Microchips eletroforéticos de vidro com detecção condutométrica sem contato para análise de ânions inorgânicos em amostras reais
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA Microchips eletroforéticos de vidro com detecção condutométrica sem contato para análise de ânions inorgânicos em amostras reais CAMILLA BENEVIDES FREITAS Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como exigência parcial para obtenção do título de Mestre em Química. Orientador: Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro Goiânia 2014
2 TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [x] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Camilla Benevides Freitas camillabf@gmail.com Seu pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Bolsista Agência de fomento: Fundação de Amparo a Pesquisa Sigla: FAPEG do Estado de Goiás País: Brasil UF: GO CNPJ: / Título: Microchips eletroforéticos de vidro com detecção condutométrica sem contato para análise de ânions inorgânicos em amostras reais. Palavras-chave: Detecção condutométrica sem contato, microchips eletroforéticos, monitoramento ambiental. Título em outra língua: Glass electrophoretic microchips with contactless conductivity detection for analysis of inorganic anions in real samples. Palavras-chave em outra língua: Contactless conductivity detection, electrophoresis microchips, environmental monitoring. Área de concentração: Química Data defesa: (dd/mm/aaaa) 02/05/2014 Programa de Pós-Graduação: Instituto de Química Orientador (a): Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro wendell@ufg.br *Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ x ] SIM [ ] NÃO 1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. Assinatura do (a) autor (a) Data: / / 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.
3 Dados Internacionais de Catalogação da Publicação (CIP) Freitas, Camilla Benevides. F866m Microchips eletroforéticos de vidro com detecção condutométrica sem contato para análise de ânions inorgânicos em amostras reais [manuscrito] / Camilla Benevides Freitas xv, 70 f. : il., figs, tabs. Orientador: Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Goiás, Instituto de Química, Bibliografia. Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas. Apêndices. 1. Análise condutométrica. 2. Circuitos integrados. 3. Monitorização ambiental. I. Título. CDU :502(043)
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5 Dedico este trabalho Aos meus pais, Jerônima e Círio, pelo apoio e compreensão nessa difícil trajetória, e pelos esforços imensuráveis em me proporcionar essa experiência que eles não puderam ter. Meu amor por vocês é muito grande!
6 AGRADECIMENTOS À Deus por sempre estar ao meu lado, por todas as oportunidades que Ele me proporcionou e as pessoas que Ele colocou no meu caminho para a construção dessa parte da minha história. E principalmente pela força que me presenteou para que um sonho se tornasse uma conquista profissional. Ao Prof. Dr. Wendell Carlos Tomazelli Coltro pela orientação, sabedoria, paciência e disposição em direcionar-me durante toda a realização deste trabalho. Ao longo deste período, foram várias contribuições dadas à minha formação pessoal e profissional através do seu conhecimento e sabedoria. À Prof. Dra. Maria Gizelda de O. Tavares pela parceria em disponibilizar recursos laboratoriais para o desenvolvimento de parte deste trabalho, através do Laboratório de Ecotoxicologia (LABECOTOX). E por toda sua contribuição científica e profissional. Aos colegas e amigos do laboratório GME (Grupo de Métodos Eletroforéticos) por todos os incentivos, ajudas, apoios, conselhos e os vários momentos de descontração que vocês me proporcionaram. Pelas grandes amizades que se
7 formaram ao longo desse convívio e por todos os momentos que compartilhamos, tornaram vocês inesquecíveis. A todos os meus amigos e familiares, pois sem vocês a vida não teria tanta graça! Obrigada pela compreensão quanto a minha ausência e irritabilidade em vários momentos e situações. Pelos aconselhamentos e ajuda nos momentos difíceis e principalmente por acreditarem no meu potencial, sempre me incentivando. À Agência Municipal do Meio Ambiente e a Prefeitura de Goiânia pelas flexibilidades concedidas, para que este trabalho se desenvolvesse concomitante com o meu vínculo profissional. À Empresa IFB Biotecnologia por gentilmente fornecer amostra do biofertilizante, sendo oriunda de um processo interno da empresa. A todos os funcionários e professores do Instituto de Química que colaboram durante minha formação acadêmica. À Universidade Federal de Goiás pela acolhida e oportunidade em participar do programa de pós-gradução em Química, no nível mestrado. À FAPEG pela bolsa de mestrado concedida (Processo Nº ), cujo auxílio foi fundamental.
8 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... i LISTA DE TABELAS... vi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... vii LISTA DE SÍMBOLOS... ix RESUMO... xi ABSTRACT... xii 1 INTRODUÇÃO Contexto histórico da eletroforese Princípios da eletroforese em microchips Detecção em microchips Instrumentos comerciais Aplicações utilizando microchips com detecção C 4 D OBJETIVOS Objetivos gerais Objetivos específicos PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Materiais e métodos Instrumentação Desempenho analítico... 25
9 3.4. Análise quantitativa de amostras reais Monitoramento da água coletada em um ambiente de aquário RESULTADOS E DISCUSSÃO Otimização da composição da solução eletrolítica Identificação da ordem de migração Otimização das condições do detector Estudo da repetibilidade Curvas de calibração Estudo do tempo de injeção Recuperação Amostras de alimentos e ambientais Monitoramento de ambientes aquáticos CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLOGRÁFICAS... 66
10 LISTA DE FIGURAS Figura Eletroferograma genérico demostrando a separação como resultado das diferentes mobilidades das espécies na aplicação de um campo elétrico Figura Representação da separação eletroforéticas de diferentes espécies: cátions (+), neutros (N) e ânions (-), utilizando microdispositivos eletroforéticos, aplicando polaridade positiva Figura Representação da separação eletroforéticas de diferentes espécies: cátions (+), neutros (N) e ânions (-), utilizando microdispositivos eletroforéticos, aplicando polaridade negativa Figura Representação do circuito elétrico equivalente de um sistema de detecção C 4 D. Demonstração da disposição dos eletrodos do lado externo do canal microfluídico. C F é a capacitância de fuga, C 1 e C 2 são as capacitâncias do acoplamento eletrodo/solução e R s é a resistência da solução Figura Equipamento comercial de eletroforese; (A) fontes de alta tensão; (B) circuito eletrônico do detector condutométrico sem contato; (C) plataforma do microchip sem a tampa de proteção; (D) plataforma aberta com o microchip dentro; (E) microchip comercial
11 Figura Em (A) microchip comercial com indicação dos reservatórios e dimensões do microchip, em (B) zoom da região de interseção duplo-t e em (C) o comprimento dos microcanais e a posição dos eletrodos próximo ao reservatório Figura Esquema do controle eletrocinético (modo gated) na separação de ânions utilizando MSE. Em (A) etapa de preenchimento, em (B) etapa de injeção e em (C) etapa de separação Figura Esquema do controle eletrocinético (modo gated) na análise de cátion utilizando MSE. Em (A) etapa de preenchimento, em (B) etapa de injeção e em (C) etapa de separação Figura Simulação da separação eletroforética dos ânions no programa Peakmaster Figura Variação da concentração de His para obtenção da melhor condição de separação dos íons Cl -, NO - 3, SO 2-4, NO - 2, utilizando solução equimolar dos ânions de 100 µmoll -1, frequência de 1100 khz e amplitude de 70%. A melhor condição de separação foi His 15 mmoll Figura Tempo de migração de cada espécie: Cl - < NO - 3 < SO 2-4 < NO - 2, comparado com a mistura padrão dos íons. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1s. Frequência 1100 khz e amplitude 60% Figura Apresentação dos (A) eletroferogramas e (B) intensidade da altura dos picos dos íons para diferentes valores de amplitude, utilizando frequência de 1100 khz
12 Figura Apresentação dos (A) eletroferogramas e (B) intensidade dos picos dos íons para diferentes valores de frequência, utilizando amplitude de 70% Figura Eletroferograma contendo 31 injeções consecutivas realizadas para avaliação da repetibilidade analítica. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz e amplitude 60% Figura Apresentação dos eletroferogramas obtidos no estudo da repetibilidade analítica realizada através de injeções consecutivas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção 1s. Frequência 1100 khz e amplitude 60% Figura Apresentação dos eletroferogramas obtidos no estudo da repetibilidade analítica realizada através de injeções entre semanas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz e amplitude 60% Figura Em (A) eletroferogramas dos oito níveis de concentração da curva analítica e em (B) curvas de calibração dos ânions cloreto, nitrato, sulfato e nitrito. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz e amplitude 60% Figura Em (A) eletroferogramas variando o tempo de injeção e em (B) relação da área do pico em relação à variação do tempo de injeção. Concentração dos analitos: 5 µmoll -1 para Cl -, NO - 3, NO - 2 e 2,5 µmoll -1 para SO
13 Figura Influência do tempo de injeção em relação à (A) resolução dos picos e (B) eficiência de separação. Concentração dos analitos: 5 µmoll -1 para Cl -, NO 3 -, NO 2 - e 2,5 µmoll -1 para SO Figura Eletroferogramas mostrando a separação e detecção dos ânions em amostras do Rio Meia Ponte, Ribeirão João Leite, ambiente de aquário em que peixes haviam habitado, água de torneira, biofertilizante, mel, e salsicha. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz, amplitude 60% Figura Monitoramento do cátion amônio na água do ambiente de aquário simulado. Em (A) os eletroferogramas do monitoramento realizado e em (B) o gráfico da área versus semanas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz, amplitude 60% Figura Monitoramento dos ânions cloreto, nitrato, sulfato e nitrito na água do ambiente de aquário simulado. Em (A) os eletroferogramas das injeções, em (B) o gráfico da concentração dos íons com o decorrer das semanas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz, amplitude 60% Figura Monitoramento do cátion amônio na água no ambiente de aquário com peixes. Em (A) os eletroferogramas e em (B) o gráfico da concentração do íon com o decorrer das semanas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz, amplitude 60% Figura Monitoramento dos ânions inorgânicos na água do ambiente de aquário com peixes. Em (A) os eletroferogramas obtidos em diferentes semanas, em (B) o gráfico da concentração dos íons com o decorrer das
14 semanas. Eletrólito: 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His. Tempo de injeção: 1 s. Frequência 1100 khz, amplitude 60%
15 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Reagentes utilizados e suas respectivas massas molares, fórmulas moleculares, fabricantes e purezas Tabela 2 - Avaliação da repetibilidade para injeções sequenciais (n = 50) realizadas no mesmo dia. O limite de confiança foi igual a 95% Tabela 3 - Avaliação da repetibilidade para injeções realizadas em diferentes semanas (n = 18). O limite de confiança foi igual a 95% Tabela 4 - Ajuste linear da cada curva de calibração Tabela 5 - Limite de detecção de cada íon e sensibilidade do método analítico Tabela 6 - Valores de recuperação para amostras com adição de padrões dos íons inorgânicos analisados em três níveis de concentração Tabela 7 - Valores estimados em amostras reais com limite de confiança foi igual a 95% para n=
16 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µtas ABNT Adic. ADN AMPA C 4 D CHES Conc. DPR ECZ EM FEO FIL His m/v MES MSE Microssistemas para análises totais Associação Brasileira de Normas Técnicas Adicionada Ácido desoxirribonucleico Ácido aminometilfosfônico Detecção condutométrica sem contato acoplado capacitivamente 2-(Ciclo-hexilamino) etanossulfônico Concentração Desvio padrão relativo Eletroforese capilar de zona Espectrometria de massas Fluxo eletrosmótico Fluorescência induzida a laser L- Histidina Massa por volume Ácido 2-(N-morpholino) etanosulfônico Microssistemas eletroforéticos
17 NBR ND PC PDMS PE PET PMMA PVC Rec. Sem. Tris v/v V pp Normas Brasileiras Registradas Não detectado Policarbonato Poli(dimetilsiloxano) Poliestireno Poli(etilenotereftalato) Poli(metilmetacrilato) Poli(cloreto de vinila) Recuperação Semana 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol Volume por volume Volts pico a pico
18 LISTA DE SÍMBOLOS µ ap Mobilidade aparente µ ef Mobilidade eletroforética µ feo Mobilidade eletrosmótica A C 1 C 2 Ceq C F d E f L Área total do eletrodo Capacitância do acoplamento eletrodo/solução Capacitância do acoplamento eletrodo/solução Capacitância equivalente Capacitância de fulga Distância dos eletrodos Campo elétrico Frequência utilizada Condutância da solução Número de medidas q r R 2 R s Carga do íon Raio do íon Coeficiente de correlação linear Resistência da solução
19 Desvio padrão Valor tabelado para intervalo de confiança ʋ ef ʋ feo y Velocidade eletroforética Velocidade eletrosmótica Média Admitância total do sistema Constante dielétrica Permissividade do vácuo Potencial zeta Viscosidade do meio µ Limite de confiança
20 RESUMO Este trabalho descreve a avaliação de um sistema eletroforético comercial para análise de íons inorgânicos em uma diversidade de amostras reais. A separação eletroforética foi realizada em um microchip comercial a base de vidro com detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C 4 D). Realizou-se um estudo de otimização da concentração do eletrólito bem como os parâmetros de detecção como frequência e amplitude da onda senoidal. Além disso, foi avaliado o desempenho analítico do sistema com estudos de lineraridade, repetibilidade e recuperação. O melhor eletrólito para realizar a separação cloreto (Cl - ), nitrato (NO - 3 ), sulfato (SO 2-4 ) e nitrito (NO - 2 ) foi a mistura de ácido láctico e histidina na concentração de 30 e 15 mmoll -1, respectivamente. Variou-se a frequência de 100 a 1200 khz e a amplitude de 1 a 100 V pp. Aplicou-se o método univariado para análise de frequência e amplitude, no qual as melhores condições encontradas foram frequência de 1100 khz e amplitude de 60 V pp. Encontrada as condições ideais para análise dos ânions, fez-se um estudo de quantificação dos íons em amostras de mel, salsicha, biofertilizante, água de rio, torneira e áquario. Na amostra de mel foi encontrado Cl -, NO - 3 e SO 2-4. Nas águas de torneira, do Rio Meia Ponte e do Ribeirão João Leite foram encontrados Cl - e SO 2-4. Essas mesmas espécies foram encontradas também nas amostras de salsicha. Na análise de água de um ambiente de aquário foram encontrados Cl -, NO - 2-3, SO 4 e NO - 2. Além da análise quantitativa, realizou-se o monitoramento dos íons inorgânicos (Cl -, NO - 3, SO 2-4 e NO - 2 ) em um ambiente simulado de aquário sem peixes, no qual possibilitou acompanhar o processo de nitrificação no ciclo do nitrogênio e verificar o tempo de conversão das espécies envolvidas. O mesmo monitoramento foi realizado em um ambiente de aquário com peixes, possibilitando visualizar o aumento da concentração do nitrato ao longo das semanas e quantificar o nitrito em um nível que pode ter sido letal para os peixes. De acordo com os resultados descritos, conclui-se que os chips eletroforéticos de vidro, associados à instrumentação comercial, demonstraram boa capacidade de realizar análises quantitativas de importantes compostos ambientais em amostras reais. PALAVRAS CHAVE: Detecção condutométrica sem contato, microchips eletroforéticos, monitoramento ambiental.
21 ABSTRACT This work describes the evaluation of commercial microchip electrophoresis system for the analysis of inorganic ions in different real samples. The electrophoretic separation was carried out in commercial glass microchip with integrated capacitively coupled contactless conductivity detection (C 4 D). The optimization process was performed ranging the concentration background electrolyte as well as detection parameters, frequency and amplitude signal. Furthermore, analytical performance was evaluated with linearity, repeatability and recovery study. The best separation of chloride (Cl - ), nitrate (NO - 3 ), sulfate (SO 2-4 ) and nitrite (NO - 2 ) was obtained with mixture of lactic acid (30 mmoll -1 ) and histidine (15 mmoll -1 ). Frequency and amplitude were ranged from 100 to 1200 khz and from 1 to 100 V pp, respectively. Test with detection parameters was performed employed a classic univariate approach. Frequency of the 1100 khz and amplitude of 60 V pp was found the best condition for separation process. Quantitative analysis was performed in different real samples as well as honey, sausage, biofertilizers, river water, tap water and aquarium environment water. In honey sample found Cl -, NO - 3 e SO 2-4. Meia Ponte River and João Leite stream was found Cl - e SO 2-4. These same species was also found in sausage sample. In the analysis of aquarium environment water was observed Cl -, NO - 3, SO 2-4 and NO - 2. Besides the quantitative analysis, the monitoring of inorganic ions (Cl -, NO - 2-3, SO 4 and NO - 2 ) in aquarium environment with and without fish. The water without fish was possible keep up with nitrification process in the nitrogen cycle and to examine the conversion time of the species involved. On the other hand, in analyses of water with fish the results showed an increase of nitrate concentration over weeks and were possible quatify the nitrite in lethal level for fish. According to the results achieved herein, it is possible to conclude that the use glass electrophoresis chips associated with commercial instrumentation has demonstrated good capability of performing quantitative analysis of important environmental compounds in real samples. KEYWORDS: Contactless conductivity detection, electrophoresis microchips, environmental monitoring.
22 1 INTRODUÇÃO 1.1. Contexto histórico da eletroforese Eletroforese capilar de zona (ECZ) é uma das modalidades da eletroforese capilar utilizada para separação de compostos baseada na migração diferenciada de espécies iônicas ou ionizáveis na aplicação de um campo elétrico (BAKER, 1995). O primeiro aparelho de eletroforese (Tubo em U) descrito na literatura foi proposto na Tese do químico Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, na Suécia, em 1930 (TISELIUS, 1930). O objetivo inicial desse trabalho foi realizar a separação de proteínas do soro sanguíneo através da migração dessas espécies na presença de um campo elétrico, no qual o sistema foi altamente dependente do ph do meio (TISELIUS, 1937). Com esse trabalho ele ganhou o Prêmio Nobel de Química de Porém, na época, não foi possível conseguir zonas distintas de separação. Então em 1967, Hjérten, que trabalhava no grupo de pesquisa de Tiselius, propôs a aplicação de campos elétricos mais elevados. Para isso foram utilizados tubos com diâmetro de 300 µm e comprimento de 36 cm, sendo aplicado voltagens de 2,5 a 3 kv a fim de obter zonas mais distintas (HJERTÉN, 1967). Uma melhor compreenção da geração do fluxo eletrosmótico ocorreu em 1974, quando Pretorius et. al. demonstraram as vantagens do fluxo eletrosmótico comparado com o fluxo laminar. No mesmo ano, Virtanen utilizou tubos com diâmetros na ordem de 50 a 200 µm para realizar separações eletroforéticas, 1
23 trazendo com isso a vantagem da utilização de tubos com diâmetros cada vez menores (VIRTANEN, 1974). Em 1981, surgiu o primeiro equipamento de eletroforese capilar, proposto por Jorgenson e Lukacs. O equipamento utilizou capilares de vidro com diâmetro de 75 µm (JORGENSON e LUKACS, 1981). Através da utilização de tubos de eletroforese capilar com dimensões menores foi possível minimizar o efeito Joule causado pela geração de calor através da passagem de corrente. Isso possibilitou a aplicação de campos elétricos mais elevados, melhorando assim a eficiência da técnica de eletroforese. A ciência então caminhou para a miniaturização, acreditando que a redução da escala macro para a escala micro aumentaria o desempenho analítico. Em 1979, surgiu o primeiro dispositivo analítico miniaturizado, proposto por Terry. Esse trabalho desenvolveu um dispositivo de cromatografia em fase gasosa, o qual foi construído em uma lâmina de silício circular com diâmetro de 5 cm (TERRY, JERMAN e ANGELL, 1979). Porém, nesta época esse dispositivo não teve tanto impacto devido à falta de conhecimento ciêntífico nessa área de separação utilizando dispositivos miniaturizados. Na década de 1980 os cientistas empenharam-se em desenvolver micro-bombas (VANLINTEL, VANDEPOL e BOUWSTRA, 1988), micro-válvulas (SHOJI, ESASHI e MATSUO, 1988) no campo da miniaturização. Após a inserção das micro-bombas e micro-válvulas no meio científico, Manz e colaboradores desenvolveram um micro-cromatógrafo líquido, através do qual introduziu o conceito de microssistemas para análises totais (µtas, abreviatura do 2
24 termo em inglês Micro Total Analysis Systems). Nesses microssistemas foi possível integrar várias etapas analíticas em um único dispositivo como o pré-tratamento da amostra, a separação analítica e a detecção do analito (MANZ, GRABER e WIDMER, 1990). O intuito inicial da redução de macro para micro escala seria melhorar o desempenho analítico. No entanto, outras vantagens foram obtidas, como a diminuição do volume de amostras e reagentes consumidos, e a redução no custo de fabricação devido à simplificação instrumental (REYES et al., 2002). A redução do volume levou a manusear fluidos da ordem de nanolitros e picolitros (nl - pl) em canais com dimensões de dezenas a centenas de micrômetros, contribuindo para o surgimento de uma nova área de estudo, a microfluídica (WHITESIDES, 2006). Dessa forma, os sistemas analíticos miniaturizados ganharam destaque ao integrar diversas etapas de um procedimento analítico em único microchip, permitindo o consumo reduzido de amostras e reagentes, em análises rápidas e de baixo custo (COLTRO et al., 2007). Esses microchips foram inicialmente fabricados empregando processos fotolitográficos a partir de substratos de silício, vidro e quartzo. O vidro e o quartzo são os mais utilizados para fabricação de microdispositivos devido as suas vantagens como alta eficiência em dissipar calor, transparência óptica, inércia química, isolamento elétrico e sua similaridade com a sílica utilizada em eletroforese capilar (COLTRO et al., 2007). 3
25 Porém, o processo de fabricação fotolitográfico tem um custo elevado e necessita de um laboratório altamente equipado. Esse fato levou cientistas a desenvolverem métodos alternativos de fabricação. A fabricação por moldagem, por exemplo, é realizada a partir de substratos poliméricos como poli(metilmetacrilato) (PMMA), poliestireno (PE), poli(cloreto de vinila) (PVC), poli(etilenotereftalato) (PET) e policarbonato (PC). No processo de litografia macia emprega-se para fabricação dos dispositivos o poli(dimetilsiloxano) (PDMS). E no processo de impressão direta, imagens são impressas em um filme de poliéster, e o toner da impressão define as dimensões dos microcanais (COLTRO et al., 2007). A eletroforese é uma técnica de separação bastante empregada na área da microfluídica, devido sua simplicidade instrumental (COLTRO, 2008). E isso contribuiu para a fabricação de dispositivos portáteis, onde sua utilização pode também ser para análises em campo (point-of-care) (VANDAVEER et al., 2004) Princípios da eletroforese em microchips A instrumentação necessária para realizar análise em microssistemas eletroforéticos (MSE) consiste em um dispositivo com canais microfluídicos, uma fonte de alta tensão, um detector e um computador. Durante a separação eletroforética, o fluxo eletrosmótico (FEO) surge devido à presença de grupos silanóis existentes na parede do canal que adquirirem carga negativa devido à sua desprotonação. Estas cargas negativas interagem com as cargas positivas da solução eletrolítica no interior do canal, no qual origina a dupla 4
26 camada elétrica. Na presença de um campo elétrico, essa dupla camada move-se em direção ao cátodo gerando assim o FEO (BAKER, 1995). A magnitude do FEO é dependente da viscosidade do meio, do potencial zeta e da constante dielétrica do eletrólito. Dessa forma, a mobilidade eletrosmótica e a velocidade podem ser calculadas de acordo com as equações: ( ) (1) Onde: µ feo é a mobilidade eletrosmótica; ε é a constante dielétrica; ε 0 é a permissividade do vácuo; ζ é o potencial zeta; η é a viscosidade do meio; ʋ feo é a velocidade eletrosmótica; E é o campo elétrico. Dessa forma, a magnitude do FEO é influenciado diretamente por alterações no ph, na concentração e na força iônica do eletrólito, na viscosidade, na constante dielétrica e na temperatura do meio (TAVARES, 1996). O potencial zeta é governado pelas cargas existentes na parede do canal microfluídico, que é dependente do ph do eletrólito. Quanto maior o número de cargas na parede do canal, maior é a magnitude do FEO. O aumento da força iônica do eletrólito, em temperaturas constantes, diminui a magnitude do FEO devido à diminuição do potencial zeta. Se a temperatura não for controlada, o aumento da 5
27 força iônica permite uma maior passagem de corrente elética, e isso gera o aumento da temperatura devido ao efeito Joule, e consequentemente, a viscosidade do meio diminui (BAKER, 1995). As espécies também se movimentam em função de suas cargas, que é denominado mobilidade eletroforética de cada espécie. A mobilidade eletroforética das espécies iônicas é influenciada pelo raio de solvatação que é determinado pela relação carga/raio dos íons. Dessa forma, as moléculas pequenas com maior carga têm mobilidades eletroforéticas maiores, ou seja, migram mais rapidamente do que moléculas grandes e de menor carga. A mobilidade eletroforética é calculada pela velocidade de migração dividida pelo campo elétrico (BAKER, 1995). (2) Onde: µ ef é a mobilidade eletroforética; ʋ ef é a velocidade eletroforética; E é o campo elétrico; q é a carga do íon; η é a viscosidade do meio; r é o raio do íon. 6
28 As espécies carregadas positivamente serão atraídas para o cátodo, as espécies carregadas negativamente para o ânodo e as neutras migrarão de acordo com a mobilidade eletrosmótica (BAKER, 1995). A mobilidade aparente das espécies é o resultado da soma da mobilidade eletroforética com a mobilidade eletrosmótica, conforme apresentado na Equação 3. (3) Onde: µ ap é a mobilidade aparente; µ ef é a mobilidade eletroforética; µ feo é a mobilidade eletrosmótica. Na separação dos cátions, a fonte de alta tensão irá aplicar polaridade positiva nos eletrodos posicionados no início do canal microfluídico e na presença de um FEO com baixa mobilidade, todas as espécies que apresentarem mobilidade aparente maior do que zero, serão visualizadas no eletroferograma, na seguinte ordem de migração: cátions, neutros e ânions. De acordo com o demostratdo no eletroferograma genérico, apresentado na Figura
29 Sinal do Detector (mv) Figura Eletroferograma genérico demostrando a separação como resultado das diferentes mobilidades das espécies na aplicação de um campo elétrico. 0,8 0,6 + N _ 0,4 0,2 0, Tempo (s) A Figura 1.2 representa de forma esquematizada a migração diferenciada das espécies na presença de um campo elétrico. Figura Representação da separação eletroforéticas de diferentes espécies: cátions (+), neutros (N) e ânions (-), utilizando microdispositivos eletroforéticos, aplicando polaridade positiva. 8
30 Para a análise de ânions, a polaridade da fonte de alta tensão pode ser invertida. Dessa forma, os ânions irão migrar preferencialmente para o ânodo. Proporcionando a separação da mistura de ânions em um curto tempo de análise (BAKER, 1995). O FEO continuará com sentido para o cátodo que será oposto ao sentido dos ânions. Portanto, para que o íon chegue ao detector, sua mobilidade eletroforética deve ser maior que a mobilidade eletrosmótica. A Figura 1.3 representa de forma esquematizada a migração diferenciada dessas espécies na presença de um campo elétrico. Figura Representação da separação eletroforéticas de diferentes espécies: cátions (+), neutros (N) e ânions (-), utilizando microdispositivos eletroforéticos, aplicando polaridade negativa. Uma alternativa para detectar íons com mobilidade menor do que o FEO é manter a polaridade da fonte de alta tensão invertida e adicionar surfactante 9
31 catiônico ao eletrólito. Isso fará com que o FEO passe a ter a mesma direção dos ânions, possibilitando a detecção dos íons de menor mobilidade eletroforética (COLOMBARA, TAVARES e MASSARO, 1997) Detecção em microchips Existem diversos métodos de detecção que podem ser acoplados ao MSE como fluorescência induzida a laser (FIL) (JOHNSON e LANDERS, 2004) e a espectrometria de massas (EM) (SIKANEN et al., 2007). Além das técnicas eletroquímicas que ganharam destaque devido à facilidade de integração aos MSE, pois os eletrodos podem ser fabricados diretamente no dispositivo (VANDAVEER et al., 2004). Dentre as modalidades de detecção eletroquímica podemos citar a amperométrica, condutométrica e potenciométrica (COLTRO et al., 2007). A detecção condutométrica possui a vantagem de ser uma técnica universal, pois depende apenas da diferença de condutividade entre o eletrólito de corrida e o analito para gerar a resposta analítica. Dessa forma a detecção condutométrica não é uma técnica seletiva (SILVA, 2003). Existem dois modos de detecção condutométrica, com contato e sem contato. Na primeira, os eletrodos entram em contato com a solução, favorecendo o desgaste do eletrodo, interferências elétricas e formação de bolhas. No segundo, os eletrodos são posicionados do lado externo do canal microfluídico, acoplados capacitivamente com a solução no interior do canal (TANYANYIWA, LEUTHARDT e HAUSER, 2002) Nos últimos anos, o emprego da detecção condutométrica sem contato acoplado capacitivamente (C 4 D, abreviatura do termo em inglês capacitively coupled 10
32 contactless conductivity detection) tem sido cada vez mais empregada em MSE, devido a sua compatibilidade esses microdispositivos e suas vantagens em relação ao modo de detecção condutométria convencional (COLTRO et al., 2012) Detecção condutométrica sem contato em microchips A detecção condutométrica sem contato foi primeiramente acoplada à eletroforese capilar em Nessa época dois grupos de pesquisa independentes publicaram trabalhos utilizando dois eletrodos circulares acoplados ao capilar de sílica, sendo eles: ZEMANN e colaboradores (ZEMANN et al., 1998) e da Silva e do Lago (DA SILVA e DO LAGO, 1998). Esse tipo de detecção foi rapidamente adaptado para a eletroforese em MSE devido às vantagens inerentes desse detector. Guitj e colaboradores foram os primeiros a reportarem a técnica de detecção C 4 D em MSE. Quatro eletrodos planares foram acoplados ao MSE através da técnica de deposição por sputtering (pulverização catódica). Os eletrodos foram confeccionados por meio da deposição de um filme composto de titânio e alumínio sobre a superfície de vidro. Com isso, a espessura do vidro isolava o canal microfluído dos eletrodos (GUIJT et al., 2001). Nesses dez anos de desenvolvimento houveram várias contribuições onde os eletrodos foram confeccionados em diversos materiais, integrados a diferentes dispositivos, nas mais variadas geometrias, sem perda de detectabilidade. Essa técnica tem sido aplicada em várias áreas, como ensaios bioanalíticos, reações enzimáticas on-chip, análise de alimentos e identificação de explosivos e agentes 11
33 químicos de guerra como podem ser observadas nas referências encontradas no artigo de revisão dos dez anos de detecção C 4 D (COLTRO et al., 2012). Na detecção C 4 D, os eletrodos estão localizados no final do canal microfluídico, formando a cela de detecção. A Figura 1.4 representa o circuito elétrico equivalente dessa cela de detecção, onde R s é a resistência da solução, C 1 e C 2 a capacitância resultande do acoplamento capacitivo do eletrodo com a solução no interior do canal, tendo como dielétrico a parede do capilar, e C F a capacitância da transferência direta entre os eletrodos, também conhecida como capacitância de fuga. Figura Representação do circuito elétrico equivalente de um sistema de detecção C 4 D. Demonstração da disposição dos eletrodos do lado externo do canal microfluídico. C F é a capacitância de fuga, C 1 e C 2 são as capacitâncias do acoplamento eletrodo/solução e R s é a resistência da solução. O funcionamento do detector consiste na aplicação de um sinal senoidal de alta frequência a um eletrodo de excitação através de um gerador de função, ocasionando a polarização dos centros de carga do dielétrico (parede do capilar). Com isso, os íons da solução eletrolítica formarão uma diferença de potencial 12
34 interfacial, que irá gerar um sinal senoidal no eletrodo receptor através do processo análogo (SILVA, 2001). Dessa forma, o sinal gerado pela corrente alternada entre os eletrodos possui influência direta com a condutividade da solução no interior do canal. Essa corrente medida reflete a admitância total do sistema, dado por y, que é o inverso da impedância. [( ) ] (4) Onde: A é a área total do eletrodo; d a distância dos eletrodos; L a condutância da solução; f a frequência utilizada; Ceq a capacitância equivalente. Então, se a área do eletrodo, a distância entre eles e a frequência utilizada se mantiverem constantes, e desprezando as variações da constante dielétrica, a variação da admitância (y) será influenciada pela condutância da solução (SILVA, 2001) Instrumentos comerciais Atualmente a área microfluídica tem encontrado espaço no mercado através de várias empresas que representam produtos deste seguimento. Dentre algumas empresas que comercializam microchips, podemos citar a Micronit Microfluidics 13
35 ( a Microfluidic ChipShop ( a Micralyne ( e a MicruX Technologies ( Além das empresas mencionadas, podemos citar também a EDAQ que comercializa instrumentos dedicados para aplicações microfluídica ( O microchip de vidro com eletrodos integrados possui um alto custo. O custo unitário desses dispositivos é na ordem de 175. Levando-se em consideração a cotação realizada no dia 29/03/2014, esse valor em reais equivale a aproximadamente R$ 550,00 reais Aplicações utilizando microchips com detecção C 4 D A utilização desses MSE C 4 D, como já foi mencionado, pode ser encontrada nas mais diversas áreas. A literatura tem reportado um grande número de publicações que comprovam esse fato, conforme descrito a seguir. Na área ambiental, por exemplo, Ding e Rogeres mostraram a separação de ácidos haloacéticos em água de piscinas, utilizando carbonato de sódio como eletrólito na concentração de 10 mmoll -1, em ph 10. Essa separação foi realizada em dispositivos microfluídicos fabricados em PDMS (DING e ROGERS, 2010). Da Silva e colaboradores determinaram glifosato e seu principal metabólito ácido aminometilfosfônico (AMPA), utilizando 2-(ciclo-hexilamino) etanossulfônico e 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (CHES/Tris) como eletrólito na concentração de 80 mmoll -1, em ph 8,8. Para essa determinação foi utilizado microchips de poliéster toner (DA SILVA et al., 2013). 14
36 Liu e colaboradores avaliaram um microchip de PDMS em termos de sensibilidade, repetibilidade e linearidade. Esse dispositivo portátil, robusto e de baixo custo, se mostrou aplicável em análises de alimentos e análises ambientais (LIU et al., 2011). Na área de alimentos, o trabalho do Kuban e Hauser demonstrou a separação de íons inorgânicos e orgânicos em bebidas alcoólicas e não alcoólicas. Para essa separação utilizou-se microchip de PMMA (KUBAN e HAUSER, 2005). Law e colaboradores realizaram a análise de aditivos em amostras reais como refrigerantes e tabletes de vitamina C utilizando dispositivo de PMMA (LAW et al., 2005). Para aplicações bioanalíticas, podemos citar o trabalho de Abad-Villar e colaboradores que demonstrou a análise de uma gama de espécies químicas relevantes como aminoácidos, peptídeos, proteínas, imunoglobulinas e ADN (ácido desoxirribonucleico). Também foi mostrado nesse trabalho o controle da digestão enzimática de solução de albumina humana com pepsina, utilizando microchip de PMMA (ABAD-VILLAR, KUBAN e HAUSER, 2005). Wang e colaboradores determinaram os coeficientes de partição de espécies farmacêuticas após a distribuição do equilíbrio de fases. As drogas analisadas foram lidocaína, procaína, berberina e L-lisina. Os MSE foram fabricados em PMMA (WANG et al., 2013). Coltro e colaboradores monitoraram interações biomoleculares entre avidina biotina utilizando microdispositivos de PDMS. Três arranjos de eletrodos foram acoplados ao microdispositivo (COLTRO et al., 2014). 15
37 2 OBJETIVOS 2.1. Objetivos gerais O objetivo desse trabalho consiste em utilizar MSE comerciais de vidro integrados com sistema de detecção C 4 D para determinar ânions inorgânicos em amostras reais Objetivos específicos Em função do objetivo geral estar direcionado a análise de ânions, o trabalho teve como objetivo específico primeiramente otimizar e avaliar o desempenho do método proposto, para então aplicar na quantificação de diversos tipos de amostras, incluindo água, biofertilizante e alimentos. Depois, realizar o monitoramento dos íons cloreto (Cl - ), nitrato (NO - 3 ), sulfato (SO 2-4 ) e nitrito (NO - 2 ) em ambientes aquáticos durante um período. Esse monitoramento é realizado em um ambiente de aquário simulado sem peixes, e depois em um ambiente de aquário contendo peixes, a fim de verificar a etapa de nitrificação no ciclo do nitrogênio. 16
38 3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1. Materiais e métodos Os reagentes utilizados e algumas propriedades estão listados na Tabela 1. Para o preparo das soluções, utilizou-se água deionizada (Milli-Q) e todas as soluções foram filtradas com filtro de seringa contendo membrana de Nylon com poros de 0,22 µm de diâmetro. Tabela 1 - Reagentes utilizados e suas respectivas massas molares, fórmulas moleculares, fabricantes e purezas. Nome do reagente Massa Molar (g/mol) Fórmula Molecular Fabricante Pureza Hidróxido de Sódio 40,00 NaOH Sigma 98,0% L- Histidina (His) 155,15 C 6 H 9 N 3 O 2 Sigma 99,0% Ácido Lático 90,08 C 3 H 6 O 3 Cromoline 84,5% Cloreto de Sódio 58,44 NaCl Sigma 99,0% Nitrato de Sódio 84,99 NaNO 3 Neon 99,0% Sulfato de Sódio 142,04 Na 2 SO 4 Sigma 99,0% Nitrito de Sódio 69,00 NaNO 2 Neon 97,0% Dicromato de Potássio 294,19 K 2 Cr 2 O 7 Merck 99,5% Hidróxido de Amônio 35,05 NH 4 OH Sigma 28-30% Tetraborato de Sódio Deca Hidratado Ferrocianeto de Potássio Tri-Hidratado Sulfato de Zinco Hepta- Hidratado 381,37 Na 2 B 4 O 7.10H 2 O Sigma 99,5 422,41 K 4 Fe(CN) 6.3H 2 O Sigma 99,0 287,54 ZnSO 4.7H 2 O Merck 99,5 17
39 Da literatura foi reportado o trabalho de Kubán e colaboradores que realizaram um estudo da composição do eletrólito e sua influência na separação analítica através da eletroforese capilar com detecção C 4 D. Um dos eletrólitos utilizados foi preparado com 8 mmoll -1 de His, 4,6 mmoll -1 de ácido lático, 0,34 mmoll -1 de 18-crown-6 e ph adjustado para 4,25 com ácido acético a 4% v/v (KUBAN e KUBAN, 2002). Outro trabalho de Mori e colaboradores utilizaram a mistura de 30 mmoll -1 de Ácido 2-(N-morpholino) etanosulfônico (MES) e 30 mmoll -1 de His, 3 mmoll crown-6 (ph 6,1) para separar cátions inorgânicos (MORI et al., 2012). A partir desses trabalhos, surgiu a ideia de se utilizar ácido lático para realizar a separação de íons inorgânicos em microdispositivos utilizando detecção C 4 D. Então, realizou-se o estudo da composição da solução do eletrólito ideal que proporcionasse uma melhor separação dos ânions. Analisaram se diferentes concentrações e phs para o eletrólito. Essas soluções foram preparadas a partir de uma solução estoque de 200 mmoll -1 de ácido lático e 100 mmoll -1 de L-Histidina (His). A concentração de ácido lático foi fixada em 30 mmoll -1 e a concentração de His variou de 0 a 25 mmoll -1. As soluções dos ânions utilizadas para injeção foram preparadas a partir de uma solução estoque de 10 mmoll -1 cada. E através dessas soluções estoques, preparou-se uma mistura equimolar dos ânions Cl -, NO - 3, SO 2-4, NO - 2, na concentração de 100 µmoll -1 cada. O dicromato de potássio foi utilizado como padrão interno, na concentração de 200 µmoll -1. As condições utilizadas na detecção foram de 1100 khz de 18
40 frequência e 70% de amplitude. Entre as injeções, o canal foi lavado eletrocineticamente com a solução eletrolítica, a fim de evitar a contaminação residual das análises subsequêntes. Para realizar o pré-tratamento da amostra de salsicha, preparou-se a solução de tetraborato de sódio deca-hidratado a 5% m/v, a solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 15% m/v e a solução de sulfato de zinco hepta-hidratado a 30% m/v. As demais amostras reais analisadas não passaram por nenhum tipo de pré-tratamento, sendo apenas diluídas quando necessário Instrumentação Os MSE utilizados foram integrados a uma plataforma comercial para microchip, fabricada pela EDAQ (modelo ET225-EDAQ). Essa plataforma foi interfaceada a duas fontes de alta tensão (modelo ER230-EDAQ) e um circuito eletrônico do detector condutométrico (modelo ER225 C 4 D-EDAQ). Para aquisição dos gráficos utilizou-se o software PowerChrom. A Figura 3.1 mostra cada um desses componentes. Figura Equipamento comercial de eletroforese; (A) fontes de alta tensão; (B) circuito eletrônico do detector condutométrico sem contato; (C) plataforma do microchip sem a tampa de proteção; (D) plataforma aberta com o microchip dentro; (E) microchip comercial. (A) micronit M I C R O F L U I D I C S (E) (B) T35100C4D A1 (C) (D) 19
41 Microchip de vidro com eletrodos integrados Para a execução desse trabalho, utilizou-se o MSE comercial fabricado pela Micronit (modelo micronit T35100C4D). Esse dispositivo é fabricado em vidro de borossilicato, com comprimento de 45 mm, largura de 15 mm e espessura de 1,1 mm. A composição química do vidro de boro-silicato é 81% de SiO 2, 13% de B 2 O 3, 4% de Na 2 O, 2% de Al 2 O 3 e 0,75% K 2 O (ASTM, 2011). Os canais possuem largura de 100 µm e profundidade de 10 µm. A configuração da intersecção dos canais é duplo-t, com gap de 100 µm medido a partir do centro dos canais. Os valores para os comprimentos total e efetivo dos microcanais são iguais a 40 mm e 33 mm, respectivamente. O canal visualizado como braço da cruz possui comprimento de 9 mm conforme demonstrado no microchip da Figura 3.2. Figura Em (A) microchip comercial com indicação dos reservatórios e dimensões do microchip, em (B) zoom da região de interseção duplo-t e em (C) o comprimento dos microcanais e a posição dos eletrodos próximo ao reservatório 4. 20
42 Os eletrodos da detecção C 4 D são integrados ao MSE através de uma camada aderida sobre a superfície do vidro cujo material é platina e tântalo. A espessura do eletrodo é 200 nm, com 200 µm de largura e 500 µm de comprimento. A distância entre os eletrodos situados no final do canal de separação é de 250 µm. Os eletrodos encontram-se próximos ao reservatório 4, situados do lado externo e sob o canal microfluídico. Essas informações foram fornecidas pelo fabricante do microdispositivo Procedimento eletroforético O condicionamento dos canais microfluídicos foi realizado uma vez ao dia, previamente às análises, a fim de desprotonar os grupos silanóis da parede do capilar. O preenchimento acontece através da ação capilar. Esse procedimento consiste em preencher cada um dos reservatórios com 50 µl de solução de hidróxido de sódio na concentração 0,1 moll -1 e aplicar diferença de potencial de 800 V no reservatório 1 e 2 durante 20 minutos. Em seguida trocar a solução de hidróxido de sódio por água, aplicar o mesmo potencial por mais 10 minutos e por último repetir o mesmo procedimento com a solução do eletrólito utilizado na análise, por mais 20 minutos. Todos os reservatórios foram preenchidos com o mesmo volume (50 µl), a fim de evitar diferença de pressão devido ao desnível das soluções nos reservatórios. A temperatura ambiente se manteve em torno de 23 ºC durante o desenvolvimento da parte experimental. 21
43 Para realizar a injeção eletrocinética no modo gated na separação dos ânions, preencheu-se o reservatório 2 com a solução contendo a amostra e os demais reservatórios com a solução eletrolítica. Aplicou-se -0,8 kv no reservatório 2 e -1 kv no reservatório 1, enquanto os reservatórios 3 e 4 foram aterrados. Nessa primeira etapa, de preenchimento, há um fluxo com sentido do reservatório 2 para o 3 e outro do reservatório 1 para o 4 (Figura 3.3 A). Figura Esquema do controle eletrocinético (modo gated) na separação de ânions utilizando MSE. Em (A) etapa de preenchimento, em (B) etapa de injeção e em (C) etapa de separação. 1º preenchimento 2º injeção 3º separação (A) (B) (C) Amostra Descarte Amostra Tampão Descarte Tampão Na segunda etapa, de injeção, por 1 segundo o potencial do reservatório 1 é desligado. Nesse momento, um volume (plug) de amostra preenche o canal de separação (Figura 3.3 B). E na terceira etapa, de separação, retorna-se o potencial do reservatório 1 para -1 kv, quando ocorrerá a migração eletroforética das espécies em tempos diferentes na direção do detector, situado próximo ao reservatório 4 (Figura 3.3 C). 22
44 Para realizar a injeção eletrocinética no modo gated na análise de cátion, preencheu-se o reservatório 2 com a solução contendo a amostra e os demais reservatórios com a solução eletrolítica. Aplicou-se 0,8 kv no reservatório 2 e 1 kv no reservatório 1, enquanto os reservatórios 3 e 4 foram aterrados. O procedimento Eletroforético ocorreu da mesma forma que na separação dos ânions, de acordo com a Figura 3.4. Figura Esquema do controle eletrocinético (modo gated) na análise de cátion utilizando MSE. Em (A) etapa de preenchimento, em (B) etapa de injeção e em (C) etapa de separação. 1º preenchimento 2º injeção 3º separação (A) (B) (C) Amostra Descarte Amostra Tampão Descarte Tampão Para identificação da ordem de migração das espécies, realizou-se um estudo através da injeção individual das soluções de cada ânion analisado Cl -, NO - 3, SO 2-4, NO - 2, Cr 2 O - 7, na concentração de 100 µmoll -1 cada. O tempo de migração dessas espécies foi comparado com os tempos de migração das mesmas espécies em uma injeção de mistura equimolar com todos os ânions. 23
45 Verificou-se também a influência da variação do tempo da injeção na resposta analítica. Para isso, preparou-se uma mistura equimolar na concentração de 5 µmoll -1 para Cl -, NO - 3, NO - 2 e 2,5 µmoll para SO 4. Realizaram-se injeções com duração de 1 a 5 s. Tanto para o estudo sobre a ordem de migração das espécies quanto para a influência do tempo de injeção, foram realizadas injeções utilizando as condições otimizadas para a concentração da solução eletrolítica e para os parâmetros de detecção como a frequência e amplitude Detecção condutométrica sem contato Para a otimização dos parâmetros de detecção, variou-se a amplitude da onda senoidal. A amplitude máxima (100%) da onda senoidal equivale a 20 Volts pico a pico (V pp ), sendo que o equipamento possui amplificador que ao ser utilizado eleva a amplitude máxima da onda senoidal até 100 V pp. Durante todos os experimentos o amplificador foi utilizado, dessa forma a amplitude de 100% equivale a 100 V pp. Para otimização da amplitude e frequência, preparou-se uma mistura equimolar dos ânions na concentração de 100 µmoll -1, a solução eletrolítica na concentração de 30 mmoll -1 de ácido lático e 15 mmoll -1 de His, em ph 3,8. Para verificar a influência da amplitude do sinal na resposta analítica, realizaram-se as injeções variando a amplitude entre 1 a 100%, utilizando frequência de 1100 khz. Entre uma análise e outra, o canal foi lavado eletrocineticamente com a solução eletrolítica. 24
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