As folhas vistosas é o dileto alimento Da sagaz lagarta ou mandarová Para gente enferma é medicamento Uma vez tomadas em um quente chá.

Transcrição

1 Tentarei mostrar ao leitor mais atento As mil utilidades do maracujá Nem Catulo ou Varela,doutos de talento, Ousaram descrever tudo que nele há. As folhas vistosas é o dileto alimento Da sagaz lagarta ou mandarová Para gente enferma é medicamento Uma vez tomadas em um quente chá.

2 Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças F.M. Zerbini A.V.S. Nascimento P.F. Alfenas L.B. Torres A.S.K. Braz E.N. Santana W.C. Otoni M.G. Carvalho Introdução Omaracujazeiro pertence ao gênero Passiflora, constituído por mais de 580 espécies, sendo mais de 150, nativas do Brasil (Bruckner et al., 2002). O endurecimento dos frutos, que pode ser causado por duas espécies de vírus (Passionfruit woodiness virus, PWV e Cowpea aphid-borne mosaic virus, CABMV), é a principal virose e uma das principais doenças dessa cultura. O primeiro relato do endurecimento dos frutos do maracujazeiro foi feito na Austrália, há mais de cem anos (Cobb, 1901). O agente causal da doença foi denominado Passionfruit woodiness virus (PWV), até pouco tempo considerado o único vírus capaz de induzir esse tipo de sintoma. Em 1993, Brand et al.(1993), clonaram e seqüenciaram o gene da proteína capsidial de uma estirpe de PWV da África do Sul vírus e, ao compará-la com a seqüência de estirpes de PWV da Austrália, concluíram que se tratava de uma nova espécie viral, por eles denominada South African Passiflora virus (SAPV). Essa denominação não foi aceita pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), uma vez que o SAPV apresentava alta identidade na seqüência de sua proteína capsidial com isolados de CABMV (Mckern et al., 1994). Assim, o ICTV reclassificou-o como pertencente à espécie CABMV (Van Regenmortel et al., 2000). Plantas de maracujazeiro infectadas pelo PWV ou CABMV apresentam mosaico e deformação foliar e produzem frutos pequenos, deformados e com 589

3 endurecimento do pericarpo. A produtividade e o ciclo da cultura são reduzidos. Tanto o PWV quanto o CABMV são transmitidos de maneira nãocircultória por várias espécies de afídeos, além de serem facilmente transmitidos via extrato foliar tamponado e por enxertia. Esses vírus infectam naturalmente espécies de Passiflora e de leguminosas, além de infectarem artificialmente alguns membros das famílias Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae e Cucurbitaceae (Taylor;& Greber, 1973,; Mckern et al., 1994). No Brasil, o endurecimento dos frutos já foi relatado nos principais estados produtores de maracujá, incluindo Bahia, Ceará, Minas Gerais, Pará, Rio de Janeiro e São Paulo (Chagas et al., 1981,; Lima et al., 1985,; Chagas et al., 1992,; Bezerra et al., 1995). Em todos os casos, o PWV foi identificado como agente etiológico da doença, com base em características biológicas e sorológicas. Entretanto, a análise da seqüência de aminoácidos da proteína capsidial de isolados procedentes de diversos estados brasileiros indicou que todos eles pertencem à espécie CABMV (Santana et al., 1999,; Nascimento et al., 2004). Até o presente, todos os isolados brasileiros seqüenciados pertencem a essa espécie, e a detecção molecular do PWV no Brasil ainda aguarda confirmação. Uma vez que medidas tradicionais de controle de viroses não têm tido sucesso no caso do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, a alternativa para o controle dessa virose é a obtenção de plantas de maracujazeiro transgênicas expressando porções do genoma viral, a fim de obter resistência pelo mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional (posttranscriptional gene silencing, PTGS). Transformação genética A fim de obter plantas transgênicas de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) resistentes ao endurecimento dos frutos, um fragmento não-traduzível do genoma do isolado CABMV-MG1, contendo dois terços da região codificadora da polimerase viral (NIb) e um terço da região codificadora da proteína capsidial (CP), foi inserido no sítio de BamH I do vetor binário pbi121 (Figura 1). Plasmídeos recombinantes foram transformados em 590

4 Agrobacterium tumefaciens LBA4404. A transformação genética de maracujáamarelo foi realizada por meio de co-cultivo de culturas de A. tumefaciens e explantes (hipocótilos estiolados) de maracujá. Depois do co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio MS contendo 1,0 mg/l de benzilaminopurina (BAP), 150 mg/l de canamicina e 250 mg/l de cefatoxima. As plantas foram regeneradas, e os transformantes selecionados, levando-se em conta sua capacidade de crescer em meio contendo canamicina. Figura 1. Construção utilizada para a transformação genética de maracujá-amarelo. BE, borda esquerda do T-DNA presente no vetor pbi121; BD: borda direita do T-DNA; Nos pro: promotor do gene Nos que regula a expressão do gene npt II; Nos ter: sinal de terminação da transcrição; 35S pro: promotor CaMV 35S que regula a expressão do transgene. O fragmento viral inclui dois terços do gene NIb e um terço do gene cp. do isolado CABMV-MG1. Resistência das plantas F1 A presença do transgene foi confirmada via PCR em 15 das 16 plantas regeneradas. As 15 plantas transformadas, contendo o transgene em hemizigose, foram propagadas via estaquia, e as plantas resultantes foram inoculadas com os isolados MG1 e PE1 do CABMV. Plantas provenientes do transformante TE5-10 não apresentaram sintomas quando inoculadas com o isolado MG1, mas os desenvolveram quando inoculadas com o isolado PE1. A ausência de vírus nessas plantas foi confirmada por ELISA indireta. As plantas provenientes dos demais transformantes foram suscetíveis a ambos os isolados. Análise de Northern demonstrou que em plantas derivadas do transformante TE5-10 não ocorre acúmulo de mrna transgênico mesmo antes da inoculação com o vírus. Depois da inoculação com ambos os isolados, apenas em plantas inoculadas com o isolado PE1 foi detectado RNA viral (Figura 2). Esses resultados comprovam que as plantas provenientes do transformante TE5-10 são resistentes ao isolado CABMV-MG1, que o 591

5 mecanismo de resistência envolvido é o silenciamento gênico póstranscricional e que esse mecanismo já está ativado nas plantas transgênicas antes da inoculação com o vírus (Alfenas et al., 2005). Entretanto, a planta é resistente apenas ao isolado utilizado para a transformação (MG1) e suscetível ao outro isolado testado (PE1). A especificidade observada na resistência pode ser explicada pelo modo de ação do mecanismo de PTGS que exige identidade elevada entre a seqüência-alvo e a seqüência utilizada para a transformação (Prins, 2003). A identidade das seqüências de nucleotídeos das proteínas capsidiais dos isolados MG1 e PE1 é de 93% (Santana et al., 1999). As plantas transgênicas analisadas encontravam-se em hemizigose, ou seja, possuíam apenas uma cópia do transgene. Trabalhos realizados com plantas transgênicas de mamoeiro, expressando uma construção não-traduzível correspondente à proteína capsidial do Papaya ringspot virus (PRSV), determinaram o mesmo tipo de especificidade da resistência nas plantas F1 (hemizigotas) (Tennant et al., 2001). Depois da autofecundação e da obtenção de linhagens F2 em homozigose, a resistência foi efetiva contra várias estirpes do vírus. Dessa forma, o estudo da herança da resistência das plantas transgênicas de maracujá-amarelo e a avaliação de plantas F2 contendo o transgene em homozigose podem revelar alterações no espectro da resistência. Figura 2. Análise da expressão do transgene em transformantes resistentes ou suscetíveis ao endurecimento dos frutos. RNA total foi extraído de plantas inoculadas ou não-inoculadas derivadas dos transformantes TE5-4 (suscetível) e TE5-10 (resistente) e hibridizado com uma sonda específica para os genes NIb e cp. do CABMV. 1, TE5-4, não-inoculada. 2, TE5-10, não-inoculada. 3, Planta não-transformada, não-inoculada. 4, 5, Plantas não-transformadas inoculadas com CABMV-MG1 e CABMV-PE1 respectivamente. 6, 7, TE5-10 inoculado com CABMV-MG1 e CABMV-PE1 respectivamente. O gel de agarose corado com brometo de etídeo, correspondendo ao rrna 25S, é mostrado abaixo para comparação das quantidades de RNA carregadas no gel. 592

6 Resistência das plantas F2 A fim de determinar se a resistência é transmitida de forma estável e se a presença do transgene em homozigose aumenta o espectro da resistência, foram realizados cruzamentos entre o transformante resistente TE5-10, um transformante suscetível (T2-5), e uma planta não-transformada (Tabela 1). Para determinar se a resistência se comporta da mesma forma em estado de homozigose foram realizadas autofecundações do transformante TE5-10 (Tabela 1). Tabela 1. Frutos obtidos dos cruzamentos realizados entre plantas transgênicas de maracujá-amarelo resistentes e suscetíveis ao CABMV-MG1 e entre planta nãotransformada. Progenitor materno Progenitor Número do Número de paterno fruto sementes obtidas TE5-10 (resistente) TE (autofecundação) TE (autofecundação) TE (autofecundação) T T NT 6 80 T2-5 (suscetível) NT 8 90 TE TE NT (não-transformada) TE TE TE T As plantas provenientes de cada cruzamento foram inoculadas com os isolados CABMV-MG1, -PE1 e -SE1 e avaliadas por meio de observação visual de sintomas e ELISA indireto (Tabela 2; Figura 3). Plantas F2 provenientes dos frutos 4 e 8 (NT x TE2-5 suscetível) e 5 e 13 (TE2-5 suscetível x TE5-10 resistente) foram suscetíveis aos três isolados, conforme esperado. Plantas F2, provenientes dos frutos 1 e 6 (NT vx. TE5-10 resistente), foram resistentes ao isolado MG1, todavia, suscetíveis aos isolados PE1 e SE1, também, conforme esperado, pois o transge- 593

7 ne continua em hemizigose. Entre as 27 plantas F2, provenientes dos frutos 7, 12 e 15 (autofecundação do transformante TE5-10 resistente) testadas até o presente, uma (proveniente do fruto 15) mostrou-se resistente aos três isolados testados, não apresentando sintomas de infecção viral e com resultado negativo em ELISA indireto (Tabela 2; Figura 3). Essa planta está sendo propagada vegetativamente a fim de se obter material suficiente para inoculação em todos os 16 isolados de CABMV disponíveis no Laboratório de Virologia Vegetal Molecular da UFV e para análise genética a fim de comprovar que o transgene realmente se encontra em homozigose. A análise das demais plantas provenientes dos frutos 7, 12 e 15 continua em andamento, bem como a análise molecular das plantas F2, para verificar se o silenciamento gênico pós-transcricional continua ativo nas plantas com o transgene em homozigose e se há correlação entre o número de cópias do transgene, o nível de resistência e o silenciamento. Tabela 2. Resultados de ELISA indireto (absorbância a 405 nm) para detecção de três isolados de CABMV, quatro semanas depois da inoculação em plantas F2 provenientes de diferentes cruzamentos entre plantas transgênicas de maracujá-amarelo e entre planta não-transformada. Cruzamento Planta MG1 PE1 SE1 TE2-5 NT 8-1 0,89 0,97 0,88 (transgênica suscetível 8-3 0,87 0,99 0,85 não transformada) 8-4 0,85 0,95 0, ,88 0,90 0,86 TE5-10 TE ,89 0,99 0,89 (transgênica resistente x 5-2 0,88 1,01 0,90 transgênica suscetível) 5-3 0,88 1,03 0, ,90 0,98 0,92 TE5-10 TE ,87 0,99 0,90 (autofecundação ,89 0,96 0,95 transgênica resistente) ,90 0,98 0, ,90 0,95 0, ,88 0,97 0, ,87 0,99 0, ,89 0,98 0, ,37 0,40 0, ,90 0,95 0, ,91 0,96 0,90 Não-transformada inoculada 1,30 1,03 1,21 Não-transformada sadia 0,25 0,24 0,21 594

8 PE-1 SE-1 NT Figura 3. Sintomas de infecção por três isolados de CABMV (MG-1, PE-1 e SE-1) em plantas F2 provenientes de diferentes cruzamentos entre plantas transgênicas de maracujá-amarelo e entre planta não-transformada. NT, planta nãotransformada; 8, planta F2 proveniente do cruzamento de planta transgênica suscetível (TE2-5) e planta não-transformada; 5, planta F2 proveniente do cruzamento de planta transgênica suscetível (TE2-5) e planta transgênica resistente (TE5-10); 15, planta F2 proveniente de autofecundação de planta transgênica resistente (TE5-10). 595

9 Conclusões Plantas de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) foram transformadas geneticamente visando à obtenção de plantas resistentes ao endurecimento dos frutos. As plantas transgênicas expressam um fragmento não traduzível do genoma de um isolado do Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) correspondente a dois terços da região codificadora da proteína NIb e um terço da região codificadora da proteína capsidial. Uma das plantas transgênicas obtidas foi resistente à infecção pelo mesmo isolado utilizado para a transformação, porém, foi suscetível à infecção por outro isolado do vírus. A análise molecular demonstrou que o mecanismo de resistência é o silenciamento de RNA que já se encontra ativo na planta antes da infecção viral. Após a autofecundação da planta resistente, uma planta F2 com o transgene em homozigose foi analisada e mostrou-se resistente à infecção por três isolados do vírus. Esse resultado indica que o espectro da resistência está relacionado ao número de cópias do transgene. Essa planta está sendo multiplicada vegetativamente para inoculação com demais isolados do vírus. Caso a resistência de amplo espectro seja confirmada, a utilização desse material pode constituir uma forma de controle eficiente para o endurecimento dos frutos, uma virose endêmica no Brasil e para a qual não existem atualmente medidas de controle satisfatórias. Referências Bibliográficas ALFENAS, P. F.; BRAZ, A. S. K.; TORRES, L. B.; SANTANA, E. N.; NASCIMENTO, A. V. S.; OTONI, W. C.; ZERBINI, F. M. Transgenic passionfruit expressing an RNA derived from Cowpea aphid-borne mosaic virus are resistant to passionfruit woodiness disease. Fitopatologia Brasileira, v. 30, p , BEZERRA, D. R.; LIMA, J. A. A.; XAVIER FILHO, J. Purificação e caracterização de um isolado cearense do vírus do endurecimento dos frutos do maracujazeiro. Fitopatologia Brasileira, v. 20, p , BRAND, R. J.; BURGER, J. T.; RYBICKI, E. P. Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of the coat protein gene of a new potyvirus infecting South African passiflora. Archives of Virology, v. 128, p ,

10 BRUCKNER, C. H.; MELLETTI, L. M. M.; OTONI, W. C.; ZERBINI, F. M. Maracujazeiro. p , In: BRUCKNER, C. H. (Ed.). Melhoramento de fruteiras tropicais. Viçosa: UFV, CHAGAS, C. M.; KITAJIMA, E. W.; LIN, M. T. Grave moléstia em maracujá amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) no Estado da Bahia caudada por um isolado do vírus do woodiness do maracujá. Fitopatologia Brasileira, v. 6, p , CHAGAS, C. M.; REZENDE, J. A. M.; COLARICCIO, A. Ocorrência do vírus do endurecimento do fruto do maracujazeiro no Estado de São Paulo. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 14, p , COBB, N. A. Woodiness of passionfruit. Agricultural Gazette of New South Wales, v. 12, p , LIMA, J. A. A.; SANTOS, C. D. G.; KITAJIMA, E. W. Isolamento de um potyvirus de plantas de maracujá com sintomas de mosaico. Fitopatologia Brasileira, v. 10, p. 305, MCKERN, N. M.; STRIKE, P. M.; BARNETT, O. W.; DIJKSTRA, J.; SHUKLA, D. D.; WARD, C. W. Cowpea aphid borne mosaic virus-morocco and South African Passiflora virus are strains of the same potyvirus. Archives of Virology, v. 136, p , NASCIMENTO, A. V. S.; SOUZA, A. R. R.; ALFENAS, P. F.; ANDRADE, G. P.; CARVALHO, M. G.; PIO-RIBEIRO, G.; ZERBINI, F. M. Análise filogenética de potyvírus causando endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Nordeste do Brasil. Fitopatologia Brasileira, v. 29, p , PRINS, M. Broad virus resistance in transgenic plants. Trends in Biotechnology, v. 21, p , SANTANA, E. N.; BRAZ, A. S. K.; TORRES, L. B.; ZAMBOLIM, E. M.; ZERBINI, F. M. Molecular characterization of potyvirus isolates causing passionfruit woodiness in Brazil. Virus Reviews and Research, v. 4, p. 153, TAYLOR, R. H.; GREBER, R. S. Passionfruit woodiness virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, v. 122, TENNANT, P.; FERMIN, G.; FITCH, M. M.; MANSHARDT, R. M.; SLIGHTOM, J. L.; GONSALVES, D. Papaya ringspot virus resistance of transgenic Rainbow and SunUp is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology. European Journal of Plant Pathology, v. 107, p , VAN REGENMORTEL, M. H. V.; FAUQUET, C. M.; BISHOP, D. H. L.; CARSTENS, E.; ESTES, M. K.; LEMON, S. M.; MANILOFF, J.; MAYO, M. A.; MCGEOCH, D. J.; PRINGLE, C. R.; WICKNER, R. B. (Ed.). Virus taxonomy: seventh report of the international committee on taxonomy of viruses. San Diego: Academic Press, p. 597

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