SIMULAÇÃO DA ATIVIDADE ELETROFISIOLÓGICA DE NEURÔNIOS

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1 1 SIMULAÇÃO DA ATIVIDADE ELETROFISIOLÓGICA DE NEURÔNIOS O Programa AXOVACS [baseado no modelo proposto por Hodgkin e Huxley (1952) (J.Physiol. 117, 500)], que permite simular a atividade eletrofisiológica de neurônios, pode ser obtido nas páginas (no Diretório Fisiologia Animal Comunicação e Integração) ou O arquivo WinAXOVACS.rar deve ser gravado em algum diretório do seu computador e então expandido. Depois, para entrar no Programa, você deve fazer duplo clique sobre o Programa HHMODEL.EXE. Agora experimente. Por exemplo, clique sobre a tecla Run (pode-se também pressionar, no teclado, a letra grifada, neste caso R, para acionar a função) e você verá um gráfico representando o efeito da aplicação de um estímulo sobre a voltagem da membrana de um neurônio virtual (gráfico superior), as variações de condutância da membrana desse neurônio para os íons Na + e K + (gráfico intermediário) e as características do estímulo aplicado (gráfico inferior). Os parâmetros utilizados nas simulações podem ser vistos e modificados (permitindo simular experimentos) com a tecla Edit (ou pressionando, no teclado, E ). O programa inclui diversas possibilidades de simulação que podem ser escolhidas a partir do Menu (clique sobre Menu - ou pressione, no teclado, M para ver as opções). Exercícios da opção Action potential Pressione Run. Observe as variações de condutância ao Na + e ao K + durante um potencial de ação. QUESTÃO 1. Em que pontos do potencial de ação as condutâncias são as maiores? QUESTÃO 2. Qual a relação entre ativação das condutâncias e o potencial de membrana? Algumas vezes será interessante comparar os gráficos de uma simulação envolvendo determinadas opções (e.g., intensidade e duração do estímulo etc) com os gráficos de uma simulação envolvendo opções diferentes. Essa sobreposição de gráficos pode ser escolhida também nas opções da janela Edit, mantendo-se ou não os gráficos da simulação anterior. Observação: Sempre inclua a duração do estímulo a cada simulação (usando, por exemplo, 0.1 ao invés de 0,1 o programa está escrito em inglês e por isso se usa ponto e não vírgula ), mesmo que a janela Edit informe que essa duração já está prevista ( bug do Programa). Varie a intensidade do estímulo aplicado (utilize os valores 60, 70, 80, 90, 100 e 200 µa/cm 2 ), mantendo a duração do estímulo em 0.1 ms (note que é ponto e não vírgula, pois o programa foi escrito em inglês), sem aplicar um segundo estímulo. Se você sentir a necessidade de expandir a escala da ordenada para olhar mais de perto os efeitos dessas manipulações, vá ao Menu e opter por Expanded scales. QUESTÃO 3. Descreva o que ocorre com as diferentes fases do potencial de ação incluindo velocidades inicial e final de despolarização, pico de despolarização, velocidade de repolarização e hiperpolarização. QUESTÃO 4. Em qual(is) dessa(s) fase(s) a intensidade do estímulo produziu diferenças visíveis? QUESTÃO 5. Explique o porque dessa(s) diferença(s). QUESTÃO 6. Como a intensidade do estímulo interfere nas curvas de condutância ao Na+ e K+? Como se pode explicar esse resultado? Aplique um segundo estímulo com intensidade de 600 µa/cm 2 e 0.1 ms de duração, com início 3, 4, 7 e 8 ms após o primeiro de 100 µa/cm 2 e 0.1 ms de duração. Observe o que ocorre com as condutâncias ao Na + e K +. Aplique, agora, um segundo estímulo de 400 µa/cm 2 e 0.1 ms de duração, 7 e 8 ms depois do primeiro estímulo. Realize diversos experimentos variando a intensidade do estímulo e o tempo desde o início de sua aplicação. QUESTÃO 7. Em que condições ocorre potencial de ação depois da aplicação do segundo estímulo? Discuta as prováveis razões para essas respostas.

2 2 Aplique um estímulo de 60 µa/cm 2 de amplitude e 0.1 ms de duração, sem aplicar um segundo estímulo. QUESTÃO 8. O que ocorre com a voltagem da membrana e com as condutâncias ao Na + e K +? Como se pode explicar esse resultado? Aplique um estímulo de 60 µa/cm 2 de amplitude e 0.1 ms de duração e, depois de 5 ms, aplique um segundo estímulo de 60 µa/cm 2 de amplitude e 0.1 ms de duração. QUESTÃO 9. O que ocorre com a voltagem e com as condutâncias da membrana ao Na + e K +? Diminua o intervalo entre os dois estímulos para 4 e depois 3 ms, mantendo os demais parâmetros de estimulação. QUESTÃO 10. Explique o fenômeno observado. Faça novos testes incluindo também os intervalos de tempo de 3, 2 e 1 ms e observe a velocidade de despolarização do neurônio e as condutâncias da membrana ao Na + e K +. Observe também a velocidade inicial de despolarização em cada situação. QUESTÃO 11. Como se pode explicar os fenômenos observados? Exercícios da opção Current Clamp (em Advanced H-H Simulations ) No Menu escolha a opção Current Clamp. Então, pressione Edit. Na parte esquerda da janela de opções escolha Current.Range: e defina a Range: entre 0 e 900 (ao invés de 30). Na parte direita da janela de opções pode-se definir as características dos estímulos, como antes (não se esqueça de informar 0.1 ms na duração do estímulo). Os exercícios desta opção mostram a voltagem da membrana no gráfico superior, as correntes de Na + e K + no gráfico intermediário, e as características do estímulo no gráfico inferior. Então, pressione Run. QUESTÃO 12. Como se pode descrever a relação temporal entre as correntes de Na + e K + em relação a voltagem da membrana? QUESTÃO 13. Como explicar essa relação temporal entre as correntes de Na + e K +, levando em consideração as relações temporais entre as condutância ao Na + e K + vistas nos exercícios anteriores? Diminua a intensidade do primeiro estímulo para 60 µa/cm 2 de amplitude e 0.1 ms de duração e não aplique um segundo estímulo. QUESTÃO 14. O que ocorre com a voltagem da membrana e qual sua relação com as correntes de Na + e K +? Introduza, agora, um segundo estímulo com 60 µa/cm 2 de amplitude e 0.1 ms de duração, 5 ms após um primeiro estímulo com as mesmas características. QUESTÃO 15. O que ocorre com as correntes de Na + e K +? Reduza o intervalo de tempo entre o primeiro e o segundo estímulos para 4, 3 e 2 ms. QUESTÃO 16. Em que circunstâncias ocorre Potencial de Ação? Observe a corrente de Na + nessas condições de estimulação. O que ocorre com ela? Exercícios da opção Ion Substitution. Esta opção permite simular o efeito do aumento ou redução da concentração de íons Na + [Na + ] e K + [K + ] nos meios externo e interno do neurônio. No programa AXOVACS, isso corresponde a variar as concentrações relativas externas e internas dos íons Na + e K +, em relação a fração normal. Isto é, em condições normais o programa considera que a [Na + ] externa /[Na + ] interna = 1 e que a [K + ] externa /[ K + ] interna = 1. Se aumentamos essa proporção relativa para 2, isso significa que em relação à situação normal a concentração externa do íon foi aumentada ou a concentração interna do mesmo íon foi reduzida, ou ambos concomitantemente (respeitadas as proporções). Da mesma forma, se reduzirmos essa proporção relativa para 0.5, isso significa que em relação à situação normal a concentração externa do íon foi reduzida ou a concentração interna do mesmo íon foi aumentada, ou ambos concomitantemente (respeitadas as proporções).

3 3 Modifique a relação entre as concentrações externa/interna (em frações do normal) do Na + para 2, 1.5 (que poderiam corresponder a maiores concentrações relativas externas), 1.0 (concentrações relativas normais) e 0.5, 0.4 e 0.3 (que poderiam corresponder a menores concentrações relativas externas). Em todos os casos, aplique um estímulo de 100 µa/cm 2 e 0.1 ms de duração. [Observação: Embora não se esteja propondo neste protocolo a observação dos efeitos desse mesmo tipo de manipulações sobre as correntes de Na + e K +, isso seria possível por meio da opção Current Clamp (na janela Edit desta opção, no canto inferior direito, onde se lê Ion gradients, pode-se modificar as concentrações relativas desses íons)]. QUESTÃO 17. O que ocorre com a velocidade da despolarização, o pico da despolarização e a velocidade da repolarização em cada uma dessas condições de estimulação? O que ocorre com as curvas de condutância ao Na +? Como esses fenômenos podem ser explicados? Repita o experimento anterior modificando, agora, as concentrações externa/interna (em frações do normal) do K + ; use os mesmos valores do exercício anterior. QUESTÃO 18. O que ocorre com a velocidade de despolarização, o pico da despolarização e a velocidade da repolarização em cada uma destas condições? O que ocorre com o valor do potencial de membrana após a repolarização? O que ocorre com a condutância da membrana ao K +? Como se pode explicar esses fenômenos? Exercícios da opção Voltage Clamp (em Advanced H-H Simulations ) - Condutâncias Em estudos envolvendo fixação de voltagem é possível investigar as alterações de condutância e de correntes iônicas sem que a membrana esteja sofrendo, concomitantemente, alterações na sua voltagem. Historicamente, isso permitiu identificar os mecanismos críticos envolvidos no potencial de ação. Pressione Edit e opte pela apresentação de Conductancies. Então, defina na tabela First step que a voltagem da membrana será fixada em 0 (zero) mv e que essa fixação terá duração de 8 ms, retornando então ao valor inicial (-60 mv). Pressione Run. QUESTÃO 19. O que ocorre com as condutâncias ao Na + e K + enquanto a voltagem da membrana é mantida constante e fixada em 0 (zero) mv? O que ocorre com essas condutâncias depois que a voltagem retorna aos -60 mv iniciais? Como se pode explicar esses fenômenos? Modifique a voltagem (de fixação) da membrana (na tabela First step ) para -50, -40, -30 e -20 mv. QUESTÃO 20. O que ocorre com as condutâncias ao Na + e K +? Como se pode explicar esse fenômeno? Identifique quais as principais diferenças entre as variações de condutância de Na + e K + nessas simulações. Altere o potencial inicial ( Holding potential ) para 0 (zero) mv e o potencial de fixação ( First step ou primeiro comando) para -60 mv. QUESTÃO 21. Quais as principais diferenças entre as alterações de condutância ao Na + e K +? O que ocorre com a condutância ao K + que discrepa substancialmente em relação às observações anteriores? Explique esses fenômenos. Atribua -60 mv para o potencial inicial ( Holding potential ). No primeiro comando ( First step ) atribua 0 (zero) mv para o potencial (de fixação) de membrana, com início aos 1 ms e duração de 4 ms. No segundo comando ( Second step ) atribua 0 (zero) mv, com início aos 6 ms e duração de 3 ms. A seguir, mantendo os demais valores iguais, aumente o início do segundo comando para 7 e 8 ms. QUESTÃO 22. Explique a diferença de comportamento entre as condutâncias ao Na + e K + nessas simulações e o comportamento da condutância ao Na + a medida que se aumenta o intervalo de tempo para o início do segundo comando. Atribua -60 mv para o potencial inicial ( Holding potential ). No primeiro comando ( First step ) atribua 0 (zero) mv para o potencial (de fixação) de membrana, com início aos 1 ms e duração de 2 ms. No segundo comando ( Second step ) atribua 60 mv, com início aos 6 ms e

4 4 duração de 3 ms. Depois dessa primeira simulação, atribua -20 mv para o potencial inicial, 40 mv para o potencial (de fixação) do primeiro comando e 100 mv para o potencial (de fixação) do segundo comando, mantendo os demais valores iguais. Então, rode essa segunda simulação. QUESTÃO 23. Qual a principal diferença nos resultados da primeira e segunda simulações? Crie uma hipótese para explicar essa diferença. Idealize uma simulação ou conjunto de simulações que permitiriam testar essa hipótese. Exercícios da opção Voltage Clamp ( Advanced H-H Simulations ) Correntes Na + e K + Pressione Edit e opte pela apresentação de Currents. Então, atribua -60 mv à voltagem inicial ( Holding potential ). Defina na tabela First step que a voltagem da membrana será fixada em 0 (zero) mv, que essa fixação terá início aos 1 ms e sua duração será 5 ms. Defina na tabela Second step que a voltagem será fixada em 60 mv e que essa fixação terá início aos 7 ms e sua duração será 2 ms. Pressione Run. QUESTÃO 24. Explique as principais diferenças nas correntes de Na + e K +. EXPERIMENTOS ADICIONAIS Em Menu, escolha a opção Action Potential. Mantendo a intensidade do estímulo em 100μA/cm2, varie sua duração para 0.2, 0.3 e 0.4 ms. QUESTÃO 25. Descreva o que acontece com as diferentes fases do potencial de ação e com as condutâncias ao Na+ e K+, comparando com o estímulo de 0.1 ms, utilizado nos exercícios anteriores. Explique as diferenças. Aplique agora um estímulo com duração de 0.05 ms. QUESTÃO 26. O que acontece com o potencial de ação e as condutâncias? Explique esse efeito. Aplique um primeiro estímulo de 100 µa/cm2 de amplitude e 0.1 ms de duração e, decorridos 4, 6 e 8 ms aplique um segundo estímulo de 500 µa/cm2, com 0.1 ms de duração. QUESTÃO 27. O que ocorre com as voltagens da membrana e com as condutâncias de Na+ e K+? Explique o resultado. Opte por Current clamp: Range Aplique um primeiro estímulo de 100 µa/cm2 com 0.1 ms de duração, e um segundo de 600 µa/cm2 e 0.1 ms de duração, 5 e 9 ms depois do primeiro. QUESTÃO 28. Explique o que acontece com as correntes de Na+ e K+. Em Menu (em Advanced H-H Simulations), escolha Current Clamp. Pressione Edit. Na parte direita da janela reduza a intensidade do primeiro estímulo para ZERO. Na parte inferior esquerda da janela, adicione 100 nm de STX (uma substância que bloqueia de Na+). Rode a simulação. Varie a proporção de K+, na parte inferior direita da janela, para 2, 3 e 5. QUESTÃO 29. Explique a influência do K+ no valor do potencial de membrana (lembre-se da equação de Nernst). Em Menu, escolha a opção Ion Substitution. Pressione Edit. Altere a voltagem inicial para 0 mv e selecione long time scale. Rode a simulação sem aplicar qualquer estímulo. QUESTÃO 30. Qual a diferença entre as condutâncias de Na+ e K+? QUESTÃO 31. Explique a peculiaridade da condutância de K+ nessa condição. Para qual valor o potencial de membrana tende e por quê? Ainda sem aplicar qualquer estímulo, altere a proporção de K+ para 2. QUESTÃO 32. Explique o fenômeno observado (lembre-se da equação de Nernst). Em Menu, escolha a opção Pharmacology. Então, clique em Edit e, mantendo os valores de voltagem inicial em -60mV, amplitude do estímulo em 300µA/cm², e duração de 0,1ms, varie a concentração de STX (saxitoxina) entre 0 e 10mM. Repita o mesmo procedimento, variando agora a concentração TEA (tetraetilamônio) entre 0 e 30mM. QUESTÃO 33. O que acontece em cada caso? Que hipóteses podem ser levantadas sobre o efeito dessas substâncias?

5 5 Agora, em First Stimulus defina amplitude como 100 e a duração do estímulo em 0.1 ms. Varie a concentração de STX para os valores 0.1, 0.3, 0.5 e 1 mm. Agora repita a operação com TEA, nas concentrações de 10, 20 e 30 mm. QUESTÃO 34. A partir das alterações observadas nas curvas de potencial de membrana e condutância explique o modo de atuação dos reagentes (onde estes atuam e quais as conseqüências). Aplique estímulos de 100 µa/cm² e varie a concentração de Saxitoxina (STX substância que bloqueia canais de Na+, similar à tetrodoxina produzida, por exemplo, pelo baiacu) para 0, 0.2, 0.5 e 10 nm. Agora repita a simulação inserindo 0, 2, 5, 10 e 30 mm de Tetraetilamônio (TEA substância que bloqueia canais de K+), sem aplicar STX simultaneamente QUESTÃO 35. Em cada situação, o que ocorre com a despolarização e a velocidade de repolarização? Gere hipóteses para explicar esse resultado. Aplique um estímulo de 60 µa/cm² sem STX. Agora aplique o mesmo estímulo com 1 mm de TEA. QUESTÃO 36. Explique esse resultado. Agora aplique 1 mm de TEA mas sem estimular. QUESTÃO 37. De que modo se explica o fenômeno observado, levando em consideração sua resposta anterior. QUESTÃO 38. Explique o fenômeno ocorrido com a corrente de Na+. QUESTÃO 39. Levando em conta os dois experimentos realizados, explique a relação entre a corrente de Na+ e sua condutância. Agora opte pela apresentação de currents. Então atribua -60 à voltagem inicial ( Holding Potential ). Defina na tabela First Step que a voltagem da membrana será fixada em 0 (zero) mv; que essa fixação terá início aos 1 ms e que sua duração será 5 ms. QUESTÃO 40. Observe que as correntes de Na+ e K+ possuem direções opostas. Quais são as forças que dirigem os íons através da membrana e qual é o tipo de transporte iônico envolvido? Esse movimento de íons é constante ou só ocorre durante o potencial de ação? Agora atribua -60mV à voltagem inicial ( Holding Potential ). Defina na tabela First Step que a voltagem da membrana será fixada em 40mV; que essa fixação terá início aos 1ms e que sua duração será 3 ms. Defina na tabela Second Step que a voltagem será fixada em -60mV; que essa fixação terá início aos 3ms e que sua duração será 3ms. Na tabela Third step, defina que a voltagem será fixada em 40mV, que essa fixação terá início aos 6ms e que sua duração será 3ms. QUESTÃO 41. Observe o comportamento da corrente de Na+ durante os intervalos 1 a 3ms e 6 a 9ms. Como você explica essa diferença? Em Menu (Advanced H-H Simulations), opte por Voltage Clamp e, na janela Display (à esquerda), opte por currents. Atribua -60 mv para o potencial inicial ( Holding potential ). No primeiro comando ( First step ) atribua 0 (zero) mv para o potencial (de fixação) de membrana, com início aos 1 ms e duração de 2 ms. No segundo comando ( Second step ) atribua 40 mv, com início aos 5 ms e duração de 3 ms. Varie as concentrações relativas de Na+ para 1, 0.5, 0.3, 0.2 e Utilize o mesmo procedimento escolhendo, agora, a opção condutance ao invés de currents mantendo os demais parâmetros.