Bóris Marin professora : Tânia Tomé. 26 de novembro de 2007

Transcrição

1 Dinâmica estocástica em neurônios fge746 Bóris Marin professora : Tânia Tomé 26 de novembro de Introdução O presente trabalho explora modelagens para o comportamento elétrico da membrana plasmática de neurônios. É a exposta uma transcrição de um modelo determinístico bem conhecido ([2]) para estocástico, motivada pelo caráter probabilístico de abertura dos canais iônicos em experimentos tipo patch clamp(conforme [1]). Acredita-se ([3]) serem os potenciais de ação produzidos por membranas excitáveis o principal mecanismo de transmissão de informação no sistema nervoso. O potencial de membrana apresenta todas as características necessárias a um sistema de processamento de informação de sucesso (no sentido biológico): operação a altas velocidades ; repertório rico em primitivas computacionais, inclusive operações não lineares e de alto ganho; possibilidade de interface com o mundo real - tanto codificação de entradas sensoriais como saída motora ([4]). Segue uma exposição simplificada do modelo de Hodgkin e Huxley ([2]), e subseqüentes observações fisiológicas que justificam a transcrição do modelo para estocástico. Procurou-se enfatizar a importância das flutuações do número de canais abertos no comportamento elétrico da célula, o que a primeira vista não é esperado, dado o grande número de canais existentes no segmento de membrana modelado. Entretanto, uma análise mais cuidadosa do fenômeno mostra que o número de canais relevante durante a geração de potenciais é uma pequeníssima fração do total, de modo que as flutuações desempenham papel fundamental. Conseqüentemente, o modelo estocástico reproduz toda uma gama de fenômenos observados experimentalmente, ao contrário do determinístico, que modela apenas a excitabilidade da célula. 1

2 2 Modelagem 2.1 Eletrofisiologia de membranas Diversos tipos de célula possuem mecanismos de troca local de informação, entretanto as altamente especializadas células neurais permitem a transmissão de impulsos por longas distâncias, carregando informação com confiabilidade(conforme ref. [3]). Os sinais consistem essencialmente na propagação de ondas de despolarização ao longo da membrana celular. Para uma célula neural típica, em repouso, há uma diferença de potencial fixa ao longo da membrana. Entretanto, se a célula for excitada com determinada corrente proveniente por exemplo de entradas sinápticas a partir de um certo limiar (limiar de disparo) esta começa a disparar potenciais de ação, nada mais do que picos no valor do potencial de membrana, que propagam-se ao longo do neurônio (cf. figura 1). Figura 1: Potencial de membrana para (A) estímulo abaixo do limiar (B) estímulo constante maior que o limiar O funcionamento elétrico de um neurônio se resume a variações na concentração intra e extracelular de determinados íons. A membrana plasmática é constituída por um camada dupla de fosfolipídeos, polar nas faces e apolar no interstício de maneira que é praticamente impermeável ao fluxo de íons. Todavia, diversas proteínas existentes ao longo desta membrana funcionam como canais iônicos, permitindo seletivamente sua passagem. Há também um mecanismo, conhecido como bomba de Sódio e Potássio, que mantém concentrações fixas dos íons Na + e K + no meio intracelular, de modo que entre as faces de uma membrana em repouso há naturalmente uma diferença de potencial. A este potencial, damos o nome de potencial de repouso. Da termodinâmica, temos que a situação de equilíbrio para um fluxo de partículas carregadas através de uma membrana se dá pelo cancelamento da força química, devida ao gradiente de concentração, e o potencial elétrico, que surge quando cargas atravessam a membrana, desbalanceando o arranjo de carga (equação de Nernst) 2

3 E i = RT ZF ln [i] ext [i] int (1) Que dá o potencial devido à espécie i, sendo R a constante universal dos gases, T a temperatura absoluta, Z a valência do íon, F a constante de Faraday (carga de um mol de elétrons), e os termos entre colchetes as concentrações do íon nos meios externo e interno à membrana. O esquema da dinâmica microscópica pode ser visto na figura 2 Figura 2: Potencial de equilíbrio em membrana semipermeável Se os canais iônicos fossem simplesmente poros passivos na membrana, a célula permaneceria no estado de equilíbrio (potencial de repouso), tendendo a este sempre que alguma perturbação fosse aplicada ao sistema como por exemplo entradas sinápticas. Todavia, a permeabilidade da membrana às diferentes espécies iônicas não é constante, sendo sensível a fatores químicos, mecânicos, ou ao próprio potencial de membrana, o que enriquece muito a dinâmica e permite o comportamento observado de propagação de sinais. Esses fatores influenciam na abertura ou fechamento (estados tudo ou nada) dos diferentes tipos de canal iônico. Como exemplo, vamos analisar o comportamento do axônio do neurônio gigante da lula, investigado exaustivamente por Hodgkin e Huxley (ref [3]). Utilizando a equação de Goldman (2), que é uma versão da equação de Nernst que leva em conta o peso (permeabilidade) de cada espécie iônica (relacionado à quantidade de canais no estado aberto), calcula-se o potencial de repouso, que é da ordem de 60mV da ordem do potencial de Nernst para o K +, E K + 75mV. Isso indica que, em repouso, há muito mais 3

4 canais de potássio no estado aberto do que canais das outras espécies iônicas consideradas, no caso sódio e cloro. Efetivamente, têm-se P K : P Na : P Cl = 1 : 0.04 : V m = RT F ln P K[K + ] ext + P Na [Na + ] ext + P Cl [Cl ] ext P K [K + ] int + P Na [Na + ] int + P Cl [Cl ] ext (2) Contudo, durante um potencial de ação, o melhor ajuste da equação de Goldman para o potencial de membrana ocorre se as permeabilidades forem escolhidas na proporção P K : P Na : P Cl = 1 : 20 : 0.45, ou seja, V m aproxima-se de E Na (potencial de Nernst para os íons sódio). A corrente de sódio é então dominante no disparo de potenciais de ação. Pode-se, dadas as propriedades do canais iônicos e da membrana, modelar um neurônio com um circuito equivalente (fig. 3). Figura 3: Potencial de equilíbrio em membrana semipermeável Quando a membrana está em repouso, as correntes passivas de Na + e K + são balanceadas pelos fluxos ativos de Na + e K + da bomba de sódio e potássio. 2.2 O modelo de Hodgkin-Huxley Na década de 50 Hodgkin, Huxley e Katz conduziram séries de experiências eletrofisiológicas, nas quais destaca-se a utilização da técnica de voltage clamping técnica esta que consiste em introduzir eletrodos intracelulares e medir a corrente injetada necessária para manter o potencial de membrana em um valor constante que culminaram no desenvolvimento de um modelo para o comportamento de células neurais. Este modelo tornou-se um paradigma em neurociência, e muitos dos modelos utilizados hoje derivam destes princípios. O modelo possui 4 variáveis dinâmicas. A primeira é o potencial de membrana, e as outras três governam a dinâmica de condução de sódio e potássio pela membrana. Estas são supostas independentes entre si, e há 4

5 uma terceira condutância menor, chamada de leak ou vazamento, que independe do potencial de membrana. Desta maneira, a corrente iônica total através da membrana é I ion = I Na + I K + I leak (3) Os canais iônicos comportam-se como condutores ohmicos, ou seja, a dependência entre a corrente e o potencial de membrana é linear: I i (t) = γ i (V (t), t) [V (t) E i ] (4) onde γ i a condutância associada à i-ésima espécie iônica, e E i é o potencial reverso para essa espécie, dado pela equação de Nernst (eq. 1). Cada uma das duas condutâncias é expressada em termos de uma condutância máxima (γ i ), multiplicada por um coeficiente numérico representando a fração dessa condutância máxima realmente ativa. Esses números são funções de um ou mais portões que Hodgkin e Huxley introduziram para descrever a dinâmica das condutâncias. Em seu modelo original, eles referem-se a partículas de ativação e inativação, podendo cada uma delas estar em um de dois estados (aberto ou fechado), dependendo do tempo e do potencial de membrana. Para que a condutância esteja ativa, todas os portões devem estar no estado aberto simultaneamente. O melhor ajuste obtido por HH para a corrente de potássio foi I K = γ K n 4 (V E K ) (5) onde n, adimensional, descreve o estado de uma ficcional partícula de ativação, podendo assumir valores entre 0 e 1. Pode se acompanhar a dedução do modelo assumindo que a probabilidade de encontrar uma partícula de ativação em seu estado permissivo (aberto) seja n, e evidentemente a probabilidade de encontrá-la no estado não permissivo ou fechado é 1 n. Considerando uma cinética de primeira ordem, temos o seguinte esquema de transições: n 1 n (6) Sendo α n e β n taxas dependentes do potencial, especificando quantas transições ocorrem entre os estados. Esse esquema corresponde a uma equação diferencial de primeira ordem: dn dt = α n(v ) [1 n] β n (V )n (7) A dependência das taxas α e β com o potencial foi obtida com ajustes ao dados experimentais, e as expressões utilizadas são α n (V ) = 10 V 100 exp([10 V ] /10), β n(v ) = 0, 125 exp ( V/80) (8) 5

6 onde V é o potencial de membrana relativamente ao potencial de repouso do axônio em mv Já para os canais de sódio, a dinâmica é mais complexa. A fim de ajustar o comportamento dessa corrente, Hodgkin e Huxley tiveram de postular a existência de uma partícula de ativação m para o sódio, bem como uma de inativação h: I Na = γ Na m 3 h (V E Na ) (9) Analogamente à corrente de Potássio, as equações diferenciais que regem a dinâmica de m e h são Com os valores empíricos dm dt = α m(v )[1 m] β m (V )m (10) dh dt = α h(v )[1 h] β h (V )h (11) α m (V ) = 25 V 10 exp([25 V ] /10) 1, β m(v ) = 4 exp ( V/18) (12) α h (V ) = 0, 07 exp ( V/20), β h (V ) = 1 exp([30 V ] /10) + 1 (13) Juntando ambas as correntes de sódio e potássio, e considerando o efeito da corrente de leak, obtém-se para o potencial de membrana (através do circuito equivalente na fig. 3) C m dv dt = γ Na m 3 h 4 (V E Na )+γ K n 4 (V E K )+γ leak (V rep V )+I inj (14) Que leva em conta a injeção de uma corrente externa proveniente de, por exemplo, excitações sinápticas. 2.3 Estocasticidade Como foi abordado anteriormente, o comportamento elétrico dos neurônios deve-se à dinâmica de canais iônicos, proteínas incrustadas na membrana celular. Usualmente, experimentos de voltage clamping utilizam eletrodos intracelulares que atuam sobre regiões grandes de membrana. Isso acaba tomando um comportamento médio do sistema, já que há um número suficiente de canais em áreas macroscópicas para tomarmos o limite termodinâmico. Entretanto, pode-se considerar em áreas menores a influência de flutuações, estudando o comportamento de populações de canais e suas respectivas probabilidades de transição entre estados. 6

7 Essa abordagem é plenamente justificável de um ponto de vista experimental, já que experimentos do tipo patch clamp (ref [1]) revelam ser a abertura ou fechamento de um canal iônico (dependente de voltagem, no caso) um processo aleatório. Essa técnica consiste em, utilizando uma micropipeta, isolar um único canal iônico na membrana, possibilitando portanto o estudo do seu comportamento elétrico. Pode-se concluir, da figura 4, que a abertura ou não do canal é um processo aleatório, sendo a taxa de transição entre os estados aberto/fechado proporcional ao potencial de membrana. A corrente por um canal aberto obedece à lei de Ohm, como pode-se ver na parte B da figura. Figura 4: Resposta a degraus de corrente para um canal em patch clamp 7

8 Figura 5: Modelagem estocástica de canal de sódio O esquema exemplifica a modelagem de um canal de sódio, com as respectivas subunidades proteicas de ativação (modeladas por m) e inativação (modeladas por h). Baseado na interpretação de HH para os expoentes ζ i e ξ i números inteiros (equação 11), de que estes seriam a quantidade 1 de partículas de ativação (m) e de inativação (h) por canal iônico, a cada índice para uma das variáveis m, h corresponde um estado m i h j. O canal é permissivo (aberto) no estado m 3 h 1, e as taxas médias de transição α e β podem ser inferidas diretamente do modelo determinístico, como veremos a seguir. As equações dinâmicas são mantidas para todas as variáveis (eqs. 7, 11, 14), entretanto agora as condutâncias γ i são expressas como γ i (V, t) = n i (A m, V, t)φ (15) onde n i (A m, V, t) é o número total de canais do tipo i no estado aberto e ativado, em um segmento de membrana de área A m e φ é a condutância de um único canal iônico, que é tomada como 20pS. As taxas médias de abertura e fechamento são obtidas diretamente das funções sigmoidais empíricas(eqs. 8 e 13). Procede-se analogamente para α hi, β hi, as taxas de ativação e inativação. Para as correntes de potássio (ζ = 4, ξ = 0), a estrutura dos canais é simples: 1é muito interessante que Hodgkin e Huxley tenham proposto essa estrutura para os canais iônicos antes mesmo de terem sido feitos quaisquer estudos a respeito; de fato, foi observado e comprovado que as proteínas que constituem os canais têm estruturas quaternárias exatamente como previsto 8

9 Figura 6: modelagem dos canais de potássio Se soubermos a população N j de canais no estado j, e a taxa de transição r jk dos estados j para k, então em um intervalo de tempo t o número médio de canais que sofre a transição é dado por N jk = N j r jk t. Sendo a probabilidade de transição para um único canal P = r jk t, pode-se estimar o número de canais N jk que saltam do estado j para o k sorteando um número aleatório da distribuição binomial de probabilidades ( ) Nj P ( N jk ) = p N jk (1 p) N j N jk (16) N jk Um detalhe computacional importante consiste no custo do cálculo da distribuição binomial, devido aos fatoriais. Para se contornar esse problema, utiliza-se o fato de que uma binomial B(n, p) pode ser aproximada por uma gaussiana 2, para grandes n, enquanto que para p pequeno, por uma Poisson 3, conforme pode-se ver na figura 2.3 ambas muito mais baratas computacionalmente. 2 conseqüência do teorema do limite central 3 verificado usando-se a fórmula de Stirling 9

10 2.4 Simulação e resultados Figura 7: Séries temporais obtidas para o modelo estocástico. Comparar com a figura 1 para o modelo determinístico, onde estímulos abaixo do limiar não geram potenciais de ação, e acima provocam um comportamento de disparo tônico. Aqui, mesmo para correntes abaixo do limiar (7µA/cm 2 ), há potenciais de ação espontâneos devido às flutuações (B). Além disso, há perda de spikes no regime tônico (C e D) Em primeira análise, espera-se que o modelo estocástico convirja para o determinístico para um número muito grande de canais analogamente ao limite termodinâmico. Dadas as dimensões típicas dos segmentos de membrana modelados, há de fato cerca de canais iônicos (sódio). Uma flutuação em torno do valor médio de ordem N, corresponde a 1% do número total de canais, de modo que não deve haver grandes desvios em relação ao comportamento previsto pelo modelo determinístico. Todavia, as simulações revelam o oposto: as séries temporais obtidas usando o formalismo estocástico apresentam maior riqueza dinâmica, reproduzindo fenômenos observados experimentalmente como oscilações no potencial de membrana abaixo do limiar de disparo, spikes espontâneos para estímulos abaixo do limiar, perda de potenciais de ação no regime de disparo tônico enquanto que os resultados para o modelo determinístico são simplesmente comportamento tônico para estímulos acima do limiar de disparo, ou regresso a novo potencial de equilíbrio caso contrário. Esses resultados podem ser analisados a luz do modelo, considerando que o número importante na geração de potenciais de ação não é o total de 10

11 canais na membrana, mas sim quantos canais de sódio estão abertos próximo ao limiar de disparo. Esse número, para um total de canais de sódio, é da ordem de 10 o que nos dá uma flutuação da ordem de 30%. A parte D da figura 8 mostra explicitamente a série temporal dessa variável, em 10 experimentos. Figura 8: Resposta do modelo estocástico a um estímulo aleatório. Cada uma das linhas corresponde a uma simulação Analisando o espaço de fase do modelo (fig. 9), é possível entender a origem dinâmica dos três comportamentos interessantes (e observados experimentalmente) apresentados pelo modelo estocástico, que não estavam presentes no determinístico. Nota-se a presença de um ponto fixo e um ciclo-limite no espaço de fase (o parâmetro de controle corrente injetada vale 7µA/cm 2 ). Essa biestabilidade evidencia-se no fato de que, dependendo das condições iniciais, podemos ter comportamento tônico ou estabilização em novo potencial de equilíbrio, para o modelo determinístico (veja a figura 1). A bacia de atração de cada um desses atratores encontra-se muito próxima, de modo que as flutuações no número de canais abertos são suficientes para jogar as trajetórias de uma para a outra - ou seja, ora têm-se passeios pela órbita correspondente ao disparo de potencias de ação, ora há espiralamento em direção a um potencial de equilíbrio (oscilações amortecidas em torno do ponto fixo, que não é atingido nunca devido às flutuações). Isso é suficiente para explicar o disparo de potenciais de ação para correntes abaixo do limiar, bem como a perda de spikes no regime de disparo tônico. 11

12 Figura 9: Espaço de fase para ambos os modelos determinístico (A) e estocástico (B) Referências [1] Hamill O P, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth F J, (1981), Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches Pflugers Arch. 391(2): [2] Hodgkin A, Huxley A, (1952), A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve, J. Physiol. (London) 117: [3] Kandel E R, Schwartz J H, Jessell T M Principles of Neural Science,McGraw-Hill Medical; 4th edition (January 5, 2000) [4] Koch C Biophysics of computation,oxford University Press; 2004 [5] Schneidman E, Freedman B, Segev I, (1998) Ion channel stochasticity may be critical in determining the reliability and precision of spike timing, Neural Computation. 10: