectos do desenvolvimento e fisiologia da fêmea, como a produção de esteróides sexuais - esteroidogênese (EDSON et al., 2009). A organização básica dessa gônada é estabelecida nas fases iniciais da organogênese, durante a vida fetal, com exceção dos roedores, em que, especificamente a formação de folículos ovarianos é verificada até um curto período de tempo após o nascimento (FORTUNE, 1994). Na maioria das espécies, histologicamente são observadas duas regiões, uma interna (medular) e uma região externa, denominada cortical. A região medular é constituída por tecido fribroelástico distribuído de forma irregular, algumas células musculares lisas, feixes nervosos, vasos linfáticos e sanguíneos que adentram o córtex ovariano e são responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ & HAFEZ, 2004). A região cortical contém inúmeros folículos ovarianos em diferentes estádios de desenvolvimento, corpos hemorrágicos, lúteos, albicans e uma população de células mesenquimais pouco diferenciadas, muito semelhantes às células mesenquimatosas embrionárias, que podem sofrer grandes e complexas modificações durante a vida

19 18 reprodutiva. Estas últimas se diferenciam em células da teca interna e externa e são de fundamental importância na esteroidogênese. O folículo ovariano corresponde à unidade morfológica e funcional do ovário e é constituído essencialmente por um oócito circundado por células foliculares (granulosa) e demarcado por uma membrana basal (FORTUNE, 1994), que os separa do estroma ovariano, e tem como principal função proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito (GORDON, 1994). De acordo com características morfológicas, os folículos ovarianos podem ser divididos em folículos pré-antrais ou folículos antrais (GONÇALVES et al., 2002). Os folículos pré-antrais são caracterizados pela ausência de cavidade antral e podem ser classificados em primordiais, transição, primários e secundários de acordo com o estádio de desenvolvimento. Os folículos primordiais, que se encontram em um estágio de quiescência (CORTVRINDT & SMITZ, 2001), são considerados reservatórios de gametas femininos (QU et al. 2000) e são caracterizados pela presença de uma camada de células da granulosa em formato pavimentoso. Já os primários e secundários são considerados folículos em estágios iniciais de crescimento e, são caracterizados pela presença do oócitos circundado por uma ou mais camadas de células de granulosa de formato cúbico, respectivamente (FIGUEIREDO et al.., 2008). Por outro lado, os folículos que apresentam uma cavidade repleta de líquido folicular, denominada antro, pertencem à categoria de folículos antrais, sendo subdivididos em folículos terciários e pré-ovulatórios. Em ambas as classes, os folículos possuem um oócito circundado pela zona pelúcida, células foliculares, uma cavidade contendo líquido folicular, membrana basal e as camadas de células da teca interna e externa. Especificamente, os folículos pré-ovulatórios apresentam uma ampla cavidade antral e um oócito apto a retomar a meiose e completar a maturação, ou seja, passar do estádio de prófase I para metáfase II (BARNETT et al., 2006). Estudos têm demonstrado que cerca de 90% dos folículos ovarianos encontram-se na fase de folículos pré-antrais, sendo a grande maioria (95%) representada por folículos primordiais (SAUMANDE, 1991). Os folículos antrais, por sua vez, representam apenas aproximadamente 10% de toda a população folicular do ovário e são extremamente susceptíveis à morte folicular (FIGUEIREDO et al., 1995). De maneira geral, em primatas e ruminantes a quantidade de folículos presentes em

20 19 cada ovário é estabelecida ainda durante a vida fetal sendo possível encontrar, já ao nascimento, a presença de folículos em estádios iniciais de desenvolvimento (primário e secundário) e pequenos folículos antrais, porém, devido à afuncionalidade do eixo hipotálamo-hipose-gonadal não progridem para estádios mais avançados antes da puberdade (BETTERIDGE et al., 1989). No entanto, Bukovsky et al. (2004) demonstraram possíveis mecanismos que indicam a formação de folículos ovarianos em mulheres adultas. O número total de folículos por ovário varia entre espécies, sendo de aproximadamente na camundonga (SHAW et al., 2000); na ovelha (AMORIM et al., 2000); aproximadamente na mulher (ERICKSON et al., 1986) e folículos pré-antrais na cabra (LUCCI et al., 1999). Porém a população de folículos pode variar também em função de fatores como raça, genética (SMITH et al., 1993), idade (ROY & TREACY,1993) e estado reprodutivo do animal (ERICKSON et al., 1986). Desta forma, considerando a abundância de folículos pré-antrais presentes no tecido ovariano, aliada às características intrínsecas que favorecem à criotolerância, como baixa taxa metabólica, tamanho reduzido e ausência de zona pelúcida, a criopreservação de oócitos nesta fase representa uma alternativa promissora para a preservação de gametas femininos (AMORIM et. al., 2003). 2.2 Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido ovariano A conservação do tecido ovariano, e consequentemente dos folículos préantrais nele presente, tem atraído o interesse de clínicos e pesquisadores, visto que a eficiente criopreservação do tecido ovariano possibilitaria um grande avanço para a reprodução assistida animal e humana. O tecido ovariano previamente criopreservado pode ser utilizado em auto e xenotransplante, possibilitando a retomada das funções endócrina e gametogênica (LIU et. al., 2008). Além disso, pode ainda ser destinado ao cultivo in vitro dos folículos pré-antrais isolados (GOSDEN et. al., 2002), sendo uma alternativa de grande interesse para mulheres acometidas de câncer, evitando, portanto, a reintrodução de células malígnas, o que é possível ocorrer após transplante (AMORIM et al., 2009). A criopreservação consiste na conservação de material biológico a temperaturas ultra-baixas, com o objetivo de garantir a permanência das células em uma

21 20 baixa taxa metabólica durante um período de estocagem indeterminado, do qual possam ser resgatadas e continuar o seu desenvolvimento (PEGG, 2007) e função normais após o processo de descongelação. Para tanto, o material é armazenado geralmente em nitrogênio líquido a 196 C. Porém, para garantir as propriedades estruturais e funcionais normais de um material biológico que foi submetido a um protocolo de criopreservação, é necessário considerar cuidadosamente alguns fatores como a composição da solução de criopreservação, especialmente no que compete à escolha do tipo e concentração do agente crioprotetor intracelular utilizado, bem como, a associação com crioprotetores extracelulares. Outro fator que deve ser levado em consideração no estabelecimento do protocolo de congelação é o tipo e organização estrutural do material a ser criopreservado. Assim, o desenvolvimento de protocolos para congelação de tipos celulares isolados em suspensão, como espermatozóides, oócitos ou embriões, torna-se relativamente menos complexo, quando comparado com a congelação de tecidos ou folículos, visto que estes são formados por diferentes tipos celulares (NEWTON et al., 1998). No entanto, a congelação de folículos isolados apresenta entraves tanto em decorrência dos possíveis danos causados pelo próprio método de isolamento, como pela perda de viabilidade, pelo elevado tempo de manipulação. Embora alguns estudos visem desenvolver protocolos de criopreservação de folículos pré-antrais isolados (DE LA PEÑA et al., 2002; AMORIM et. al., 2003), a maneira mais prática e rotineiramente adotada, que possibilita a conservação de uma grande quantidade de folículos préantrais, é a criopreservação do tecido ovariano. 2.3 Agentes crioprotetores Os agentes crioprotetores (ACP) são solventes orgânicos, utilizados sozinhos ou em associação, que agem protegendo a célula durante o período de estocagem em baixas temperaturas, prevenindo-a dos danos causados pela formação de gelo intra/extracelular ou choque osmótico (HAN et al., 2009). Esses agentes podem ser classificados em intracelulares (penetrantes) ou extracelulares (não penetrantes) Agentes crioprotetores intracelulares Os ACP intracelulares possuem baixo peso molecular e têm a capacidade de

22 21 substituir a água presente no espaço intracelular. De modo geral, os ACP que têm demonstrado melhor eficiência na manutenção da viabilidade e características estruturais e ultraestruturais de folículos pré-antrais após criopreservação são o etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e propanodiol (PROH). Apesar dos benefícios obtidos com a utilização dos ACP, a eficiência dessas substâncias pode variar com as características inerentes ao próprio ACP (tipo, concentração e tempo de exposição) ou inerentes ao material biológico (tipo celular ou tecidual, estádio de desenvolvimento da estrutura e espécie animal). Além disso, a toxicidade do ACP não pode ser negligenciada e é um dos fatores limitantes para o sucesso de um protocolo de conservação. A estrutura, metabolização e mecanismos tóxicos, bem como a utilização dos principais agentes crioprotetores utilizados estão descritos no capitulo I desta dissertação Agentes crioprotetores extracelulares Visando otimizar a eficácia das soluções de congelação, frequentemente são utilizadas substâncias que, apesar de não penetrarem na célula, auxiliam no processo de criopreservação. Muitas macromoléculas possuem ação crioprotetora comprovada, conferindo maior estabilidade à célula quando esta é exposta a baixas temperaturas (EROGLU et al., 2009). Estas substâncias possuem a capacidade de preservar a integridade estrutural e funcional da membrana celular (HUANG et al., 2008) devido à interação com proteínas e glicoproteínas de membrana (DUNAN e FORD-LLOYD, 2004). Dentre os crioprotetores extracelulares, a sacarose, carboidrato composto por uma frutose e uma glicose, é utilizada com bastante freqüência nas soluções de criopreservação, pois além de sua capacidade crioprotetora, essa substância age como um tampão osmótico contra o estresse celular causado durante a adição e remoção do crioprotetor intracelular (MANDELBAUM et al., 1988). A sacarose já foi utilizada com sucesso na crioproteção de oócitos caprinos (SHARMA et al., 2006) e humanos (COTICCHIO et. al., 2006); tecido ovariano de diferentes espécies (caprino: SANTOS et al., 2006a; ovino:cecconi et al., 2004; ONIONS et al 2008; bovinos: LUCCI et al., 2004; humanos: KEROS et al., 2009). A adição de sacarose à solução de congelação aplicada a oócitos humanos tem demonstrado ser eficiente, resultando em altas taxas de

23 22 sobrevivência, melhor preservação da configuração do fuso e dos cromossomos, bem como obtenção de embriões de qualidade superior (BARRITT et al., 2007; PARMEGIANI, et al., 2008). Do mesmo modo, Santos et al. (2006b) observaram que a adição de sacarose ao meio de congelação contendo EG é benéfica para manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano caprino. Outro componente amplamente utilizado nas soluções de congelação é o soro fetal bovino (SFB). Sua composição não é bem definida e varia em função do sexo, idade e raça do feto, mas é conhecido por possuir diversas substâncias como proteínas, carboidratos, aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento e hormônios (PICTON et al., 2008), que podem atuar positivamente na crioproteção celular durante o resfriamento a baixas temperaturas. Comumente empregado na proporção de 10 a 20%, o SFB tem sido utilizado em soluções de congelação de tecido ovariano (caprino: LUZ et al., 2009; camundongas: CHOI et. al., 2008), oócito (bovino: KIM et. al., 2001), tecido testicular (camundongo: MILAZZO et. al., 2008; macaco: JAHNUKAINEN et. al., 2007), células precursoras neurais (camundongo: MILOSEVIC et. al., 2005), córnea (suíno: HALBERSTADT et. al.; 2001; bovino: FAN et. al., 2009) e espermatogônias (bovino: IZADYAR, et. al., 2002). 2.4 Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação A eficiência do protocolo empregado na criopreservação de tecido ovariano pode ser verificada pela: 1) manutenção da estrutura morfológica e ultra-estruturtal dos folículos (KEROS et al., 2009) e do próprio estroma (MARSELLA et al., 2008); 2) pela viabilidade folicular (SOLEIMANI et al., 2006); 3) pela capacidade de desenvolvimento e produção de hormônios durante o cultivo in vitro (WALLIN et al., 2009) ou 4) in vivo (WANG et al., 2002). Estes parâmetros podem ser avaliados, respectivamente, por estudos morfológicos, comumente empregando histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão, testes de viabilidade, por meio de corantes vitais e/ou marcadores fluorescentes, bem como através da observação do desenvolvimento folicular após cultivo in vitro ou in vivo (transplante). A histologia clássica permite a observação de alterações estruturais relacionadas à disfunção e morte celular, como picnose, retração citoplasmática do oócito, destacamento da membrana basal, desorganização das células da granulosa. Já a

24 23 microscopia eletrônica de transmissão, permite uma avaliação mais detalhada da estrutura folicular, com visualização das organelas citoplasmáticas, vacuolização, alterações de membrana e integridade de junções celulares. Contudo, os estudos morfológicos realizados imediatamente após a descongelação podem não ser indicadores suficientes da eficácia do procedimento de criopreservação, uma vez que a morfologia nem sempre está relacionada com a competência de desenvolvimento folicular (SANTOS et al., 2007). Dentre os métodos de análise de viabilidade, o uso de marcadores fluorescentes que indiquem a presença de atividade enzimática no interior da célula associado a outros marcadores que revelem danos na membrana mostra-se confiável, merecendo destaque os marcadores calceína- AM e Etídio Homodimero-1, respectivamente. A Calceína é um marcador cuja ligação com um grupamento acetoximetil (AM) impede a emissão de fluorescência pelo bloqueio dos sítios de ligação com o Cálcio. Ao penetrar nas células, as enzimas esterases, ativas apenas em células vivas, clivam esta ligação com grupamento AM. Uma vez livre, a calceína conjuga-se com o cálcio intracelular e passa a emitir uma fluorescência verde quando excitada pela radiação ultravioleta (NERI et al., 2001). Por outro lado, o Etídio Homodímero 1 é um composto de alto peso molecular capaz de penetrar apenas em células que apresentem algum dano de membrana. Dentro da célula este composto conjuga-se com ácidos nucléicos, especialmente com DNA, e passa a emitir fluorescência vermelha quando excitado por radiação (GATTI et al., 1998). Logo após a criopreservação podem ocorrer alterações moleculares que se manifestam com a retomada do metabolismo e desenvolvimento folicular (Siebzehnrübl et al. 2000). Para evidenciar estas possíveis alterações, diversos estudos tem destacado o cultivo in vitro como uma ferramenta valiosa para verificar a capacidade de desenvolvimento de folículos pré-antrais previamente criopreservados (Cecconi et al 2004; Tsuribe et al, 2009; Borges et al 2009; Faustino et al, 2010). Após congelação do tecido ovariano de camundongas seguida de cultivo foi relatado o crescimento in vitro de folículos isolados, porém com uma taxa de desenvolvimento e sobrevivência folicular inferior àquela obtida com o tecido fresco (NEWTON & ILLINGWORTH, 2001). Um estudo realizado com folículos pré-antrais de camundongas, isolados a partir de tecido ovariano fresco e criopreservado, demonstrou que folículos previamente congelados desenvolvem-se mais lentamente quando comparado aos folículos não submetidos a este procedimento (Segino et al., 2005). Choi et al (2008) demonstraram

25 24 que a criopreservação suprime temporariamente a proliferação das células da granulosa de folículos pré-antrais de camundongas, o que pode estar relacionado ao atraso no desenvolvimento folicular. No entanto, recentemente foi mostrado que folículos isolados derivados de tecido vitrificado apresentaram crescimento folicular e maturação oocitária similar aos folículos não vitrificados (HAIDARI et al, 2008).

26 25 CAPÍTULO 1 Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos Intracellular Cryoprotectant Agents: Characteristics and Use of Ovarian Tissue and Oocyte Cryopreservation Periódico: Acta Scientiae Veterinarie (Publicado 2011, 39(2): 95)

27 26 Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos Intracellular cryoprotective agents: characteristics and use in cryopreservation of ovarian tissue and oocytes Simone Vieira Castro 1, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Luciana Rocha Faustino, José Ricardo de Figueiredo, Ana Paula Ribeiro Rodrigues Laboratório de manipulação de oócitos e folículos ovarianos pré-antrais LAMOFOPA, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil. Abstract Background: The application of cryopreservation in human and animal reproductive medicine has stimulated several studies about the effects of low temperatures and freezing processes on cells and tissues, in order to develop efficient protocols for gamete and embryo preservation. Moreover, cryopreservation is a fundamental tool for the establishment of animal germplasm banks, allowing the preservation of genetic material from several species and breeds or for further study and/or recovery of desirable characteristics. For the success of cryopreservation, the addition of an intracellular cryoprotectant agent in the freezing solution is indispensable. However, issues related to intracellular cryoprotectant agents used, e.g., their metabolism and

28 27 potential toxicity, must be examined carefully so we can choose the cryoprotectant most suitable for a specific structure. Review: In this regard, this review introduces several aspects of cryopreservation, such as basic principles and methods used (slow freezing and vitrification), describing the fundamental steps of cryoprotectant agent s exposure, cooling, storage, thawing or warming and removal of the cryoprotectant agent. The addition of an intracellular cryoprotectant to the freezing solution is essential, but does not guarantee the success of the cryopreservation protocol, due to its toxic effect, which requires a perfect balance between cryoprotectant concentration, temperature and exposure time to the structure which will be cryopreserved. Some studies attribute the toxicity of these agents mainly to the secondary metabolites formed when the cell resumes its activity and gradually begins to metabolize the cryoprotectant agent. These secondary metabolites, such as lactate resulting from the degradation of propanediol and the production of oxalic acid after the catalysis of ethylene glycol, can interfere in a number ways on cellular homeostasis, resulting from an acid-base imbalance with cellular acidosis until the uncoupling of oxidative phosphorylation in the mitochondrial membrane, preventing the production of adenosine triphosphate. In addition, there are characteristics of tissue s formation and metabolic peculiarities inherent to each species, resulting in differences in optimal conditions required to maintain the biological properties of cells after thawing. Therefore, in addition to the knowledge about the chemical and biological characteristics of the most suitable cryoprotectant agent for a given species, it is also necessary to adjust the concentration and exposure time to it, allowing a more efficient preservation of various cell types. Conclusion: Cryopreservation is a valuable tool for female gametes preservation, providing support for several reproductive biotechnologies allowing safeguard the

29 28 genetic material and facilitating its propagation. However, the success of this procedure depends on the proper use of a cryoprotectant agent, which application, although essential, can cause irreversible cell damage that can result in cellular death. Although there is no ideal cryoprotectant agent, able to protect completely the cell at low temperatures and also to be free of toxicity, it has been demonstrated that the cryoprotectants currently employed enabled the preservation of oocytes and ovarian tissue allowing the in vitro production of embryos and the restoration of fertility after transplantation. Keywords: cryopreservation, female gamete, ethylene glycol, propanediol, dimethylsulphoxide, glycerol. Descritores: criopreservação, gameta feminino, etilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, glicerol. I. INTRODUÇÃO II. FUNDAMENTOS DA CRIOPRESERVAÇÃO 1. Métodos de criopreservação III. IV. HISTÓRICO DOS AGENTES CRIOPROTETORES AGENTES CRIOPROTETORES INTRACELULARES 1. Etilenoglicol a. Obtenção e aplicações b. Metabolização e mecanismo tóxico c. Utilização do EG na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos 2. Dimetilsulfóxido a. Obtenção e aplicações

30 29 b. Metabolização e mecanismo tóxico c. Utilização do DMSO na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos 3. Propanodiol a. Obtenção e aplicações b. Metabolização e mecanismo tóxico c. Utilização do PROH na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos 4. Glicerol a. Obtenção e aplicações b. Metabolização e mecanismo tóxico c. Utilização do GLI na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos V. CONCLUSÃO VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS I. INTRODUÇÃO Nos últimos anos, a criotecnologia tem conquistado grande destaque tanto na medicina reprodutiva humana quanto na reprodução animal, seja através da criopreservação de embriões [58]; células germinativas masculinas [12] ou femininas [65] ou mesmo através da criopreservação de tecido gonadal como ovário [92]. A criopreservação tem como princípio básico a redução da temperatura como forma de reduzir o metabolismo celular, permitindo que as células ou os tecidos sejam conservados por períodos indeterminados, permitindo a retomada do desenvolvimento celular normal após o armazenamento [86] em nitrogênio líquido (-196 C). No entanto,

31 30 o sucesso dessa técnica depende de uma delicada e complexa interação entre importantes variáveis, que envolve tanto questões físicas, como o volume da solução de criopreservação e as taxas de resfriamento; quanto questões químicas referentes à composição da solução de criopreservação. Além disso, para reduzir ou evitar as injúrias induzidas pelas baixas temperaturas é essencial a adição de substâncias que proporcionem uma crioproteção celular e tecidual durante a redução da temperatura [108]. Essas substâncias, conhecidas como agentes crioprotetores (ACPs) são fundamentais para o sucesso da criopreservação. Embora, os ACPs sejam absolutamente necessários e amplamente utilizados nos protocolos de criopreservação, os mecanismos que conferem proteção ao material biológico, bem como a toxicidade e a metabolização celular destes agentes não são completamente esclarecidos e abordados na literatura. Neste contexto, a presente revisão tem como objetivo descrever os aspectos ligados ao processo de criopreservação, ressaltando os ACPs intracelulares, isto é, aqueles que atravessam a membrana celular e, portanto, evitam, sobretudo, a formação de gelo no interior da célula. II. Fundamentos da criopreservação A criopreservação consiste na conservação do material biológico, por tempo indefinido, a temperaturas negativas [94], para que quando descongelado, o material biológico possa prosseguir seu desenvolvimento normal [86]. A temperatura em que é realizada a criopreservação é conhecida como temperatura criogênica, isto é, temperatura extremamente baixa na qual os gases encontram-se liquefeitos à pressão atmosférica [94]. Essa temperatura é obtida com o nitrogênio líquido, cuja temperatura é de -196 C, ou em sua fase de vapor [54], na qual a temperatura varia em função da

32 31 distância entre a amostra e o nível de nitrogênio líquido. À temperatura criogênica, todas as reações químicas, processos biológicos, bem como as atividades intra e extracelulares estão suspensas, portanto, teoricamente, uma célula ou tecido podem ser mantidos criopreservados indefinidamente [102]. Porém, para isso, é necessária a utilização de um ACP na composição da solução de criopreservação, cuja concentração depende do método de criopreservação empregado. 1. Métodos de criopreservação O processo de criopreservação pode ser realizado por dois métodos, isto é, a congelação lenta e a vitrificação. Independente do método utilizado, a criopreservação baseia-se em cinco etapas fundamentais: 1) exposição ao ACP, com a finalidade de permitir a difusão desses agentes nos compartimentos celulares; 2) resfriamento com redução da temperatura de forma gradual (congelação lenta) ou súbita (vitrificação), na qual a amostra passa da temperatura ambiente para a temperatura criogênica; 3) armazenamento ou estocagem, permitindo a preservação do material em temperatura ultrabaixa por períodos indefinidos; 4) descongelação ou aquecimento, etapa na qual ocorre o resgate do material criopreservado e retomada do metabolismo celular; e 5) diluição ou remoção do ACP, a fim de evitar, na presença de temperatura fisiológica ou ambiente, a produção de metabólitos secundários, o que intensificaria a ação tóxica destes aditivos. Os métodos de criopreservação divergem entre em si, principalmente, quanto à taxa de redução de temperatura empregada. A congelação lenta é caracterizada por uma redução gradual da temperatura, com o objetivo de reduzir o estresse térmico na fase de

33 32 transição das soluções do estado líquido para o estado sólido [96]. Além disso, é caracterizada também por uma desidratação celular gradual que evita ou reduz a formação de cristais de gelo. Nesta situação, baixas concentrações de ACP são suficientes a fim de que esses objetivos sejam alcançados [101]. Para o resfriamento lento, o material biológico geralmente é congelado sob o controle de um freezer programável e, uma vez atingido uma adequada desidratação celular, a qual ocorre quando a temperatura se encontra entre -30 a -80ºC, o material é estocado em nitrogênio líquido [85] à temperatura de -196 C. Por outro lado, a vitrificação consiste no método de criopreservação na qual a redução de temperatura ocorre de forma brusca, cujo objetivo é a obtenção de um sólido amorfo ou em estado vítreo, que difere do sólido cristalino por não haver formação de cristais de gelo no interior dos compartimentos celulares [114]. Contudo, para a obtenção desse estado vítreo é necessário, além de uma alta taxa de resfriamento (por exemplo, 2500 C/min), a utilização de uma solução de vitrificação com alta viscosidade, a qual é obtida com o emprego de elevadas concentrações de ACPs [27, 115]. Independente do método empregado, a adição de um ACP representa um fator chave para o sucesso da criobiologia, sendo indispensável sua presença para que as células possam resistir às injúrias resultantes do procedimento de criopreservação [87, 77, 71]. Contudo, os metabólitos resultantes da degradação dos ACPs pela célula podem ser tóxicos para as células, sendo este um fator limitante para o sucesso da utilização dos mesmos [32]. III. Histórico dos agentes crioprotetores

34 33 A descoberta acidental da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al. [88] durante as suas tentativas para preservar espermatozóides de aves revolucionou os métodos de criopreservação de diversas células e tecidos. No ano seguinte, Smith (Smith, 1950) estendeu as observações da função desse agente para a criopreservação de eritrócitos do sangue humano. Esses dois relatos foram fundamentais para identificar elementos chaves que desempenhariam um papel crucial na evolução do campo da biopreservação, como por exemplo, a) a necessidade de utilização de um ACP; b) o processo pelo qual as células poderiam ser expostas com sucesso a um ACP penetrante ou intracelular, bem como a c) a maneira de congelar e descongelar. Na década seguinte, exatos dez anos mais tarde, Lovelock e Bishop [63], descreveram a utilização do dimetilsulfóxido como ACP, cujas características conferem maior permeabilidade a vários tipos de células em relação ao Glicerol. Somente, a partir da década de 80, estudos já consideravam o efeito tóxico dos crioprotetores como um obstáculo para o sucesso da criobiologia [31]. Desde então, tem-se buscado novas substâncias capazes de proteger as células dos efeitos deletérios das baixas temperaturas e que não seja prejudicial às mesmas. Os ACPs são substâncias de classe orgânica variada, que agem protegendo a célula durante o período de estocagem em baixas temperaturas, prevenindo a formação de gelo intracelular e possíveis danos causados pela desidratação [46]. Dependendo do local de ação, os ACPs podem ser classificados como intracelulares ou extracelulares. Por razões didáticas, na presente revisão, serão abordados somente os ACPs intracelulares. IV. Agentes crioprotetores intracelulares Os crioprotetores intracelulares são solventes orgânicos de baixo peso molecular que possuem a capacidade de penetrar na célula [89]. Dentre os

35 34 crioprotetores intracelulares destacam-se, o etilenoglicol, o dimetilsulfóxido e o propanodiol por apresentarem uma capacidade de penetração superior a do glicerol e baixa toxicidade. Contudo, a eficiência destes ACPs pode variar em função da estrutura (célula ou tecido) a ser criopreservada [90], do tipo e concentração e tempo de exposição utilizado antes do processo de criopreservação propriamente dito. Além disso, as diferenças estruturais entre as espécies animais é também um fator que pode influenciar na eficácia de um ACP [37, 33]. De forma geral os ACPs intracelulares atuam substituindo parcialmente a água no interior da célula e ligam-se ao hidrogênio das moléculas de água intracelular [52], aumentando a viscosidade da solução de congelação, consequentemente, reduzindo o ponto de congelação da mesma. Além disso, os ACPs também agem prevenindo a exposição do material a altas concentrações de eletrólitos, através da ligação aos próprios eletrólitos ou pela substituição parcial pela água. Os tópicos subseqüentes apresentam uma descrição detalhada sobre as características dos agentes crioprotetores intracelulares mais amplamente utilizados nos processos de criopreservação de materiais biológicos. A tabela 1 mostra uma síntese dos principais resultados da utilização de diferentes agentes crioprotetores para a criopreservação de estruturas como o tecido ovariano e oócitos de diversas espécies 1. Etilenoglicol 1.a. Obtenção e aplicações