UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Beatriz Brunelli de Souza Diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum e espécies relacionadas (Gelidiales, Rhodophyta) no litoral brasileiro São Paulo 2014

2 Beatriz Brunelli de Souza Diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum e espécies relacionadas (Gelidiales, Rhodopyta) no litoral brasileiro Monografia apresentada ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos exigidos para a conclusão do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas. Orientador de Iniciação Científica: Dra. Mutue Toyota Fujii Nome Orientador de TCC: Dra. Ana Paula Pimentel Costa São Paulo

3 Diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum e espécies relacionadas (Gelidiales, Rhodophyta) no litoral brasileiro Beatriz Brunelli de Souza¹; Daniela Milstein²; Mutue Toyota Fujii 2 ; ¹Graduação em Ciências Biológicas UPM/Bolsista CNPq/PIBIC ² Instituto de Botânica- Núcleo de Pesquisa em Ficologia Esse Trabalho de Conclusão de Curso segue a formatação da norma da Revista científica Hoehnea do Instituto de Botânica de São Paulo. 3

4 BEATRIZ BRUNELLI DE SOUZA Diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum e espécies relacionadas (Gelidiales, Rhodophyta) no litoral brasileiro Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos exigidos para a conclusão do Curso de Ciências Biológicas. Aprovado em BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª Ana Paula Pimentel Costa Orientador Universidade Presbiteriana Mackenzie Prof.ª Dr.ª Daniela Milstein Instituto de Botânica Prof. Me. Allan Carlos Pscheidt Faculdades Metropolitanas Unidas 4

5 Agradecimentos À minha orientadora Dra. Mutue Toyota Fujii por tudo que tem me ensinado e por ter me ajudado desde que comecei minha iniciação científica no Instituto de Botânica e por sempre ter me proporcionado novas oportunidades e sonhos para seguir adiante. À Dra. Daniela Milstein por toda sua paciência, dedicação e contribuição não só no trabalho realizado mais, principalmente, para minha formação me passando o conhecimento e me ensinando sobre biologia molecular. Além da sua amizade Dani que é essencial e importante pra mim. Ao Instituto de Botânico por toda infraestrutura oferecida e por ter permitido a realização desse trabalho. Ao CNPq pelo incentivo técnico e financeiro, na forma de uma bolsa de Iniciação Científica dentro do programa PIBIC, que trouxe maior viabilidade para realização deste trabalho. Ao Me. Allan Carlos Pscheidt por ter aceitado o convite de ser parte da banca do meu trabalho e por todos os momentos divertidos que passamos no laboratório. À Universidade Presbiteriana Mackenzie, que ao longo desses quatro anos, junto com todo o corpo docente, que eu tive o prazer te ter aulas, foram importante para minha formação me proporcionando visões diferentes e novos argumentos a respeito de diversos assuntos. À Dra. Ana Paula Pimentel Costa por ter aceitado o convite de ser banca do meu TCC e pela sua contribuição nas sugestões. Aos meus pais e irmão por sempre terem me apoiado em todos os meus sonhos, me ajudado e me incentivado até o momento. Sem vocês nada disso seria possível. Pelas amizades que criei nessa jornada, em especial a Amanda Leite, Bianca Trassi e Mayra Jamas, que estavam lá ajudando de alguma forma, sempre oferecendo ótimos momentos de alegrias e compartilhando as horas difíceis também. 5

6 ABSTRACT - (Intraspecific diversity of Gelidium floridanum and related species (Gelidiales, Rhodophyta) in the Brazilian coast). The genetic diversity of Gelidium floridanum is little known. Because it is a species that is widely distributed along the Brazilian coast and has simple morphology subjected to phenotypic plasticity, it is essential to investigate their intraspecific diversity. This study the objective to verify the intraspecific diversity of G. floridanum along the coast of Brazil, based on sequences of molecular markers rbcl-3p and COI-5P. The samples were collected in PI, CE, RN, PB, BA, ES, SP and SC. Was then outlined the distribution pattern of populations of G. floridanum in the abovementioned regions and validated its occurrence from ES to SC. It was observed that on the coast of the ES occur two species not yet identified Gelidium. Samples collected in the northeast, although morphologically similar to G. floridanum actually belong Gelidium coarctatum. Key words: COI, diversity, Gelidiales, rbcl. RESUMO - (Diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum e espécies relacionadas (Gelidiales, Rhodophyta) no litoral brasileiro). A diversidade genética de Gelidium floridanum é pouco conhecida. Por se tratar de uma espécie que apresenta ampla distribuição no litoral brasileiro e possui morfologia simples sujeita à plasticidade fenotípica, é fundamental que seja investiga a sua diversidade intraespecífica. O presente trabalho teve por objetivo verificar a diversidade intraespecífica de G. floridanum ao longo do litoral do Brasil, com base em sequências dos marcadores moleculares rbcl-3p e COI-5P. As amostras foram coletadas no PI, CE, RN, PB, BA, ES, SP e SC. Foi delineado então o padrão de distribuição das populações de G. floridanum nas regiões acima mencionadas e validada a sua ocorrência do ES até SC. Foi observado que no litoral do ES ocorrem duas espécies ainda não identificadas de Gelidium. As amostras coletadas no nordeste, embora morfologicamente similares a G. floridanum, na verdade pertencem a Gelidium coarctatum. Palavras-chave: COI, diversidade, Gelidiales, rbcl. 6

7 Sumário Introdução... 8 Material e Métodos Resultados e Discussão...13 Moleculares...13 rbcl-3p...13 COI-5P Morfológicos Conclusões Literatura citada Anexos 7

8 Introdução A ordem Gelidiales Kylin inclui atualmente cerca de 200 espécies, distribuídas em 10 gêneros dentro de três famílias: Gelidiaceae, Gelidiellaceae e Pterocladiaceae (Schneider & Wynne 2007, Guiry & Guiry 2014). Gelidiales é caracterizada por apresentar talo pseudoparenquimatoso com organização uniaxial, histórico de vida trifásico com gametófitos e tetrasporófitos isomórficos, e ausência de célula auxiliar. O carpogônio é intercalar, com filamentos gonimoblásticos originando carposporângios. Os espermatângios são originados a partir da divisão transversal das células corticais (Fan 1961, Guiry & Womersley 1993). Gelidium floridanum W.R. Taylor pertence à família Gelidiaceae (Schneider & Wynne 2007) e foi descrita por Taylor (1943) a partir de material da Flórida (Estados Unidos) e de Trindad (América Central). Para o Brasil, G. floridanum foi citada pela primeira vez em São Paulo e Paraná por Ugadim (1970). Gelidium floridanum tem distribuição restrita às águas tropicas e subtropicais da costa Atlântica ocidental (Guiry & Guiry 2014). Ela é referida para as regiões da Flórida (localidade-tipo) (Littler et al. 2008), Costa Rica (Thomas & Freshwater 2001), Ilhas do Caribe (Duncan & Lee Lum 2006, Suárez 2005) e Venezuela (Freshwater et al. 1995). Entretanto, no Brasil, segundo Ugadim (1987), G. floridanum ocorre desde o norte do estado do Espírito Santo até o Rio Grande do Sul, embora ela tenha sido referida também para a região nordeste do país (Creed et al. 2010, Guimarães 2014). Ainda de acordo com Ugadim (1987, 1988), as referências de G. floridanum para o nordeste do Brasil podem estar equivocadas. A maioria dos estudos feitos com essa espécie são de levantamento florístico, por exemplo, Rindi et al. (2002), Suárez (2005) e Creed et al. (2010), sendo usado apenas o estudo morfoanatômico para sua identificação, ocasionando problemas na identificação, visto que as espécies de Gelidiales possuem grande plasticidade fenotípica, além de espécies crípticas. Diante disso, o estudo baseado exclusivamente em critérios morfológicos tem-se mostrado insuficiente para 8

9 delimitar adequadamente os gêneros e as categorias infragenéricas dessa ordem. Além disso, para uma determinação mais precisa leva-se em conta as estruturas reprodutivas, o que nem sempre é possível de ser encontrada. Com isso, o desenvolvimento de sequenciamentos de marcadores moleculares tem sido fundamental em estudos de reconhecimento de biodiversidade, filogenia e filogeografia de macroalgas. Além disso, os marcadores moleculares são utilizados para identificação rápida de espécies eucarióticas (McDevit & Sauders 2009, 2010) e ajudam a esclarecer as ambiguidades da taxonomia tradicional (Radulovici et al. 2010). A aplicação de dados moleculares aliados aos morfológicos está revelando vários aspectos importantes da flora marinha bentônica, tais como a presença de espécies crípticas, introdução de espécies exóticas, ocorrência de espécies novas para a ciência, novas ocorrências em águas brasileiras, novas combinações com coespecificidade de táxons, dentre outros. Podemos mencionar aqui a título de exemplo, os trabalhos de Milstein & Oliveira (2005), Fujii et al. (2006), Rocha- Jorge et al. (2010, 2013), Sutherland et al. (2011), Cassano et al. (2012a, 2012b), Costa et al. (2012), Milstein et al. (2012), Milstein & Saunders (2012), Oliveira-Carvalho (2012), dentre outros. Os resultados oriundos desses estudos mostraram que há variação genética intraespecífica em maior ou menor grau, dependendo da localização de suas populações e oferecem, assim, subsídios para a implementação de estudos em nível intraespecífico, onde a situação é ainda mais crítica. Os estudos moleculares com a ordem Gelidiales começaram em 1994 com Freshwater & Rueness, a partir de um estudo com base no marcador rbcl para a filogenia de Gelidium na Europa. Esse trabalho revelou que esse gênero era bastante complexo e que havia espécies identificadas de forma equivocadas, por exemplo, o Gelidium pusillum (Stackhouse) Le Jolisque ocorre apenas na Europa e não em várias partes do mundo. Utilizando o mesmo marcador molecular, Freshwater et al. (1995) realizaram uma análise filogenética, para a ordem Gelidiales, incluindo diversos gêneros. E isso também resultou em uma grande complexidade agora para toda a ordem. 9

10 Além disso, foram utilizados outros marcadores moleculares para os estudos de análises filogenéticas, como o LSU (sequência do gene que codifica a subunidade grande do RNA ribossômico - Freshwater & Bailey 1998) e as sequências nucleares das regiões espaçadoras internas ITS1 e ITS2 e do SSU (=18S rrna - Patwary et al. 1998). O marcador COI-5P e o UPA passaram a ser utilizados após o início dos estudos de DNA barcoding, sendo usados, respectivamente, por Freshwater et al.(2010) e Sherwood et al. (2010). Sendo que o COI-5P se revelou ser um marcador importante para a distinção de espécies muito próximas. Podendo analisar isso também com o trabalho de Kim & Boo (2012), que realizaram um estudo molecular juntamente com o morfológico para espécimes da localidade tipo de Gelidium crinale (Hare ex Turner) Gaillon e G. pusillum, conseguindo então acabar com a confusão de taxonomia que ocorria entre elas. Para o Brasil até o momento o estudo da ordem Gelidiales com base em sequência de marcadores moleculares foi feita por Iha (2014) para os estados do Sudeste e Sul. O gênero Gelidium tem uma importância econômica significativa, principalmente, por ser responsável pela produção de um polissacarídeo de alta qualidade devido à baixa quantidade de grupos sulfatados, o ágar, sendo possível produzir a partir de sua extração, por exemplo, a agarose e o ágar bacteriológico, que possuem inúmeras aplicações industriais e tecnológicas (Scariot 2010). Além disso, cerca de 40% de ágar que é produzido no mundo é proveniente do gênero Gelidium, isso está fazendo com que a tentativa de seu cultivo seja incentivada, visto que hoje em dia as espécies pertencentes a esse gênero têm sido coletadas em bancos naturais (Faccini 2007). O presente trabalho teve por objetivo verificar a diversidade intraespecífica de Gelidium floridanum de diferentes populações coletadas em oito estados, Piauí (PI), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Paraíba (PB), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), São Paulo (SP) e Santa Catarina (SC), a partir da obtenção e comparação das sequencias quanto à divergência em número de pares de bases de COI-5P (região 5 do gene cox1) e rbcl-3p (região 3 do gene rbcl e o espaçador rbcl-s). Delineando então o padrão de distribuição das populações de G. floridanum nas regiões acima mencionadas e validando a sua ocorrência. 10

11 Material e Métodos Coletas: As amostras de Gelidium floridanum para o presente trabalho foram obtidas a partir de populações do PI, CE, RN, PB, BA, ES, SP e SC. Locais de coleta, como estado, município e praia, as coordenadas geográficas desses locais registradas com um GPS (Global Positioning System), número de acesso ao material incluído no herbário (SP) e do Banco de dados de amostras para estudos moleculares do Laboratório de Biologia Molecular do Núcleo de Pesquisa em Ficologia, Instituto de Botânica (IBT) foram listados na tabela 1. Processamento das amostras: O material coletado foi limpo, triado e preservados de duas formas: para análise morfológica eles foram armazenados em formol 4 % e uma parte foi utilizada para confecção de exsicatas; e para os estudos moleculares eles foram secos em papel absorvente e colocados imediatamente e individualmente em sílica gel para secagem rápida. Estudo morfológico: Foi baseado em abordagens da taxonomia (Iha 2014) com estudos dos caracteres morfológicos vegetativos e reprodutivos, contemplando especialmente aqueles que são diagnósticos para a identificação das espécies. Os cortes anatômicos foram feitos à mão-livre com auxílio de lâmina de barbear, corados com azul de anilina a 1% e acidificados com HCl 1N. As ilustrações dos aspectos gerais e dos caracteres diagnósticos de cada espécie foram obtidas com câmera digital (Canon, Japão) acoplada diretamente à ocular do microscópio ou do estereomicroscópio (Zeiss, Alemanha). E, posteriormente, foi montada pranchas com as principais características juntamente com a descrição de cada espécie. Estudo molecular: O material seco foi macerado em um homogeneizador de tecidos (Precellys) e para a extração dos ácidos nucleicos foi utilizado o kit de extração de tecidos vegetais NucleoSpin Plant II (Machery-Nagel). O DNA extraído foi utilizado para a amplificação através 11

12 da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se "primers" específicos para cada região a ser amplificada (tabela 2). Os marcadores moleculares escolhidos para o presente estudo foram o rbcl- 3P (região 3 do gene rbcl e o espaçador rbcl-s que codifica a subunidade grande da enzima Rubisco e o espaçador), o COI-5P (região 5 do gene cox1 que codifica a subunidade I da citocromo c oxidase). A PCR foi realizada utilizando o ReadyMixTM Taq PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, MO, EUA) num volume total de 25 µl. Foi verificado que utilizando metade do volume dos produtos do kit que estava estabelecido no protocolo (50 µl), com exceção do volume de DNA que continuou a ser 1 µl, a reação de PCR funcionou normalmente. Após a PCR, os produtos foram analisados por eletroforese em gel de agarose 0,7%, em tampão tris-borato-edta e corado com GelRedTM (Biotium, Hayward, Califórnia), utilizando um marcador de tamanho (1 Kb DNA Ladder- Gibco BRL) para verificar os tamanhos dos fragmentos amplificados. Os produtos de PCR foram purificados utilizando a coluna GFX MicroSpin (GE Healthcare) e foram diretamente sequenciados. Os sequenciamentos do marcador molecular a partir dos produtos de PCR purificados e quantificados foram feitos pela empresa Macrogen advancing through genomics ( onde foram sequenciados em sequenciadores 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Análises dos resultados: As sequencias consenso para cada marcador de amostra foram montadas usando-se o programa Geneious a partir das sequencias obtidas nas direções direta e reversa. Nucleotídeos divergentes ocorrendo na mesma posição foram verificados nos cromatogramas das sequencias. As sequencias consenso obtidas foram comparadas com as sequencias disponíveis no GenBank ( com o uso do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, Altschul et al. 1997) e inseridas no banco de dados BOLD systems. As sequencias consenso geradas para cada espécime foram alinhadas em uma matriz, que foi submetida à análise de Distância (Neighbor-joining, NJ) no programa Mega 5.05 (Tamura et al. 2011) gerando uma 12

13 árvore de agrupamento e por parcimônia estatística pelo programa TSC 1.21 (Clement et al. 2000) gerando uma rede de haplótipos. Resultados e Discussão O número de indivíduos coletados de cada local, o total de amostras processadas, os marcadores que foram utilizados em cada amostra e quais já estão completamente sequenciados foram listados na tabela 3. As espécies foram inicialmente identificadas baseadas em caracteres morfo-anatômicos de acordo com a chave de identificação disponível em Iha (2014). Duas espécies foram identificadas a partir destes dados: Gelidium floridanum, ocorrendo do Espírito Santo até Santa Catarina, e Gelidium coarctatum Kützing, presentes nas localidades do Nordeste. Além de mais duas espécies que foram identificadas apenas a nível de gênero, sendo então referidas como Gelidium sp.1 e Gelidium sp.2. Moleculares rbcl-3p Para marcador rbcl-3p (537 pares de base, pb) foram sequenciadas 43 amostras. Para a análise de agrupamento, foram incluídas também amostras disponíveis no GenBank (GB) que são proximamente relacionadas as amostras obtidas neste projeto (Figura 1 e 2). As sequências das amostras , , , , e (ES), a (SP) e (SC) identificadas morfologicamente como G. floridanum, divergem em apenas 2 pb de G. floridanum da localidade tipo (número do GenBank U00107) para esse marcador, indicando tratar-se da mesma espécie. Esses espécimes não apresentaram divergência 13

14 intraespecífica, indicando haver apenas uma única população de G. floridanum, distribuídas do ES a SC. As amostras , , (ES) morfologicamente identificadas como G. floridanum, divergem em 15 pares de bases de G. floridanum da localidade tipo (U00107) para esse marcador, indicando não se tratar da mesma espécie. De acordo com as sequências disponíveis no GB, a sequência mais próxima dos espécimes acima é de Gelidium crinale (Hare ex Turner) Gaillon da Austrália (HQ412492) divergindo em 11 pb. Portanto, essas amostras serão referidas neste trabalho como Gelidium sp. 1, porque o alto número de bases divergentes não viabiliza a classificação dessa espécie como pertencente a mesma espécie de G. floridanum e nem de G. coarctatum. As sequências das amostras a (ES) não apresentaram diversidade intraespecífica. Elas são idênticas à sequência de G. floridanum da Costa Rica da costa atlântica (AF305797) e divergiram em 3 pb de Gelidium sclerophyllum W.R. Taylor da costa Pacífica de Costa Rica (KC192651). Essas espécies serão referidas como Gelidium sp. 2. As sequências das amostras 1566 (PI), 1688 (RN) 1523, 1717 (PB), 602, 603, , , a , (CE) e 350 (BA) identificadas morfologicamente como G. coarctatum divergiram 6 pb de Gelidium robustum (N.L. Gardner) Hollenberg & I.A.Abbott do México- Pacífico (HM629836) e 7 pb de Gelidium allanii V.J.Chapman da Nova Zelândia (L22458). Não foi possível comparar essas sequências obtidas com amostras de G. coarctatum, devido à falta de sequências dessa espécie disponíveis no banco de dados do GB. Foi encontrada diversidade intraespecífica de até 2 pb entre as amostras de G. coarctatum, resultando na ocorrência de três haplótipos distintos (Figura 2). COI-5P Para o marcador COI-5P (657 pb) 42 amostras foram completamente sequenciadas. As sequências obtidas foram comparadas com sequências depositadas no banco de dados GenBank. 14

15 Para a análise de agrupamento, foram incluídas todas as amostras sequenciadas, mais as amostras relevantes para esse estudo baixadas do GenBank (Figura 3 e 4). As sequências das amostras de Gelidium sp. 1, , e (ES) divergiram em 65 pares de base da sequencia de G. crinale da Austrália (HQ412466), confirmando o resultado obtido com o rbcl-3p de que se trata de uma espécie nova. Não foi encontrada divergência intraespecífica para esse marcador. As sequências das amostras de Gelidium coarctatum, 1566 (PI), 603, , , a , , , , e (CE), 1688, 1700, 1702 e 1708 (RN), 1523 e 1717 (PB) divergiram em 32 pb da sequência de G. robustum do Pacífico mexicano (HM629876). Foi encontrada diversidade intraespecífica de até 5 pb entre as amostras de G. coarctatum. Como ainda não existe sequencia de COI-5P de G. floridanum no Genbank, as sequências das amostras 1505, , , , , e (ES), ao (SP) e (SC) foram comparadas com as sequências disponíveis no GB e a menor divergência foi de 29 pb com G. sclerophyllum (KC288159). Também as amostras de Gelidium sp a (ES) divergiram em 27 pb de G. sclerophyllum. Para ambas as espécies não ocorreram divergência intraespecífica. Morfológicos No presente trabalho foram analisadas três espécimes de Gelidium floridanum, sendo um de cada respectivo estado: Espírito Santo (IBT1579-1), São Paulo (IBT1608) e Santa Catarina (IBT1631-1). Estes foram comparados com as análises feitas com um indivíduo de Gelidium coarctatum do Ceará (IBT1580) e um indivíduo de Gelidium sp. 2 do Espírito Santo (IBT1609). Gelidium floridanum W.R.Taylor 1943: 153 Holótipo: Herbário do Jardim Botânico de Nova York 15

16 Localidade tipo: Rio Indiano, Flórida, E. Palmer 47, 1874 Figuras 5-11 Planta formando tufos densos ou talos isolados, medindo de 3 a 6,5 cm de altura e 1mm de diâmetro, fixos ao substrato por apressórios do tipo brush-like, formado por estolões cilíndricos medindo 250 µm de diâmetro. Presença de uma única célula apical entre lobos. Ramificação pinada, alterna ou irregular, com presença de um eixo principal distinto e ramos de até 3º ordem. Ramos secundários seguem o mesmo padrão do eixo principal. Em corte transversal da região mediana do eixo principal, presença de 5 camadas de células medulares levemente alongadas, medindo µm de diâmetro, células corticais pequenas e redondas de 3 a 4 camadas, 6 µm de diâmetro. Presença de rizines espalhadas na região medular podendo ser variável quantitativamente. Tetrasporângios com 750 µm de comprimento e 500 µm de diâmetro, dispostos em soros no ápice dos ramos secundários. Não foram encontrados cistocarpos em nenhum espécime examinado. Material examinado: Brasil, Espírito Santo: Serra, Carapebus (coordenada 20 14'21"S e 40 12'45"O), 26-III-2013, (SP ); São Paulo: Itanhaém, Praia de Cibratel (coordenada S e O), 28-V-2013, (SP ); Santa Catarina: Florianópolis, Praia do Santinho (coordenada 27 26'59"S e 48 22'12"O), 16-XI-2013, (SP ). Gelidium coarctatum Kützing 1868: 21 Localidade tipo: Pernambuco, Brasil. Figuras Planta formando tufos densos ou talos isolados, medindo de 6 cm de altura e 1mm de diâmetro, fixos ao substrato por apressórios do tipo brush-like, formado por estolões cilíndricos medindo 365 µm de diâmetro. Presença de uma única célula apical saliente. Ramificação pinada, 16

17 alterna ou irregular, com presença de um eixo principal distinto e ramos de até 3º ordem. Ramos secundários seguem o mesmo padrão do eixo principal. Em corte transversal do eixo principal, presença de 5-6 camadas de células medulares arredondadas, medindo µm de diâmetro, células corticais pequenas e redondas de 3 a 4 camadas, 6 µm de diâmetro. Presença de rizines espalhadas de forma abundante na região medular externa e no córtex interno. Presença de soros de tetrasporângios dispostos no ápice dos ramos secundários, com tetrasporângios medindo 1 mm de comprimento e 550 µm de diâmetro. Não foram encontrados cistocarpos no espécime examinado. Material examinado: Brasil, Ceará: Caucaia, Praia do Pacheco (coordenada 3 40'58"S e 38 39'4"O), 28-VI-2013, (SP ). Gelidium sp. 2 Figuras Planta formando talos isolados, medindo de 3 cm de altura e 1mm de diâmetro, fixos ao substrato por apressórios do tipo brush-like, formado por estolões cilíndricos medindo 250 µm de diâmetro. Presença de uma única célula apical proeminente. Em corte transversal do eixo principal, presença de 3 camadas de células medulares arredondadas, 7-13 µm de diâmetro, células corticais pequenas e redondas com 3 a 4 camadas, medindo 5 µm de diâmetro. Presença de rizines espalhadas abundantemente na região medular interna. Presença de cistocarpos, medindo 300 µm de comprimento e 230 µm de diâmetro, dispostos no ápice dos ramos secundários. Não foram encontrados espécimes tetraspóricos. Material examinado: Brasil, Espírito Santo: Anchieta, Praia dos Castelhanos (coordenada 20 48'50"S e 40 37'55"O), 22-VI

18 Conclusões O COI tem sido usado com eficiência para a identificação e distinção de espécies de algas vermelhas. Corroborando com Kim & Boo (2012), esse marcador tem sido relevante para a distinção de espécies próximas. Entretanto, devido à variação de nucleotídeos na região dos primers é necessário o uso de combinações de diferentes primers (Iha 2014), como nesse estudo que foi feito utilizando essas combinações dentro de uma mesma espécie. O rbcl por ser mais conservado, ele é mais apropriado para análises filogenéticas e muito tem sido utilizada para a ordem Gelidiales (Freshwater et al. 2010), explicando o grande número de sequencias disponíveis no banco de dados GenBank. Os resultados encontrados tanto para as sequencias de COI como de rbcl corroboraram, validando, nesse estudo, a presença de G. floridanum apenas para as regiões sudeste e sul do Brasil, conforme sugerida por Ugadim (1987). Além disso, foi possível verificar, para essas regiões, que não houve nenhuma divergência intraespecífica entre esses indivíduos, resultando assim em uma única população, que realiza troca de genes entre si. Para o Espírito Santo, além da população de G. floridanum foram encontradas mais duas espécies (Gelidium sp. 1 e sp. 2), mostrando que essa é a região que mais apresenta diversidade. Essa distinção de espécies foi mais bem analisada com o COI por ter resultado em uma maior divergência entre as sequencias com as outras espécies dos indivíduos estudados e com amostras obtidas no GenBank. Com isso, segundo as análises, Gelidium sp. 2 é mais próxima de G. sclerophyllum do que de G. floridanum encontrada na mesma região, embora a divergência seja muito alta (27 pb) levando à hipótese de que essa seja uma nova espécie. O mesmo foi verificado para Gelidium sp.1, na qual no banco de dados tem como espécie mais próxima G. crinale, porém devido à alta divergência também foi sugerida como uma nova espécie. Para o nordeste não foi encontrado G. floridanum, o que leva a suposição de que as referências dessa espécie para essa região sejam equivocadas e confundidas com a espécie de 18

19 Gelidium coarctatum, que é bastante comum para o nordeste brasileiro, corroborando com os dados de Ugadim (1987). Apesar de não ter sido possível comparar molecularmente essas amostras com sequencias de G. coarctatum do banco de dados do GB, foi verificado que elas são mais proximamente relacionadas à G. robustum e G. allanii. Entretanto, essas amostras coletadas inicialmente como G. floridanum foram identificadas morfologicamente como G. coarctatum. Gelidium coarctatum apresentou grande diversidade intraespecífica, isto é, apresentam sequencias de DNA diferentes, resultando no aparecimento de sete populações (haplótipos) distintas. Isto acontece por não estar ocorrendo fluxo gênico entre elas. Apesar das análises moleculares terem mostrado a presença de Gelidium floridanum, Gelidium coarctatum e outras duas espécies ainda não identificadas, o estudo morfológico não apresentou nenhuma característica morfo-anatômica divergente de Gelidium sp. 2 em comparação com as G. floridanum e G. coarctatum. Além disso, pela falta das duas estruturas reprodutivas (cistocarpo e o soro de tetrasporângio) presente na mesma espécie das amostras coletadas, não foi possível realizar essa comparação entre os espécimes estudados. Portanto, para que a descrição dessas espécies seja feita de forma mais abrangente deve ser realizado um estudo morfológico mais detalhado com outros indivíduos dessas espécies, a fim de poder confirmar todos os caracteres que elas podem apresentar e tentar comparar os caracteres reprodutivos. Levando em conta os dados moleculares e morfológicos obtidos, segundo Horta et. al (2001), a costa litorânea brasileira pode ser dividida, de acordo com a temperatura, em 2 grandes zonas (Tropical no Nordeste e Temperada quente no Sudeste e Sul), que estão separadas por uma zona de transição com domínio manguezal localizada no estado do Espírito Santo (figura 25). Com isso, é possível fazer a relação de que G. floridanum predomina na região Temperada quente, porém também está presente na zona de transição. Enquanto que G. coarctatum está presente somente na região Tropical. Para o estado do Espírito Santo foi encontrado três espécies diferentes (G. floridanum, Gelidium sp. 1 e Gelidium sp. 2) e ainda segundo esse artigo, isso se deve ao fato dessa 19

20 região ser caracterizada por uma ampla diversidade de ambientes gerando como consequência uma alta taxa de diversidade de espécies. Literatura Citada Altschul, S. F., Madden T. L., Schäffer, A. A., Zhang J., Zhang, Z., Miller W. & Lipman, D. J Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: Cassano, V., Metti, Y., Millar, A. J. K., Gil-Rodriguez, M. C, Senties A., Díaz Larrea, J., Oliveira, M. C. & Fujii, M. T. 2012a. Redefining the taxonomic status of Laurencia dendroidea (Ceramiales, Rhodophyta) from Brazil and the Canary Islands. Eur. J. Phycol. 47: Cassano, V., Oliveira, M. C., Gil-Rodriguez, M. C., Sentíes, A., Díaz-Larrea, J. & Fujii, M. T. 2012b. Molecular support for the establishment of the new genus Laurenciella within the Laurencia complex (Ceramiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 55: Clement, M., Posada D. & Crandall, K.A TCS: A computer program to estimate gene genealogies. Mol. Ecol. 9: Costa, E. S., Plastino, E. M., Petti, R., Oliveira, E. C. & Oliveira, M. C The Gracilariaceae germplasm bank of the University of São Paulo, Brazil a DNA barcoding approach. J. Appl. Phycol. 24: Creed M., Fujii, M. T., Barreto, M. B. B., Guimarães, S. M. P. B., Cassano, V., Pereira S. M. B., Oliveira-Carvalho, M. F. & Khader, S Rhodophyceae. In: Forzza R.C. (org.). Catálogo de Plantas e Fungos do Brasil. 1ª. Ed. Rio de Janeiro. Andrea Jakobsson Estúdio. 1: Duncan, E.J. & Lee Lum, L.M A checklist of the marine macroalgae of the Republic of 20

21 Trinadad and Tobago. Caribbean Marine Studies. 7: Faccini, A. L Importância Econômica e Cultivo de Algas Marinhas. X Simpósio de Biologia Marinha da Unisanta. Santo. Fan, K. C Morphological studies of the Gelidiales. University of California Press. Freshwater, D. W. & Bailey, J A multigene phylogeny of the Gelidiales including nuclear largesubunit rrna sequence data. J Appl Phycol 10: Freshwater, D. W., Fredericq, S. & Hommersand, M. H A molecular phylogeny of the Gelidiales (Rhodophyta) based on analysis of plastid rbcl nucleotide sequences. J Phycol. 31: Freshwater, D. W. & Rueness, J Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales, Rhodophyta) species, based on rbcl nucleotide sequence analysis. Phycol. 33: Freshwater, D. W., Tudor, K., O Shaughnessy, K. & Wysor, B DNA barcoding in the red algal order Gelidiales: comparison of COI with rbcl and verification of the barcoding gap. Cryptogam Algol. 31: Fujii, M. T., Guimarães, S. M. P. B., Gurgel, C. F. & Frederiq, S Characterization and phylogenetic affinities of the red alga Chondrophycus flagelliferus (Rhodomelaceae, Ceramiales) from Brazil on the basis of morphological and molecular evidence. Phycol. 45: Guimarães, S. M. P. B Gelidium in Lista de Espéccies da Flora do Brasil. Jard. Botânico do Rio de Janeiro. Guiry, M. D. & Guiry, G. M Algae Base. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. searched on 13 Ago Guiry, M. D. & Womersley, H. B. S Capreolia implexa gen. etsp. Nov. (Gelidiales, 21

22 Rhodophyta) in Australia and New Zealand; na intertidal mat-forming alga with unusual life history. Phycol. 32: Horta, P.A., Amancio, E., Coimbra & C.S., Oliveira, E.C Considerações sobre a distribuição e origem da flora de macroalgas marinhas brasileiras. Hoehnea. 28: Iha, C Diversidade de Gelidiales (Rhodophyta) baseada em marcadores moleculares e estudos morfoanatômicos para a região Sudeste do Brasil. Tese de Mestrado. Universidade de São Paulo, São Paulo. Kim K. M., Hoarau, G.G., Boo, S.M Genetic structure and distribution of Gelidium elegans (Gelidiales, Rhodophyta) in Korea based on mitochondrial cox1 sequence data. Aquat. Bot. 98: Littler, D.S, Littler, M.M. & Hanisak, M.D Submersed plants of the Indian River Lagoon. pp. [1]-286. Washington, D.C.: Offshore Graphics, Inc. McDevit, D.C. & Suaders, G.W On the utility of DNA barcoding for species differentiation among brown macroalgae (Phaeophyceae) including a novel extraction protocol. Phycol. Res. 57: McDevit, D.C. & Suaders, G.W A DNA barcode examination of the Laminariaceae (Phaeophyceae) in Canada reveals novel biogeographical and evolutionary insights. Phycol. 49: Milstein, D. & Oliveira, M. C Molecular phylogeny of Bangiales (Rhodophyta) based on small subunit rdna sequencing: emphasis on Brazilian Porphyra species. Phycol. 44: Milstein, D. & Saunders, G. W DNA Barcoding of Canadian Ahnfeltiales (Rhodophyta) reveals a new species Ahnfeltia borealis sp. nov. Phycol. 51: Milstein D., Medeiros, A., Oliveira, E. C. & Oliveira, M. C Will a DNA barcoding 22

23 approach be useful to identify Porphyra species (Bangiales, Rhodophyta)? A case study with Brazilian taxa. J. Appl. Phycol. 24: Patwary, M. U., Sensen, C. W., Ron, M. M. & van der Meer, J. P Nucleotide sequences of small subunit and internal transcribed spacer regions of nuclear rrna genes support the autonomy of some genera of the Gelidiales (Rhodophyta). J Phycol. 305: Oliveira-Carvalho, M. F., Oliveira, M. C., Pereira, S. M. B. & Verbruggen, H Phylogenetic analysis of Codium species from Brazil, with the description of the new species C. pernambucensis (Bryopsidales, Chlorophyta). European Journal of Phycol. 47: Radulovici, A. E., Archambault, P., Dufresne, F DNA Barcodes for Marine Biodiversity: Moving Fast Forward Diversity. 2: Rindi, F., Sartoni, G. & Cinelli, F A floristic account of the benthic marine algae of Tuscany (Western Mediterranean Sea). Nova Hedwigia. 74 (1-2): Rocha-Jorge R., Cassano V., Oliveira M. C. & Fujii, M. T The occurrence of Laurencia marilzae (Ceramiales, Rhodophyta) in Brazil based on morphological and molecular data. Bot. Mar. 53: Rocha-Jorge R., Cassano, V., Barros-Barreto, M.B., Díaz-Larrea, J., Sentíes, A., Gil- Rodríguez, M.C. & Fujii, M.T Osmundea sanctarum sp. nov. (Ceramiales, Rhodophyta), a new member of the Spectabilis group in the southwestern Atlantic Ocean. Phytotaxa. 100: Scariot, L.A Efeitos da radiação ultravioleta-b na germinação e desenvolvimento dos tetrásporos de Gelidium floridanum (Gelidiales, Rhodophyta): crescimento, morfologia e ultraestrutura. Tese de Mestrado. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. Saunders, G.W Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications. Philos. T. Roy. Soc. 360: Schneider, C.W. & Wynne, M.J A synoptic review of the classification of red algal genera 23

24 a half century after Kylin s Die Gattungen der Rhodophyceen. Botanica Marina 50: Sherwood, A. R., Kurihara, A., Conklin, K. Y., Sauvage, T. & Presting, G. G The Hawaiian Rhodophyta Biodiversity Survey ( ): a summary of principal findings. BMC Plant Biol 10, 258. BioMed Central Ltd. Suárez, A.M Lista de las macroalgas marinas Cubanas. Rev. Invest. Mar., v. 26, p Sutherland J., Lindstrom, S., Nelson, W., Brodie, J., Lynch, M., Hwang, M. S., Choi, H., Miyata, M., Kikuchi, N., Oliveira, M., Farr, T., Neefus, C., Mols-Mortensen, A., Milstein, D. & Müller, K A new look at an ancient order: generic revision of the Bangiales. J. Phycol. 47: Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. & Kumar, S Mega 5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. 28: Taylor, W Marine algae from Haiti collected by H. H. Bartlett in Michigan Acad Sci. Thomas, D. T. & Freshwater, D. W Studies of Costa Rican Gelidiales (Rhodophyta): four Caribbean taxa including Pterocladiella beachii sp. Nov. Phycol. 40: Ugadim, Y Algas Marinhas Bentônicas do Litoral Sul do Estado de São Paulo e do Estado do Paraná. São Paulo. Universidade de São Paulo. Ugadim, Y Distribuição das espécies de Gelidium e Pterocladia (Gelidiaceae - Rhodophyta) no litoral brasileiro. Nerítica. 2: Ugadim, Y Estudo comparado de Gelidium coarctatum Kuetzing e Pterocladia capillaceae (Gmelin) Bornet et Thuret (Rhodophyta-Gelidiaceae) no litoral Brasileiro. Gayana, Bot. 45:

25 Anexos Gelidium floridanum Gelidium sp. 2 2 Gelidium coarctatum Gelidium sp. 1 Figura 1: Árvore de agrupamento por NJ com o marcador rbcl-3p (H - haplótipo). Figure 1: Tree clustering for NJ with marker rbcl-3p (H - haplotype). 25

26 A B Figura 2: Redes de haplótipos (A) G. floridanum e espécimes relacionadas; (B) G. coartatum coarctatum (H - haplótipo). Figure 2: Network haplotypes (A) G. floridanum and specimens related; (B) G. coartatum coarctatum (H - haplotype). 26

27 Gelidium floridanum Gelidium sp. 2 Gelidium coarctatum Gelidium sp. 1 Figura 3: Árvore de agrupamento por NJ com o marcador COI-5P (H - haplótipo). Figure 3: Tree clustering for NJ with marker COI-5P (H - haplotype). 27

28 Figura 4: Rede de haplótipos de Gelidium coarctatum com o marcador COI-5P (H - haplótipo). Figure 4: Network haplotypes Gelidium coarctatum (H - haplotype). 28

29 Figs Gelidium floridanum. Figs. 5 e 6 aspecto geral (1 cm) (IBT e IBT1767); Fig. 7 ramos com soros de tetrasporângios (setas) (1cm) (IBT1579-7); Fig. 8 detalhe do soro (200 µm); Fig. 9 célula apical (seta) (25 µm); Fig. 10 detalhe do apressório (500 µm); Fig. 11 corte transversal do talo mostrando as rizines (setas) (50 µm). Figs Gelidium floridanum. Figs. 5 and 6 Habit (1 cm) (IBT e IBT1767); Fig. 7 branches with tetrasporangial sorus (arrows) (1cm) (IBT1579-7); Fig. 8 detail of soru (200 µm); Fig. 9 apical cell (arrow) (25 µm); Fig. 10 detail of apresorium (500 µm); Fig. 11 transverse sections of the stem showing rhizines (arrows) (50 µm). 29

30 Figs Gelidium coarctatum. Fig. 12 aspecto geral (2 cm); Fig. 13 ramos com soros de tetrasporângios (setas) (0,5cm); Fig. 14 detalhe do soro (200 µm); Fig. 15 célula apical (seta) (50 µm); Fig. 16 detalhe do apressório (500 µm); Fig. 17 corte transversal do talo mostrando as rizines (setas) (50 µm). Figs Gelidium coarctatum. Fig. 12 Habit (2 cm); Fig. 13 branches with tetrasporangial sorus (arrows) (0,5cm); Fig. 14 detail of soru (200 µm); Fig. 15 apical cell (arrow) (50 µm); Fig. 16 detail of apresorium (500 µm); Fig. 17 transverse sections of the stem showing rhizines (arrows) (50 µm). 30

31 Figs Gelidium sp. 2. Fig. 18 aspecto geral de um ramo feminino (1 cm); Fig. 19 aspecto geral (1 cm); Fig. 20 ramos com cistocarpos (setas) (0,5cm); Fig. 21 detalhe do cistocarpo (100 µm); Fig. 22 célula apical (50 µm); Fig. 23 detalhe do apressório (500 µm); Fig. 24 corte transversal do talo mostrando as rizines (setas) (25 µm). Figs Gelidium sp. 2. Fig. 18 Habit of a female branch (1 cm); Fig. 19 External habit (1 cm); Fig. 20 branchs with cystocarps (arrows) (0,5cm); Fig. 21 detail of cystocarp (100 µm); Fig. 22 apical cell (50 µm); Fig. 23 detail of apresorium (500 µm); Fig. 24 transverse sections of the stem showing rhizines (index) (25 µm). 31

32 Figura 25: Distribuição das espécies de acordo com as zonas presentes na costa litoral do Brasil. Figure 25: Distribution of species according to the zones present in the coasts of Brazil. 32

33 Tabela 1: Dados da localidade das coletas, número de herbário e de campo (IBT). Table 1: Data of the locality of collection, number of herbarium and field (IBT). Espécie Nº campo Nº SP Data da coleta Coordenadas (Lat/Long) Local de coleta Coletor G. floridanum IBT '21"S/40 12'45"W Espírito Santo, Serra, Carapebus C.H. Kano & L.P. Machado G. floridanum IBT '30"S / 40 10'20"W Espírito Santo, Serra, Capuba C.H. Kano & L. P. Machado G. floridanum IBT1505 Espírito Santo, Manguinhos G. floridanum IBT '31"S/46 51'7"W São Paulo, Itanhaém, Cibratel M. Jamas G. floridanum IBT '59"S/48 22'12"W Santa Catarina, Florianópolis, Santinho D. Milstein & L. P. Machado Gelidium sp. 1 IBT '21"S/40 12'45"W Espírito Santo, Serra, Carapebus C.H. Kano & L.P. Machado G.coarctatum IBT '26"S/41 35'8"W Piauí, Luis Correia, Coqueiro M.T. Fujii & D. Milstein G.coarctatum IBT '58"S/38 39'4"W Ceará, Caucaia, Pacheco C.H. Kano & L. Soares G.coarctatum IBT '23"S/38 37'9"W Ceará, Caucaia, Dois coqueiros C.H. Kano & L. Soares G.coarctatum IBT '14"S / 38 54'28"W Ceará, S. Gonçalo do Amarante, Taíba C.H. Kano & L. Soares G.coarctatum IBT '20"S/34 55'52"W R. Grande do Norte, S. Miguel do Gostoso, Cardeiro M.T. Fujii & A. Leite G.coarctatum IBT '57"S/35 27'40"W R. Grande do Norte, Rio do Fogo, Rio do Fogo M.T. Fujii & A. Leite G.coarctatum IBT '63"S/34 48'10W Paraíba, Jacumã, Carapibus M.T. Fujii & A. Leite G.coarctatum IBC G.coarctatum IBC G.coarctatum IBT G.coarctatum IBT '25"S/38 40'56"W Ceará Ceará Paraíba Bahia, Itaparica, Praia da Penha M. Jamas Gelidium sp. 2 IBT '50"S/40 37'55"W Espírito Santo, Anchieta, Castelhanos C.H. Kano & L.P. Machado 33

34 Tabela 2: Marcadores moleculares e respectivos primers utilizados para amplificação por PCR e sequenciamento. Table 2: Molecular markers and their primers used for PCR amplification and sequencing. Marcadores primers Sequencias 5-3 Referências COI - 5P GazF1 TCAACAAATCATAAAGATATTGG Saunders 2005 GazR1 ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA Saunders 2005 GWSFn TCAACAAAYCAYAAAGATATYGG Saunders 2005 CoxIR1 ATACATATGATGHGCTCAA Saunders 2005 rbcl - 3P 993F GGTACTGTTGTAGGTAAATTWGAAGG Freshwater et al RrbcS GTTCTTTGTGTTAATCTCAC Freshwater et al

35 Tabela 3: Amostras processadas e ampliadas com seus respectivos marcadores moleculares utilizados. Table 3: Samples were processed and scaled with their respective molecular markers used. Espécie Nº campo Estado Número de Amostras Coletadas Processadas rbcl 3P COI 5P G. floridanum IBT ES G. floridanum IBT1608 SP G. floridanum IBT SC G. floridanum IBT ES G. floridanum IBT1505 ES G. coarctatum IBT1566 PI G. coarctatum IBT1580 CE G. coarctatum IBT1581 CE G. coarctatum IBT1582 CE G. coarctatum IBT1688 RN G. coarctatum IBT1700 RN G. coarctatum IBT1717 PB G. coarctatum IBT0350 BA G. coarctatum IBC602 CE G. coarctatum IBC603 CE G. coarctatum IBT1523 PB Gelidium sp. 1 IBT ES Gelidium sp. 2 IBT1609 ES Total: