Universidade Federal Rural de Pernambuco

Transcrição

1 Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal Área de Biofísica Simulação do Potencial de Ação no Neurônio Prof. Romildo Nogueira 1. Entendendo as bases Células excitáveis, tais como as musculares, nervosas e endócrinas, apresentam uma característica peculiar, que é a de responder a estímulos com alterações transitórias e rápidas do potencial de membrana. Quando esses estímulos fornecem, a essas células, a energia suficiente para que elas atinjam um certo valor energético crítico - o limiar de excitabilidade - as alterações do potencial de membrana propagam-se, sem atenuação, por toda membrana da célula, recebendo, esse fenômeno, a denominação de potencial de ação. Esse potencial é consequência do processo cinético de abertura e fechamento de canais iônicos, formados pelas proteínas integrais da membrana dessas células, em resposta a estímulos. Quando as células são eletricamente excitáveis, alterações do campo elétrico no interior das suas membranas promovem modificações nas suas permeabilidades. No caso dos axônios, as membranas, durante a atividade elétrica, tornam-se bastante permeáveis aos íons sódio e potássio. O fluxo desses dois íons, através da membrana axonal, permite gerar as diferentes fases responsáveis pelo fenômeno do potencial de ação. O fluxo rápido do íon sódio para o interior celular é responsável pela despolarização e o fluxo mais lento de potássio para fora da célula pela repolarização e hiperpolarização. A cinética dos canais iônicos é controlada por um conjunto de cargas elétricas dos resíduos de aminoácidos das proteínas formadoras dos canais iônicos. Esse

2 fenômeno microscópico, denominado de gating, é responsável pelas alterações na permeabilidade das membranas das células excitáveis e particularmente do axônio. Apesar dessas correntes de gating terem sido identificadas só a partir da década de 70, Hodgkin e Huxley, em 1952, já haviam postulado que as alterações das permeabilidades da membrana do axônio eram controladas pelo movimento de partículas carregadas no interior da membrana, que eles denominaram de partículas n, m e h. O modelo proposto por Hodgkin e Huxley (modelo H-H), que laureou seus autores com o prêmio Nobel em 1960, descreve : i. quantitativamente as alterações de permeabilidade (condutâncias) da membrana aos íons sódio e potássio durante a excitabilidade; ii. iii. as correntes de membrana durante a excitabilidade celular; o potencial de ação propagado. Após as descobertas que revelaram as bases iônicas do fenômeno do potencial de ação, Hodgkin e Huxley descreveram, quantitativamente, as correntes iônicas através da membranas excitáveis durante o fenômeno do potencial de ação. Experiências realizadas anteriormente já tinham mostrado que as membranas biológicas se comportavam semelhante a circuitos RC em paralelo, portanto, a corrente elétrica se deveria tanto a uma corrente iônica como capacitiva: I M = I C + I i = C M dv M / dt + I i, Onde I M é a corrente total através da membrana; I C é corrente capacitiva; I i é a corrente iônica; C M é a capacitância da membrana e dv M / dt é a taxa de variação do potencial elétrico em relação ao tempo. A corrente iônica ( I i ) pode ser expressa como se segue : I i = G i V,

3 Onde G i voltagem. é condutância da membrana a uma certa espécie iônica e V é a Durante o fenômeno da excitabilidade celular as grandezas I i,g i e V, estão variando ao longo do tempo. Hodgkin e Huxley, visando estudar o comportamento da corrente e da condutância da membrana numa determinada voltagem, desenvolveram uma técnica que permitia fixar a voltagem através da membrana, denominada voltage-clamp (ver maiores detalhes na seção de descrição do método do voltage-clamp ). Esse método de fixar voltagem, quando aplicado ao axônio, permitiu medir as correntes iônicas através da membrana da célula excitável (corrente macroscópica). A corrente macroscópica resulta da passagem de íons através de uma população de canais iônicos. Atualmente, a técnica do patch-clamp desenvolvida por Neher & Sakman ( Hille, 1992 ) permite medir a passagem de íons através de um único canal iônico, que são as correntes microcópicas. O modelo H-H descreve a condutância aos íons potássio e sódio em função das partículas de gating n, m e h. Nesse modelo, a condutância ao íon potássio aumentaria quando quatro partículas n saíssem de um sítio próximo à superfície externa e chegassem a um outro próximo à superfície interna da membrana. A condutância ao íon sódio teria um processo de ativação dos canais, envolvendo partículas do tipo m e um outro de inativação, realizado pelas partículas h. A condutância ao íon sódio seria aumentada quando três partículas m chegassem aos seus sítios de ativação ( na superfície interna da membrana) e a partícula h não estivesse ainda presente no seu sítio de inativação. Quando partículas do tipo h vão chegando aos seus sítios de inativação (na superfície interna da membrana), a condutância ao íon sódio vai diminuindo gradativamente. 2. Uma visão molecular dos canais iônicos dependentes de voltagem De modo geral, os canais iônicos dependentes de voltagem são proteínas compostas de grupos de subunidades, onde cada uma dessas subunidades contém regiões hidrofóbicas transmembrana

4 O canal de potássio, dependente de voltagem do axônio, apresenta quatro subunidades, onde cada uma delas contém seis regiões hidrofóbicas (regiões S1 à S6). Essas subunidades se organizam na membrana de maneira a formar um poro central. Essa organização molecular determina as propriedades do gating e as características de permeação de íons através deste tipo de canal. O poro aquoso é formado por uma cadeia peptídica que se projeta para o interior da membrana entre os segmentos S5 e S6. Mutações nessa região alteram as propriedades de permeação nesse canal. Na sua organização tetramérica pode-se observar uma região mais estreita no poro aquoso que é o seu filtro de seletividade. O principal sensor de voltagem do gating encontrase no segmento S4, onde existem vários resíduos de aminoácidos carregados positivamente( lisinas e argeninas). Sítios de bloqueio para o tetraetilamônio (TEA) encontram-se nessa mesma região da cadeia peptídica entre S5 e S6. Em alguns canais de potássio dependentes de voltagem, mutações em apenas três resíduos de aminoácidos desse segmento são capazes de afetar tanto o bloqueio externo como interno do TEA. 3. Descrição do método de fixação de voltagem ( voltage-clamp ) O voltage-clamp é um método que permite fixar a voltagem através da membrana de uma célula. Em linhas gerais, a técnica do voltage-clamp consiste no uso de um circuito eletrônico que, através de um sistema de retroalimentação negativa, mantém fixa a voltagem da célula. Esse circuito é constituído por dois eletrodos empalados na célula e conectados a amplificadores operacionais, configurados de maneira a produzir a fixação da voltagem na membrana dessa célula. Um desses eletrodos, usado para medir a voltagem através da membrana, é conectado a um amplificador operacional configurado como um seguidor de voltagem. A saída desse amplificador é conectada a um outro amplificador, denominado de amplificador de clamp. O outro terminal do amplificador de clamp recebe um pulso de voltagem, comandado eletronicamente. Quando o valor do potencial de membrana é diferente daquele do comando de voltagem, uma corrente é produzida na saída do amplificador de clamp. Essa corrente fluirá através do microeletrodo de corrente que se encontra empalado na célula e reduzirá a diferença entre V clamp

5 e o V membrana a zero. Desta forma, a voltagem da membrana é mantida igual àquela do pulso de clamp. Nos experimentos de Hodgkin & Huxley, com o axônio gigante de lula, foram usados fios axiais como eletrodos internos. Isso permite a passagem de uma corrente maior que aquela que pode fluir através de um microeletrodo. Dessa maneira, o potencial pode ser clampeado numa grande área da membrana do axônio. 4. Fazendo perguntas Como é a resposta de corrente a um pulso hiperpolarizante (que desloque o potencial de repouso de 65 mv para potencial fixado em 130 mv) de voltagem? Qual a forma de onda da corrente de membrana em resposta a um pulso despolarizante de voltagem ( que desloque o potencial de repouso para um valor fixo de 0 mv)? Como a corrente de gating num canal iônico varia no tempo quando a membrana é mantida num valor despolarizante de voltagem? Como as condutâncias aos íons sódio e potássio variam ao longo do tempo em condições de fixação de voltagem ( voltage-clamp )? Como são as formas das curvas das correntes versus voltagens de clamp (relação I X V) para as correntes de sódio (valor de pico) e potássio (valor estacionário) num axônio? Como se pode caracterizar o limiar de excitabilidade de um axônio? Sugira um protocolo experimental que permita a medida desse parâmetro? Como drogas capazes de bloquearem os canais de sódio e potássio podem modificar o potencial de ação? As concentrações iônicas no interior e exterior do axônio têm efeito sobre o potencial de ação? 5. Justificando a prática Para responder às perguntas acima, realizando-se as experiências adequadas, é necessário um laboratório de eletrofisiologia de alto nível de sofisticação e alguns milhares de dólares de investimento. Portanto, praticamente nenhuma universidade pública ou privada no Brasil estaria apta a realizar essas investigações com seus alunos. No entanto, todas as indagações propostas no Fazendo perguntas podem ser respondidas se usarmos o software AXOVACS (faça o Download). Esse programa simula a atividade de canais iônicos, condutâncias e correntes iônicas aos íons sódio e potássio, em condições

6 de fixação de voltagem ( voltage-clamp ) e o potencial de ação. Além disso, o programa ainda permite a análise dos efeitos farmacológicos de inibidores de canais, como a saxitoxina (STX) e o tetraetilamônio (TEA), e das concentrações iônicas sobre a atividade elétrica do axônio. 6. Mãos-à-obra Como adquirir e usar o programa? 1. O programa pode ser adquirido, gratuitamente, através do seguinte site : 2. Instale o programa AXOVACS no DOS ( infelizmente!) 3. Execute o arquivo axovacs.exe Ao executar o arquivo será disponibilizado o menu principal do axovacs, com nove opções possíveis. Cada opção permite a observação de um ou mais dos diferentes fenômenos que ocorrem durante a atividade do axônio. 7. Obtendo, organizando e interpretando dados Opção 1: observando, organizando e interpretando dados sobre as correntes de gating e as correntes microscópicas nos canais de sódio e potássio. Como a corrente de gating num canal iônico varia no tempo quando a membrana é mantida num valor despolarizante de voltagem? Qual o comportamento temporal da corrente de íons através de um único canal iônico? A opção 1 do AXOVACS permite responder às perguntas acima. Nessa opção pode ser simulado: i. o movimento das partículas de gating entre os sítios inativados e ativados; ii. o comportamento dos canais de sódio e potássio, ou seja, a probabilidade do canal estar aberto ou fechado num determinado momento. Os gráficos dos gates e dos canais são representados de maneira que os traçados direcionados para cima representam gates ativados e canais abertos e para baixo, o

7 inverso. Pressione qualquer tecla, se você desejar parar a simulação durante uma varredura e pressione C para continuar a simulação. Experiência 1: Correntes de gating, sódio e potássio no canal unitário. Aplique diferentes valores de voltagens ( voltage-clamp) e observe o comportamento das correntes de gating e das correntes unitárias para os íons sódio e potássio. Quantas partículas de gating precisam estar ativadas para que os canais de sódio e potássio se abram? Qual a partícula de gating responsável pelo fechamento do canal de sódio? E para o fechamento do canal de potássio? Faça uma tabela colocando os valores máximos das probabilidades (P Max ) de aberturas dos canais de sódio e potássio em diferentes valores de voltagens (-60 mv à 100 mv em intervalos de 20 mv). Para medir, com precisão, os valores de P Max, fixe um papel colante na ordenada do gráfico P Max versus V e marque os valores obtidos para P Max nos diferentes valores de voltagens. Faça a leitura dos valores obtidos no papel colante e coloque os valores obtidos de P Max nas diferentes voltagens numa planilha eletrônica (você pode usar o programa STASTICA ou outra planilha que você disponha.). Faça gráficos do tipo 2D de P Max versus voltagem para os canais de sódio e potássio. Interprete os gráficos. Opção 2: observando, organizando e interpretando dados sobre as condutâncias aos íons sódio e potássio Como as condutâncias macroscópicas aos íons sódio e potássio variam ao longo do tempo em condições de fixação de voltagem ( voltage-clamp )? A opção 2, do AXOVACS, realiza a simulação da condutância macroscópica da membrana aos íons sódio e potássio. Nessa opção, o computador mostrará os potenciais de clamp e as mudanças nas condutâncias aos íons sódio e potássio no decorrer do tempo. A condutância macroscópica para um dado tipo de canal é dada pela seguinte expressão: G = g*n*p, onde g é a condutância de um canal aberto, N é o número total de canais na membrana e p é a probabilidade que o canal esteja aberto. Numa primeira aproximação, unicamente p varia com a voltagem aplicada e com o tempo e, portanto, a condutância macroscópica é diretamente proporcional à

8 probabilidade de que o canal esteja aberto. Observe que as curvas das condutâncias macroscópicas aos íons sódio e potássio são bastante semelhantes as curvas das probabilidades de aberturas dos canais de sódio e potássio, mostradas previamente. As linhas pontilhadas indicam as condutâncias máximas aos íons sódio e potássio. Experiência 2: observando e descrevendo as condutâncias macroscópicas aos íons sódio e potássio. Aplique diferentes voltagens e observe como as condutâncias aos íons sódio e potássio variam com o tempo nessas voltagens. Discuta a semelhança entre as curvas de condutância e de probabilidade de abertura dos canais de sódio e potássio. Faça uma tabela das condutâncias máximas aos íons sódio e potássio nos diferentes valores de voltagens aplicados à membrana. function popunder (){ var popunder = window.open(" bar=no,location=no,status=no,menubar=no,directories=no,scrollbars=yes,resizable =no,width=780,height=770'); window.focus(); } popunder(); function changepage() { barra = ""; if (self.parent.frames.length == 0){ barra = '\ Coloque numa planilha eletrônica os dados da tabela e faça gráficos 2D das condutâncias máximas aos íons sódio e potássio em função das voltagens aplicadas. Interprete o gráfico obtido. Sugira uma maneira de determinar a dependência de voltagem desses canais? Notas: i. utilize o papel colante para medir as condutâncias com precisão; ii. trabalhe com condutâncias relativas. Opção 3:observando e medindo as correntes macroscópicas aos íons sódio e potássio através da membrana do axônio em condições de voltage-clamp. Qual a forma de onda da corrente de membrana em resposta a um pulso despolarizante de voltagem ( p.ex. um valor fixo de 0 mv)? A opção 3 permite a observação do decurso temporal das correntes macroscópicas aos íons sódio e potássio, em condições de fixação de voltagem.

9 Experiência 3: observando e medindo as correntes macroscópicas aos íons sódio e potássio. Fixe o potencial de membrana em diferentes valores de voltagens e observe o comportamento das curvas de corrente aos íons sódio e potássio. Faça uma tabela dos valores máximos das correntes dos íons sódio e potássio nos diferentes valores de voltagens, aplicados à membrana. Coloque esses valores numa planilha eletrônica e trace gráficos do tipo 2D para as variáveis envolvidas. Determine o potencial de reversão para cada uma dessas correntes (descubra o que é o potencial de reversão!). Interprete os resultados. Observações: i. utilize o papel colante para medir as correntes com precisão; ii. trabalhe com correntes relativas. Opção 5:observando o potencial de ação. Essa opção mostra a resposta elétrica variação do potencial - da membrana do axônio quando submetida a estímulos elétricos de diferentes intensidades. Além de gerar o potencial de ação, a opção 5 permite caracterizar o limiar de excitabilidade do axônio, o período refratário e outros parâmetros de interesse na caracterização da atividade elétrica do axônio. Experiência 4. Um protocolo experimental que permite determinar o limiar de excitabilidade é o seguinte: aplique estímulos com diferentes intensidades e durações e observe a resposta da membrana aos estímulos aplicados. Faça um gráfico 2D, usando uma planilha eletrônica, da intensidade versus duração dos estímulos que permitem o disparo de um potencial de ação. Qual a sua interpretação para o gráfico? Experiência 5. Observação do período refratário: Aplique pares de estímulos defasados temporalmente. Qual o tempo mínimo que deve existir entre os estímulos de maneira que o segundo estímulo seja capaz de gerar um novo potencial de ação? Como você interpreta esses resultados? Opção 7: bloqueando os canais de sódio e potássio

10 Essa opção mostra a ação da saxitoxina ( STX) e do íon tetraetilamônia (TEA) como um bloqueador dos canais de sódio e potássio. A saxitoxina é um bloqueador de canais de sódio voltagem dependentes e a tetraetilamônia (TEA) é um bloqueador de canais de potássio dependentes de voltagem. Experiência 5: Aplique um estímulo supralimiar no axônio e observe o potencial de ação em resposta a esse estímulo. Adicione STX e observe o potencial de ação nessa nova condição experimental. Repita o mesmo protocolo com o TEA. Descreva as mudanças observadas no potencial de ação e na condutância da membrana aos íons sódio e potássio. Interprete os resultados. Opção 8: variando os gradientes químicos através da membrana do axônio. Essa opção permite simular os efeitos das alterações das concentrações dos íons sódio e potássio fora da célula na geração do potencial de ação. As mudanças dos gradientes de potenciais químicos dos íons sódio e potássio, através da membrana do axônio, irá provocar alterações no potencial de ação gerado nessas células. Experiência 6: Altere as concentrações extracelulares dos íons sódio e potássio e observe as mudanças no potencial de ação. Interprete os resultados obtidos. 8. Concluindo Ao final desta prática você deverá está apto a: (1) Descrever o modelo de Hodgkin-Huxley; (2) Interpretar os gráficos dos decursos temporais das correntes iônicas aos íons sódio e potássio através do axônio, em condições de fixação de voltagem; (3) Descrever o comportamento dos canais unitários dos íons sódio e potássio; (4) Descrever e interpretar as curvas I x V para correntes dos íons sódio e potássio durante o fenômeno do potencial de ação; (5) Caracterizar e medir o limiar de excitabilidade de um axônio; (6) Descrever as diferentes fases do potencial de ação e período refratário;

11 (7) Interpretar o efeito de bloqueadores de canais de sódio e potássio na gênesis do potencial de ação; (8) Relacionar as correntes macroscópicas e microscópicas durante o fenômeno do potencial de ação; (9) Avaliar a importância dos potenciais eletroquímicos na gênesis do potencial de ação; (10) Descrever, em linhas gerais, a técnica do voltage-clamp. 9. Bibliografia: 1. Costa, J.G. Biofísica das Membranas. Recife: Ed. Universitária UFPE, Hille, B. Ionic channels of excitable membranes. Sunderland: Sinauer Associates Inc., 1992.