UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA Utilização do Tanino como Fotossensibilizador na Terapia Fotodinâmica contra Enterococcus faecalis PAULA VANESSA DA SILVA Orientadora: Prof. a Dr a. Ângela Toshie Araki Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Odontologia. SÃO PAULO 2014

2 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL S582u Silva, Paula Vanessa da. Utilização de tanino como fotossensibilizador na terapia fotodinâmica contra enterococcus faecalis / Paula Vanessa da Silva. -- São Paulo; SP: [s.n], p. : il. ; 30 cm. Orientadora: Ângela Toshie Araki. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Enterococcus faecalis 3. Endodontia 4. Azul de metileno. I. Araki, Ângela Toshie. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU: : (043.2)

3 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Utilização do Tanino como Fotossensibilizador na Terapia Fotodinâmica contra Enterococcus faecalis PAULA VANESSA DA SILVA Tese de doutorado defendida e aprovada pela Banca Examinadora em 23/10/2014. BANCA EXAMINADORA: Prof a. Dr a. Ângela Toshie Araki Universidade Cruzeiro do Sul Presidente Prof. Dr. Cacio Moura Netto Universidade Cruzeiro do Sul Prof. Dr. Igor Prokopowitsch Universidade Cruzeiro do Sul Prof a. Dr a. Marina Beloti Ferreira Universidade de São Paulo Prof. Dr. Fábio Valverde Rodrigues Bastos Neto Associação Paulista de Cirurgiões Dentistas

4 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Aos meus pais, Severino e Francisca Por estarem sempre ao meu lado, pela educação que me proporcionaram e o exemplo de família que construíram Aos meus irmãos, Kátia, Cida, Silvano, Cláudia e Karla Pelo carinho, respeito e confiança Aos meus sobrinhos Por tornarem os meus dias mais coloridos Ao meu namorado, Sérvio Túlio Pelas demonstrações diárias de AMOR e COMPANHEIRISMO, e por todos os momentos inesquecíveis vividos e que viverei ao seu lado À minha orientadora, Professora Dra. Ângela Toshie Araki Yamamoto Pela confiança em mim depositada Minha profunda gratidão!!!

5 AGRADECIMENTOS Ao curso de pós-graduação em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul. Pela atenção e dedicação, por todo o empenho demonstrado no decorrer do curso. Aos meus companheiros no Doutorado: pelos momentos divertidos compartilhados durante essa caminhada. Aos professores do Curso de Doutorado em Odontologia, com área de concentração em Laserterapia, que muito contribuíram para o meu aprendizado durante o curso. Aos meus alunos da iniciação científica, por se mostrarem sempre disponíveis e me auxiliarem na realização desta pesquisa Aos funcionários da Universidade Cruzeiro do Sul, pela disponibilidade e atenção. Ao Laboratório de Microbiologia das Faculdades Integradas de Patos-FIP, pela disponibilidade. Ao Laboratório de Biologia da Uiversidade Potiguar -UNP, pelo preparo das substâncias. Às minhas colegas professoras, pelo empenho e responsabilidade ao me substituir durante os momentos em que precisei me ausentar. Aos meus alunos, por compreenderem a minha ausência. A todos que contribuíram de alguma forma para a realização desta pesquisa.

6 Silva PV. Utilização do tanino como fotossensibilizador na terapia fotodinâmica contra enterococcus faecalis [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; RESUMO O presente estudo teve como objetivo avaliar a redução microbiana após a terapia fotodinâmica como coadjuvante ao preparo químico-cirúrgico, utilizando o tanino hidrolizável como fotossensibilizador, em canais radiculares de dentes bovinos contaminados com Enterococcus faecalis. Foram utilizados 60 dentes, divididos em seis grupos, grupo 1, onde utilizou-se apenas o NaOCl a 2,5%, grupo 2, utilizou-se a PDT com azul de metileno como fotossensibilizador, grupo 3, apenas o tanino, grupo 4, utilizou-se PDT com tanino como fotossensibilizador, grupo 5, associou-se ao NaOCL a 2,5%, a PDT com tanino e no grupo 6, associou-se ao NaOCL a 2,5% a PDT com azul de metileno. Para a PDT utilizaram-se 3ml do fotossensibilizador na concentração de 0,005% que permaneceram no interior do canal radicular por 5min. Para a irradiação foi utilizado um laser semicondutor portátil (Laser DUO, GaAlAs, InGaAlP), comprimento de onda de 660 nm, potência de 100 mw, totalizando 1,8 J de energia e tempo de irradiação de 180s. Após o PQC, foram realizadas três coletas microbiológicas, denominadas inicial, intermediária e final. Após as coletas, fez-se o plaqueamento para a contagem das UFC s. Os resultados foram expressos através das medidas estatísticas: média, desvio padrão, mediana, quartis e valores mínimo e máximo. Foi utilizado o teste F (ANOVA), as comparações múltiplas de Tamanhe e o teste de Kruswal-Wallis. A verificação da hipótese de normalidade foi realizada através do teste de Shapiro-Wilk. O nível de significância estabelecido foi de 5%. Verificou-se que a variação percentual da avaliação inicial para intermediária foi menos elevada nos Grupos 2 e 3 e mais elevadas no Grupo 1. Na variação inicial e final, verifica-se que a menor média ocorreu no Grupo 1, e foram mais elevadas no Grupos 5 (98,33%) e Grupo 6 (88,76%) sendo verificadas diferenças significativas entre os Grupos (p<0,001). Concluiu-se que terapia fotodinâmica, utilizando o tanino hidrolizável como fotossensibilizador, mostrou-se eficaz, como coadjuvante ao preparo químico-cirúrgico na redução microbiana, sendo este, uma alternativa dentre os corantes a serem utilizados na PDT. Palavras-Chave: Terapia fotodinâmica, Endodontia, Corantes, Tanino.

7 Silva PV. Use of tannin as a photosensitizer in photodynamic therapy against enterococcus faecalis [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; ABSTRACT The present study aimed to evaluate the microbial reduction after photodynamic therapy as an adjunct to chemical-surgical preparation, using the hydrolyzable tannin as a photosensitizer in root canals of bovine teeth infected with Enterococcus faecalis. 60 teeth, divided into six groups, group 1, where we used only the 2.5% NaOCl, group 2, was used to PDT with methylene blue as a photosensitizer, group 3, only the tannin group 4 were used was used as tannin PDT with photosensitizer, group 5, was associated with 2.5% NaOCl, PDT with tannin and group 6, was associated with 2.5% NaOCl PDT with methylene blue. To PDT were used in 3 ml of the photosensitizer in a concentration of 0.005% remaining in the root canal for 5 minutes. For the irradiation a laser portable semiconductor (laser DUO, GaAlAs, InGaAlP), wavelength 660 nm, power 100 mw, totaling 1.8 J of energy and irradiation time of 180 seconds was used. After the PQC three microbiological sampling, initial, intermediate and final named were performed. After collection, made up plating to count UFC's. The results were expressed as statistical measures: mean, standard deviation, median, quartiles and minimum and maximum values. The F-test (ANOVA) for multiple comparisons and the Tamanhe of Kruswal-Wallis test was used. The verification of the hypothesis of normality was performed using the Shapiro-Wilk test. The significance level was set at 5%. It was found that the percentage change from baseline to intermediate was lower in Groups 2 and 3, and higher in Group 1 in initial and final variation, it appears that the smallest average occurred in Group 1, and were higher in 5 Groups (98.33%) and Group 6 (88.76%) significant difference was seen between the Groups (p <0.001). It was concluded that photodynamic therapy using hydrolyzable tannin as a photosensitizer, was effective as an aid to chemical-surgical preparation on microbial reduction, this being an alternative among the dyes to be used in PDT. Keywords: Photodynamic therapy, Endodontics, Dyes, Tannin.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Dente bovino com selamento apical Figura 2 Frascos contendo os espécimes Figura 3 Câmara de fluxo laminar Figura 4 Dentes bovinos dispostos na plataforma metalica Figura 5 Coleta microbiológica com cone de papel absorvente Figura 6 Eppendorf contendo cone de papel após a coleta microbiológica Figura 7 Incubação dos espécimes; Armazenagem dos espécimes Figura 8 Agitador Figura 9 Diluição e plaqueamento em triplicata Figura 10 Placas contendo UFC s Gráfico 1 Média do número de colônias de bactérias (x 2 x 102) Gráfico 2 Mediana do número de colônias de bactérias (x 2 x 102) Gráfico 3 Média da variação percentual entre a avaliação e as outras duas avaliações segundo o grupo Gráfico 4 Mediana da variação percentual entre a avaliação e as outras duas avaliações segundo o grupo... 60

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Distribuição dos grupos Tabela 2 Estatística do número de colônias (x 2 x 10 2 ) segundo o grupo e o tempo de avaliação Tabela 3 Estatísticas das variações percentuais entre a avaliação inicial com cada avaliação em relação ao número de colônias segundo o grupo... 59

10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PDT Photodinamic therapy μg/ml Micrograma por mililitro AsGAAl Arseneto de gálio e alumínio E. faecalis Enterococcus faecalis BHI Brain heart infusion Ca(OH)2 Hidróxido de cálcio CP Comprimento de patência CRT Comprimento real de trabalho EDTA Ácido etilenodiamino tetracético FS Fotossensibilizador J Joules J/cm2 Joules por centímetro quadrado MEV Microscopia eletrônico de varredura MTAD Mixture of a Tetracycline Isomer, an Acid, and a Detergent mw MiliWatt N/cm Newton por centímetro NaOC Hipoclorito de sódio NiT Níquel-titânio Nm Nanômetro Pasta HPG Pasta de hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol canforado e glicerina PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction PQC Preparo químico-cirúrgico rpm Rotação por minuto SCR Sistema de canais radiculares TFD Terapia fotodinâmica UFC Unidade formadora de colônia DNA ácido desoxirribonucléico Ca(OH) 2 hidróxido de cálcio ph potencial hidrogeniônico

11 NiTi MB TBO CNV Níquel- titânio Azul de metileno Azul de toluidina Neovascularização coloidal

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Microbiologia Endodôntica Preparo Químico-Cirúrgico (PQC) Efeito Mecânico Efeito Químico A Terapia Fotodinâmica Histórico Mecanismo de interação Efeitos fototóxicos da PDT Tempo de pré- irradiação Fotossensibilizadores Fontes de energia Pesquisas com PDT na Endodontia OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAL E MÉTODOS Tipo e Local do Estudo Instrumentos Microrganismo e meio de cultura Preparação dos espécimes Contaminação dos espécimes com Enterococcus faecalis Condições Experimentais Preparo Químico-Cirúrgico e Terapia Fotodinâmica Grupo Controle: NaOCL a 2,5% Grupo 2: PDT com Azul de Metileno... 48

13 4.3.4 Grupo 3: Tanino Grupo 4: PDT com Tanino Grupo 5: NaOCL + PDT com Tanino Grupo 6: NaOCL + PDT com Azul de Metileno Coletas Microbiológicas: Análise Estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 69

14 13 1 INTRODUÇÃO A Endodontia é uma especialidade que envolve a etiologia, a prevenção, o diagnóstico e o tratamento das alterações patológicas do endodonto e da região apical e periapical. O objetivo do tratamento endodôntico consiste em eliminar ou reduzir ao máximo o número de microrganismos do interior do sistema de canais radiculares (SCR), respeitando a complexa anatomia do referido sistema (SIQUEIRA et al., 1999). A patologia a ser tratada pelo endodontista é a lesão pulpo-periapical, já estando bem estabelecida a relação de causa e efeito entre os microrganismos e o desenvolvimento dessa lesão (KAKEHASHI et al., 1965; SUNDQVIST, 1976; MÖLLER et al., 1981). O controle microbiológico deve ocorrer em todas as etapas do tratamento, sendo estas, elos importantes, e devem ser realizadas em um correto protocolo de execução que envolve desde a abertura coronária, até o selamento tridimensional do sistema de canais radiculares, conseguido com a obturação endodôntica. (SIQUEIRA et al., 2004; BERGMANS et al., 2008). O preparo químico-cirúrgico (PQC) é fundamental para o sucesso dos tratamentos endodônticos, visando a limpeza e modelagem do canal radicular, a fim de se obter um canal radicular livre de conteúdos irritantes e com um formato cônico afunilado com maior diâmetro coronário e menor diâmetro apical. (ALMYROUDI et al., 2002; DAMETTO et al., 2010). Além da ação mecânica dos instrumentos, substâncias químicas auxiliares devem ser associadas aos meios mecânicos durante o preparo químico-cirúrgico, para facilitar a ação do instrumento, a fim de promover auxílio indispensável à sanificação do complexo endodôntico. Estas substâncias são utilizadas antes, durante e após a instrumentação do canal para que no ato da aspiração, os detritos presentes sejam removidos e o número de bactérias seja reduzido, proporcionando uma correta limpeza e desinfecção dos canais. (SEAL et al., 2002). A solução de hipoclorito de sódio (NaOCl), em diferentes concentrações, é a substância mais utilizada como solução irrigadora, uma vez que, além de possuir

15 14 propriedades clareadoras e de dissolução dos tecidos (GOMES et al., 2006), tem-se mostrado efetivo como agente antimicrobiano (BONSOR et al., 2006a). Porém, apresenta a desvantagem de ter efeito oxidativo nos tecidos vitais da região periapical, desencadeando uma reação inflamatória (BERGMANS et al., 2006). E a capacidade de o NaOCl remover smear layer tem se mostrado deficiente (BAUMGARTNER et al., 2007; FIMPLE et al., 2008). Maior parte das falhas no tratamento endodôntico vem da permanência de conteúdo infectante no interior dos canais. O Enterococcus faecalis (E. faecalis), microrganismo anaeróbio facultativo, tem sido a espécie mais prevalente em casos de insucesso endodôntico. As técnicas atuais para a desinfecção do SCR incluem a instrumentação, a irrigação com agentes antimicrobianos e a medicação intracanal (SIQUEIRA et al., 2004d). No entanto, novos procedimentos para aprimorar a desinfecção do SCR vêm sendo desenvolvidos, dentre os quais o uso do laser de baixa potência associado ao fotossensibilizador na terapia fotodinâmica (SEAL et al., 2002; BONSOR et al., 2006; FONSECA et al., 2008; GARCEZ et al., 2008). A Terapia Fotodinâmica, também conhecida como PDT, acrônimo de Photodynamic Therapy, surge como uma promissora terapia antimicrobiana. Envolve a utilização de um fotossensibilizador (corante), que é ativado pela luz de um específico comprimento de onda na presença de oxigênio. A transferência de energia do fotossensibilizador ativado para o oxigênio disponível resulta na formação de espécies tóxicas de oxigênio, conhecido como oxigênio singleto e radicais livres. Estes são espécimes químicos altamente reativos que danificam proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e outros componentes celulares microbianos (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007). Para tanto, diversos corantes vêm sendo testados, nas cores roxa, marrom, verde, entre outras. A busca de agentes fotossensibilizadores tem sido uma constante no campo da PDT, tanto para o tratamento do câncer, como para a redução de microrganismos. Corantes menos tóxicos, mais ressonantes com o comprimento de onda emitido pelos lasers têm sido o ideal de diversos pesquisadores. (CARSON et al., 2005).

16 15 Na endodontia, os fotossensibilizadores derivados das fenotiazinas têm sido amplamente empregados nas pesquisas envolvendo PDT. O azul de metileno tem sido o principal fotossensibilizador utilizado como alvo para microrganismos da microbiota endodôntica (CASTRO at al., 2006). Taninos, do francês tanin, são os compostos fenóis, corantes naturais que estão entre os maiores constituintes ativos derivados dos vegetais, justificando o uso tradicional das plantas como antinflamatórios e cicatrizantes. Quando condensados, originam um precipitado vermelho e, em solução, desenvolvem coloração verde ou azul (ASONGALEM et al., 2004) Com o propósito de buscar novas formas terapêuticas, que apresentem menor toxicidade, maior potencial antimicrobiano, sobretudo contra o E. faecalis, e baixo custo no tratamento endodôntico, é objetivo deste trabalho quantificar a redução da carga bacteriana de canais radiculares de dentes bovinos contaminados por uma cepa (isolado endodôntico) de E. faecalis, aplicando a PDT, como coadjuvante ao preparo químico-cirúrgico, utilizando o tanino como fotossensibilizador.

17 16 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Microbiologia Endodôntica Bactérias e seus subprodutos desempenham um importante papel no desenvolvimento e na manutenção das lesões perirradiculares (MÖLLER et al., 1981). A composição da microbiota e a sua localização no interior do canal radicular dependem da disponibilidade de oxigênio, do acesso e da disponibilidade de nutriente, do sinergismo e/ou competição entre espécies e das defesas do hospedeiro (HAAPASALO et al., 2005). Na infecção endodôntica, a maioria das células bacterianas encontra-se em suspensão no canal principal, mas podem ocorrer grandes aglomerações bacterianas aderidas às paredes do canal, formando um biofilme de multicamadas e multiespécies, estabelecendo-se assim, portanto, uma comunidade clímax. As bactérias desses aglomerados podem estender-se para o interior dos túbulos dentinários, o que provoca uma infecção intratubular (SIQUEIRA et al., 2004c). Na infecção primária, as condições favorecem a presença de bactérias anaeróbias estritas, presentes em combinações de dez a vinte espécies. As mais comumente encontradas pertencem aos gêneros Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Treponema, Tannerella, Streptococcus, Peptostreptococcus, Eubacterium, Propionibacterium, Campylobacter, Selenomonas e Actinomyces (SIQUEIRA; RÔÇAS, 2005). Siqueira et al. (2002a) analisaram o padrão da infecção primária de quinze dentes unirradiculares recém-extraídos com lesão perirradicular aderidas aos respectivos ápices. Esses dentes foram submetidos ao microscópio eletrônico de varredura, sendo então observada intensa colonização bacteriana, com predomínio da forma cocos, constatando-se, ainda ocasionalmente, a presença de fungos. O padrão de colonização demonstrou uma organização de comunidade clímax em alguns casos, com penetração de bactérias nos túbulos dentinários. Utilizando o método da reação em cadeia da polimerase (PCR) para investigar a prevalência de patógenos endodônticos na porção apical das raízes de

18 17 dentes extraídos com lesões perirradiculares, Siqueira et al. (2004b) detectaram a presença de Pseudoramibacter alactolyticus em 44% dos casos, Treponema denticola em 26%, Fusobacterium nucleatum em 26%, Porphyromonas endodontalis em 17%, Filifactor alocis em 9%, Dialister pneumosintes em 4%, Porphyromonas gingivalis em 4% e Tannerella forsythensis em 4%. Souza et al. (2005), utilizando a técnica do checkerboard para hibridização DNA-DNA, observaram uma incidência de 100% de Fusubacterium nucleatum ss. vincentii em dentes com infecção primária, bem como uma grande prevalência de Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga ochracea, Streptococcus constellatus, Veillonella parvula, P. gingivalis, Prevotella melaninogenica e Streptococcus sanguinis. As conclusões desse estudo confirmam a constatação de ser polimicrobiana a infecção endodôntica, com predomínio de anaeróbios estritos. No estudo realizado por Chu et al. (2005), os autores observaram que os gêneros prevalentes foram Prevotella, Peptostreptococcus, Actinomyces e Campylobacter, bem como que a quantidade média de espécies por canal foi de 4,6. Esse estudo também confirmou a natureza polimicrobiana da infecção endodôntica primária, com predomínio de espécies Gram-negativas. Enterococcus faecalis, uma espécie bacteriana Gram-positiva anaeróbia facultativa, é muito associada à persistência da infecção intra-radicular. A alta resistência do E. faecalis ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e ao hidróxido de cálcio [Ca(OH) 2 ] pode resultar na sua permanência após o término do tratamento endodôntico e por isso essa espécie bacteriana está associada a infecções persistentes (EVANS et al., 2002). Essa espécie pode ser encontrada em monoinfecção ou estar associada a poucas espécies, além de ser capaz de sobreviver por longos períodos sem nutrientes. Sua alta resistência aos medicamentos utilizados durante a terapia endodôntica, principalmente à ação antimicrobiana da pasta de Ca(OH) 2 usada como medicação intracanal, é proporcionada pela sua capacidade de sobreviver em ambientes com ph alcalino (STUART et al. 2006). Evans et al. (2002) observaram que o E. faecalis é resistente ao Ca(OH) 2 quando este, está com ph 11,1 ou menos. Quando ocorre uma elevação no ph do

19 18 meio, a bactéria tende a preservar seu ph intracelular através de uma bomba de prótons. O correto funcionamento dessa bomba é crítico para a sobrevivência do E. faecalis em ambientes alcalinos e quando o ph atinge 11,5, esse mecanismo mostra-se sobrecarregado, o que leva à morte do microrganismo. Os microrganismos estabelecidos no interior do SCR não podem ser atingidos pelos mecanismos de defesa do hospedeiro. Por isso, as infecções de origem endodôntica devem ser tratadas tanto por procedimentos mecânicos quanto por substâncias químicas (DAMETTO et al., 2010). 2.2 Preparo Químico-Cirúrgico (PQC) O objetivo do tratamento endodôntico consiste em eliminar ou reduzir o número de bactérias no interior do SCR. Essa redução é conseguida pelo preparo químico-cirúrgico do SCR, auxiliado pelo uso da medicação intracanal (SIQUEIRA et al.,1997). Sabe-se que nenhum protocolo atual é capaz de eliminar por completo os microrganismos do interior do canal de modo a torná-lo estéril. Por isso, vários estudos científicos buscam técnicas com o objetivo de reduzir ao máximo a infecção do canal radicular (BYSTRÖM; SUNDQVIST, 1983) Efeito Mecânico Byström & Sundqvist (1981) analisaram a redução microbiana de canais infectados após a realização do PQC com instrumentos manuais de aço inoxidável e solução salina. Observaram que o procedimento foi eficaz na redução da contagem de microorganismos do interior dos canais radiculares, mas metade dos casos permaneceu apresentando bactérias viáveis. Dalton et al. (1998) compararam a redução bacteriana do interior de canais radiculares irrigados com solução salina e preparados com instrumentos rotatórios de níquel-titânio (NiTi) taper 0,04 e pela técnica step-back com instrumentos de aço inoxidável. Amostras foram coletadas antes, durante e depois do PQC. Os autores observaram que, com o aumento progressivo do calibre dos instrumentos, a redução microbiana foi uniforme e progressiva, independentemente da técnica utilizada. Os resultados desse estudo indicaram não haver diferença estatística significativa entre

20 19 as técnicas quanto à capacidade de redução bacteriana intracanal, e que nenhuma das técnicas conseguiu debelar totalmente as bactérias do interior dos canais radiculares. Com o intuito de estudar os efeitos mecânicos da instrumentação e da irrigação, Siqueira et al. (1999) inocularam E. faecalis em dentes extraídos e os instrumentaram com instrumentos manuais Nitiflex, GT e Profile série 29 (taper 0,06), irrigando-os com solução salina. A instrumentação com Nitiflex número 30 foi significativamente mais eficaz do que a utilização dos instrumentos GT. Não encontraram os autores diferença estatística quando compararam os efeitos da Profile número 5 com a GT e com a Nitiflex número 30. O preparo apical, até a lima Nitiflex número 40, foi significativamente mais eficaz na eliminação de bactérias do que as outras técnicas e instrumentos testados. Os resultados desse estudo mostraram que a instrumentação e a irrigação através da ação do fluxo e refluxo podem remover mecanicamente mais de 90% das células bacterianas do interior do canal radicular. Em um estudo in vitro, Colak et al. (2005) analisaram a redução bacteriana intracanal em canais inoculados com E. faecalis e instrumentados com instrumentos manuais de aço inoxidável Hedströem, com limas Hedströem adaptadas ao motor de rotação alternada Giromatic e com instrumentos rotatórios de NiTi Hero 642. Solução salina estéril foi usada como solução irrigadora, e amostras foram coletadas antes e depois do PQC. Todos os instrumentos testados revelaram-se aptos a reduzir o número de células bacterianas do interior dos canais radiculares, não havendo diferença estatística significativa entre eles, observando-se, contudo, que nenhuma técnica neutralizou por completo a presença bacteriana Efeito Químico A irrigação desempenha um importante papel na eliminação dos microorganismos do canal radicular. Os irrigantes são usados durante o tratamento endodôntico, com o objetivo de remover debris, lubrificar paredes dentinárias, dissolver matéria orgânica e atuar como antibacteriano (SIQUEIRA et al., 2000; SIQUEIRA et al., 2002b).

21 20 Os procedimentos de limpeza e desinfecção do SCR, por sua vez, estão diretamente relacionados com efeitos químicos e mecânicos dos irrigantes. O efeito mecânico da irrigação é gerado pela ação de fluxo e refluxo da solução no interior do canal radicular (SIQUEIRA et al., 2000). A escolha do agente irrigante a ser usado deve levar em consideração uma combinação de várias propriedades, como ação antimicrobiana, capacidade de dissolução do tecido pulpar e compatibilidade biológica com os tecidos perirradiculares (ESTRELA et al., 2003). O NaOCl é amplamente recomendado como irrigante no preparo químicocirúrgico dos SCR, devido à sua capacidade solvente de tecidos necrosados e vivos, bem como a suas propriedades antibacterianas. Essa solução reage com os debris orgânicos do interior do SCR, o que facilita a limpeza, mas essa reação inativa o hipoclorito de sódio e reduz sua capacidade antibacteriana, razão por que a solução de hipoclorito de sódio do interior do canal radicular deve ser sempre renovada (AYHAN et al., 1999; ESTRELA et al., 2002). Quando o NaOCl reage com a água, há a formação de hidróxido de sódio e ácido hipocloroso (LOPES et al., 2004b). O ácido hipocloroso contém cloro ativo que funciona como um forte agente oxidante, sendo o responsável pelo efeito antimicrobiano através da oxidação de um grupo de enzimas importantes para o metabolismo das bactérias (AYHAN et al., 1999; SIQUEIRA et al., 2000; ESTRELA et al., 2002). Byström & Sundqvist (1983) observaram uma considerável redução na quantidade de bactérias do canal radicular após o preparo químico-cirúrgico, com o uso de uma substância sem poder antibacteriano, mas o preparo com NaOCl a 0,5% se mostrou mais eficaz. Segundo os mesmos autores (1985), não existe diferença no efeito antibacteriano da irrigação com NaOCl a 0,5% e a 5%. Além disso, observaram maior eficácia no uso combinado do EDTA com NaOCl a 5% do que na utilização exclusiva do NaOCl. Notaram também que as bactérias sobreviventes à instrumentação e irrigação apresentavam um rápido crescimento quando nenhuma medicação intracanal era empregada.

22 21 No estudo realizado por Siqueira et al. (2000), os autores observaram que as concentrações de NaOCl nas soluções testadas (a 1%, 2,5% e 5,25%) não apresentaram diferença estatística significativa quanto à capacidade de remoção de E. faecalis do interior de canais de dentes extraídos. Esses resultados sugerem que a irrigação frequente e abundante com a concentração mais fraca de NaOCl é suficiente para a eliminação dos microorganismos do interior do canal radicular, questionando a necessidade do uso de soluções mais concentradas. Gomes et al. (2001) testaram a capacidade antibacteriana do NaOCl nas concentrações de 0,5%, 1%, 2,5%, 4% e 5,25%, bem como da clorexidina gel e líquida com 0,2%, 1% e 2% de concentração em poços com suspensões de células de E. faecalis em cloreto de sódio (NaCl) em diferentes tempos. Observaram que todos os irrigantes foram eficazes contra a bactéria estudada, sendo os mais ativos a clorexidina líquida em todas as concentrações e o NaOCl a 5,25%. Observou-se também que o tempo necessário para a eliminação do microrganismo depende da concentração do irrigante utilizado. Peters et al. (2002), em um estudo in vivo, observaram que, após o PQC e a irrigação com NaOCl a 2%, houve uma redução significativa de bactérias em relação à contagem inicial, e 76% dos dentes apresentaram cultura negativa após esse preparo. Sassone et al. (2003) avaliaram o crescimento de staphylococcus aureus, e. faecalis, escherichia coli, p. gingivalis e f. nucleatum após contato com NaOCL a 1% e a 5% e com clorexidina a 0,12%, a 0,5% e a 1%. a clorexidina a 0,12% não eliminou o e. faecalis, enquanto a clorexidina a 1% e o NaOCl a 1% e a 5% eliminaram todos os microrganismos. Dametto et al. 2010, avaliaram a redução microbiana em 20 dentes bovinos contaminados com E. faecalis, comparando o NaOCl a 2,5% e Digluconato de Clorexidina Líquida a 2%. Todos os espécimes foram instrumentados, através da técnica de instrumentação manual escalonada coroa-ápice, com limas tipo K file (Dentsply Maillefer; Baillaigues, Switzerland) até a lima #120 com comprimento real de trabalho de 20mm, previamente determinado, através da odontometria visual. Para irrigação, durante o PQC, foi utilizada seringa plástica estéril e agulha Endo-

23 22 Eze em aço inoxidável da Ultradent, de diâmetro 30 Gauge e de comprimento médio de 24mm, sendo calibradas em 20mm, correspondentes ao CRT. Ao final do PQC, todos os elementos foram irrigados com 10 ml de soro fisiológico para remoção da solução testada e, posteriormente, foram feitas as coletas microbiológicas. O NaOCL a 2,5% mostrou-se mais eficaz que o Digluconato de Clorexidina Líquida a 2%. A seringa, a agulha e a sua profundidade de inserção durante a irrigação, também constitui um fator relevante na redução da contagem bacteriana intracanal. Sedgley et al. (2005) demonstraram que 6 ml de irrigante é significativamente menos eficaz quando a agulha de irrigação é posicionada a 5 mm do Comprimento Real de Trabalho (CRT), em comparação quando posicionada a 1 mm do Comprimento Real de Trabalho (CRT). Devido à toxicidade do NaOCl, diversas soluções estão sendo testadas para substituí-lo na irrigação do SCR, ou para serem coadjuvantes ao PQC, potencializando o efeito antimicrobiano nesta fase do tratamento endodôntico (SASSONE et al., 2003; CARSON et al., 2005; HAAPASALO et al., 2005; ZEHNDER et al., 2006; DAMETTO et al., 2010). 2.3 A Terapia Fotodinâmica Histórico O termo Terapia Fotodinâmica é relativamente novo, mas a modalidade de tratamento que combina a administração da droga e subsequente exposição à luz solar é muito antiga. Existem relatos do uso de plantas ou extratos ingeridos oralmente e luz solar para tratar doenças de pele (SETUBAL et al., 2007). A utilização da luz como agente terapêutico tem sido empregada no tratamento de doenças desde a antiguidade. No Egito, Índia, e China, utilizava-se a luz solar para tratamento de doenças da pele como psoríase, vitiligo, e câncer. O famoso médico grego Heródoto, enfatizava a importância da exposição à luz solar para restauração da saúde (FONSECA et al.,2008).

24 23 O conceito de morte celular induzida pela interação de luz e substâncias químicas é reconhecido há mais de 100 anos. No ano de 1900, as primeiras experiências com tratamento fotodinâmico foram relatadas por Oscar Raab, um estudante de medicina, e seu professor, Herman Von Tappeiner em Munique. Eles estudaram o efeito do corante de acridina sobre culturas de paramécios, e descobriram que a combinação do corante de acridina e luz foi letal para os mesmos. Durante uma tempestade com ocorrência de muitos raios, houve alteração das condições luminosas do ambiente no momento dos experimentos, transferência da energia da luz para a substância química, similar ao que ocorre nas plantas pela absorção da luz pela clorofila. Nem a luz ou o corante isoladamente tiveram qualquer efeito aparente sobre os paramécios, mas, juntos, eles foram altamente citotóxico (DONNELLY et al., 2008). De acordo com o autor supracitado, os corantes inicialmente empregados em PDT, eosina e acridina, foram logo abandonados devido à sua toxicidade e carcinogênese. Em 1911 Hausmann e Meyer-Betz reportaram a fototoxicidade distinta da hematoporfirina e em 1913, Meyer-Betz se auto injetou 200mg do que se pensava ser a hematoporfirina pura, e não sentiu nenhum efeito até que expôs-se à luz solar, em consequência, sofreu inchaço severo e fotossensibilidade que duraram vários meses. No fim dos anos 60, houve um tratamento bem sucedido de uma mulher exibindo metástase de câncer de mama com um derivado na hematoporfirina, a HpD. Testes clínicos utilizando várias preparações do HpD foram iniciados no início da década de 70. Dougherty et al. (1975), reportaram que o HpD em combinação com a luz vermelha poderia erradicar o crescimento do tumor mamário em ratos. Weishaupt et al. (1976) utilizaram a PDT como coadjuvante à terapia antimicrobiana em ratos. A FDA (Food and Drug Administration/ EUA) aprovou, em 1998, a PDT para o tratamento do câncer e, posteriormente, huve aprovação na Holanda, Japão, França, Itália e Alemanha. No Brasil, a implantação da PDT envolveu no início, os físicos do Instituto de Física de São Carlos (USP) e médicos do Hospital Amaral Carvalho de Jaú, São Paulo. Surgiu então, de forma conjunta, a decisão de implantar no Brasil esta nova

25 24 modalidade terapêutica para o tratamento do câncer e como terapêutica antimicrobiana. Até então, as várias iniciativas no país tinham sido bastante isoladas e de caráter não-clínico. Uma equipe composta por médicos, físicos, cirurgiõesdentistas e biomédicos se uniu para dar início à implantação clínica. (ALLISON et al., 2004). Desde então, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido utilizada clinicamente para o tratamento de diversas doenças malignas e é uma terapia aprovada para a destruição de neovascularização coroidal (CNV) em degeneração macular relacionada com a idade (RYSKOVA et al., 2010). No entanto, apenas recentemente, com o início da busca por tratamentos alternativos contra agentes patogênicos resistentes aos antibióticos, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido investigada mais profundamente ( DAY et al., 2012) Mecanismo de interação A Terapia Fotodinâmica, também conhecida como PDT, acrônimo de Photodynamic Therapy, surge como uma promissora terapia antimicrobiana. Envolve a utilização de um fotossensibilizador (corante), que é ativado pela luz de um específico comprimento de onda na presença de oxigênio. A transferência de energia do fotossensibilizador ativado para o oxigênio disponível resulta na formação de espécies tóxicas de oxigênio, conhecido como oxigênio singleto e radicais livres. Estes são espécimes químicos altamente reativos que danificam proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e outros componentes celulares microbianos (FIMPLE et al., 2008). É importante que a fonte de luz seja ressonante com o corante para que a PDT seja efetiva na inviabilização de células. A maioria das bactérias orais não absorve a luz visível de lasers que operam em baixa potência, com exceção de alguns microrganismos gram-positivos, Actinomyces odontolyticus e Porphyromonas gingivalis, que sintetizam porfirinas endógenas. A utilização de um agente de absorção óptica, não tóxico, que se fixe à parede celular bacteriana, atraindo para si a luz laser, é necessária para que ocorra a ação antimicrobiana sobre as bactérias orais (KONOPKA et al., 2008).

26 25 Quando uma molécula aromática absorve luz de certa quantidade de energia, ela pode sofrer transição eletrônica ao estado excitado singleto (spin eletrônico emparelhado). Dependendo da estrutura molecular e do ambiente, a molécula pode perder sua energia por processos físicos ou eletrônicos, retornando ao seu estado fundamental, ou pode sofrer transição ao estado excitado tripleto (spin eletrônico desemparelhado). Neste estágio, a molécula pode sofrer novamente decaimento eletrônico e retornar ao seu estado fundamental, sofrer reação redox com o ambiente ou sua energia de excitação ser transferida ao oxigênio molecular conduzindo a formação do oxigênio singleto instável (LAM et al., 2011). Ainda, segundo o autor supracitado, neste estágio, a molécula pode sofrer novamente decaimento eletrônico e retornar ao seu estado fundamental, sofrer reação redox com o ambiente ou sua energia de excitação ser transferida ao oxigênio molecular conduzindo a formação do oxigênio singleto instável. A habilidade da molécula em formar reação redox ou oxigênio singleto depende da produção suficiente de moléculas no estado tripleto, que por sua vez depende da taxa de decaimento de ambos estados tripleto e singleto inicialmente formados. Segundo Machado (2012), a reação envolvida decorre primariamente da excitação eletrônica do corante pela luz, seguida de dois mecanismos principais de reação a partir do seu estado excitado. Na reação do tipo I, ocorre transferência de elétron entre o fotossensibilizador no estado tripleto excitado e, componentes do sistema, gerando íons-radicais, que tendem a reagir com o oxigênio no estado fundamental, resultando em produtos oxidados, como peróxido de hidrogênio, íons hidroxila, radicais hidroxila, ânion superóxido, que são tóxicos aos microrganismos. Na reação do tipo II, ocorre transferência de energia do fotossensibilizador no estado tripleto, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente citotóxico. Em PDT é difícil fazer distinção entre os dois tipos de mecanismos, mas em ambos, o mecanismo de dano á célula alvo é dependente da tensão de oxigênio e concentração do fotossensibilizador. A reação do tipo II é considerada como a predominante no dano fotooxidativo às células microbianas. No caso dos fotossensibilizadores, é importante que o estado tripleto seja bem povoado (presença de muitos elétrons / fótons) e relativamente, de maior duração. Se isto ocorrer, o fotossensibilizador excitado terá tempo de reagir com seu

27 26 ambiente (transferência eletrônica / reações redox) ou transferir sua energia de excitação a uma molécula de oxigênio e produzir o altamente reativo oxigênio singleto. Assim o fotossensibilizador danifica os alvos biológicos principalmente por oxidação. O importante em PDT é a capacidade de excitar o fotossensibilizador em seu alvo e com mínimo de dano no tecido circunvizinho (CASTANO et al., 2013) Efeitos fototóxicos da PDT A PDT é um tratamento de câncer e antimicrobiano, que requer a exposição de células e tecidos a uma droga fotossensibilizante, seguida pela irradiação com luz de comprimento de onda apropriado, usualmente na região do vermelho ou infravermelho próximo e compatível com o espectro de absorção do fotossensibilizador. (KRAMMER-MAREK et al., 2006). A morte das células pelo agente citotóxico (oxigênio singleto ou ROS) pode se dar pela indução de apoptose ou necrose, reações inflamatórias, reações imunes, além da ocorrência de danos aos à vasculatura do tumor ou da célula-alvo, resultando em morte por indução da hipóxia ou inanição. A PDT é um tratamento adequado para doenças localizadas. A luz empregada para excitar os fotossensibilizadores atuais pode provocar necrose fotoquimicamente induzida em até um máximo de 10nm. Uma grande vantagem da penetração limitada da luz é que isso protege o tecido normal saudável sob o tumor da fototoxicicidade. (TRIESSCHEIZN et al., 2006). Uma vez dentro da célula, a maioria dos fotossensibilizadores não se acumula no núcleo celular, eles se ligam a matrizes celulares apolares como lisossomos, mitocôndrias e/ou membranas plasmáticas. O oxigênio singleto e outras espécies de ROS produzidos por PDT nas membranas causam dano foto-oxidativo a proteínas e lipídios que residem a poucos nanômetros dos locais de ligação do fotossensibilizador. (SIMPLICIO et al., 2002). A destruição microbiana proporcionada pela PDT em nível molecular é bem estabelecida em muitos casos. A reação do tipo I com água em meio microbiano pode elevar os radicais hidroxila, que podem reagir com biomoléculas ou combinarse para formar peróxido de hidrogênio in situ. Os subsequentes resultados

28 27 citotóxicos incluem a remoção de hidrogênio de moléculas insaturadas como os fosfolipídios da membrana citoplasmática bacteriana, alterando a permeabilidade e integridade da membrana. A inativação de enzimas da membrana e receptores também é possível. (DONELY et al., 2008). Na reação do tipo II, o fotossensibilizador no estado tripleto transfere sua energia para o oxigênio molecular, formando in situ o oxigênio singleto, que então reage rapidamente com componentes celulares como a parede celular, ácido nucléico, peptídeos e moléculas envolvidas na manutenção estrutura da parede celular / membrana, tais como fosfolípedes, esteróis e peptídeos. O período curto de vida do oxigênio singleto novamente assegura uma resposta localizada. A reação do tipo II é geralmente aceita como o principal caminho fotooxidativo no dano celular microbiano (HUANG et al., 2012). A fotossensibilização de bactérias está relacionada com a carga do fotossensibilizador. Em geral, os de carga neutra ou positiva interagem eficientemente e inativam bactérias gram-positivas, enquanto que interagem em alguma extensão na membrana externa de bactérias gram-negativas. A camada de poros de peptideoglicano e ácido lipoteicóico na membrana citoplasmática externa de bactérias gram-positivas, permite a difusão do fotossensibilizador. A membrana externa de bactérias gram-negativas age como uma barreira física e funcional entre as células e o meio biológico (SIREM et al., 2013) Tempo de pré- irradiação O tempo de pré-irradiação corresponde ao tempo decorrido entre a aplicação do fotossensibilizador no alvo e sua ativação pela luz. É um ponto crítico para o sucesso da PDT, uma vez que, se o fotossensibilizador não estiver próximo ao alvo, sua ativação pela luz irá resultar na formação de espécies tóxicas em local não desejado. A morfologia microbiana pode variar com as espécies causando diferenças na localização do fotossensibilizador (LAM et al., 2011). Segundo o autor supracitado, o tempo necessário para absorção do corante antes da iluminação é importante para o sucesso na PDT. Nas aplicações da PDT antimicrobiana, espera-se que o corante una-se ao microrganismo ou chegue a

29 28 ultrapassar a barreira da membrana celular e, neste período, o fotossensibilizador não sofra degradação antes da ativação pela fonte de luz Fotossensibilizadores Os fotossensibilizadores (FS) têm estruturas moleculares que são tipificadas por ligações duplas conjugadas que contêm um sistema deslocalizado de π- elétrons. No estado neutro (singleto), estes elétrons são emparelhados em orbitais de spin de baixa energia. Após a aplicação da luz correspondente ao pico de absorção do FS, o elétron que ocupa o orbital molecular de maior energia do FS fica animado e salta para o orbital molecular desocupado, excitando o FS a um estado singleto animado, instável e de vida curta. O mais importante para o processo da PDT é a inversão do spin do elétron animado, conhecido como cruzamento intersistema para originar o estado tripleto do PS. Este estado tripleto é menos enérgico do que o estado singleto animado, mas tem uma vida útil muito mais longa (microssegundos). O elétron animado, agora com um spin paralelo, ao contrário da sua antiga forma (elétron emparelhado), pode não reverter imediatamente para um nível mais baixo de energia, de acordo com o Princípio de Exclusão de Pauli. Assim, o elétron animado no estado tripleto do PS pode mudar sua orientação de spin (um processo relativamente lento) e emitir sua energia como fosforescência, ou, alternativamente, o PS pode interagir imediatamente com moléculas em seu ambiente, tais como o oxigênio molecular (DAI, T. et al., 2007). O fotossensibilizador deve possuir uma banda de absorção ressonante com o comprimento de onda da fonte de luz a ser utilizada. Ele deve possuir estabilidade biológica, eficiência fotoquímica, seletividade pela célula alvo e mínimo efeito tóxico as células normais (DONELLY et al., 2008). Para se fazer uma escolha racional entre os milhares de fotossensibilizadores (FS) e fontes de luz disponíveis, é necessário entender um pouco dos aspectos mecânicos de como o FS se comporta com a iluminação e o que acontece quando é colocado em contato com células de mamíferos em cultura de tecidos. A forma exata como a terapia fotodinâmica PDT influencia nas vias celulares, é fortemente regulada pela localização do FS na célula, que depende de sua natureza química, tais como: peso molecular, lipofilicidade, anfifilicidade, carga iônica e características

30 29 de ligação às proteínas; a concentração de PS, o tempo de incubação, a concentração de soro e o fenótipo da célula alvo (CASTANO et al., 2004). Dois pontos devem ser considerados quando a eficácia do procedimento fotodinâmico é avaliada: a concentração do fotossensibilizador e intensidade luz incidente no tecido alvo (RYSKOVA et al., 2010). O processo de fotoinativação de microrganismos é dependente da substância fotossensível e da luz. Não menos importante, é o tipo de fotossensibilizador e sua concentração, o tipo de laser (comprimento de onda do feixe de luz) e a dose de luz aplicada por irradiação (LYON et al., 2011). A substância fotossensível (FS), por si só, não tem ou apresenta um insignificante efeito antimicrobiano. No entanto, após a irradiação com luz visível de comprimento de onda apropriado, a substância em estado de repouso inicial tornase instável. Durante este processo, fótons (energia) são absorvidos pelo FS. Produtos citotóxicos altamente reativos podem ser produzidos quanto houver a presença de oxigênio. O resultado da reação do FS com o oxigênio molecular é a produção de radicais Hidroxila (OH - ) e superóxidos, radicais de oxigênio ou oxigênio singleto ( 1 O 2 ). O oxigênio molecular no estado primário contém 6 elétrons na última camada de energia, sendo dois desemparelhado. A transferência de energia pelo FS promove a inversão do spin de um dos elétrons da molécula de oxigênio transformando-a do estado tripleto para singleto. O oxigénio Singleto tem um período de meia vida muito curto (nanosegundos) e sua difusão limita-se a uma distância de até 100 nm. Por isso, sua atividade citotóxica é confinada somente ao local onde é produzido. Em consequência disto, para que fotoativação tenha sucesso, é necessário um período de pré-irradiação, após a aplicação, para que o FS possa acumular-se na célula-alvo (RYSKOVA et al., 2010). De acordo com o autor supracitado, em laboratório, o 1 O 2 é frequentemente gerado por reações de fotossensibilização. Nestas reações, são utilizadas moléculas conhecidas como fotossensibilizadores, tais como: derivados de fenotiazinas (O azul de toluidina e azul de metileno); porfirinas (hematoporfírina, ácido deltaaminolevulínica), xantinas (rosa bengala), clorinas (de clorina (e6)), derivados de clorina (e6) (como poli-l-lisina e polietilenoimina); ftalocianinas (disulphonated

31 30 ftalocianina de alumínio, ftalocianinas catiónicas de zinco, disulphonated ftalocianina de zinco). As ftalocianinas são compostos heterocíclicos de um núcleo de tetrapyrrole ligados por pontes de nitrogênio. Alguns de seus derivados são usados como corantes para impressoras (cor azul), tintas ou plásticos. São capazes de permanecer no estado animado por um período mais longo em comparação com azul de metileno ou azul de toluidina. Além disso, são mais resistentes à degradação química ou fotoquímica. Absorvem a luz a um comprimento de onda entre nm, que beira a extremidade do espectro infravermelho. As ftalocianinas já foram estudadas para promover descontaminação sanguínea e para a terapia fotodinâmica de cânceres (RYSKOVA et al., 2010). O tetrapirrol, como porfirina, clorinas e bacterioclorinas, é uma classe de fotossensibilizador que apresenta características promissoras para ser utilizado na terapia fotodinâmica antimicrobiana (HUANG et al., 2010). Vários estudos mostraram a utilização de fotossensibilizadores e luz visível para destruir bactérias. No entanto, as propriedades físico-químicas necessárias para tornar mais efetiva à terapia fotodinâmica têm sido pouco estudadas (DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). Segundo Castano; Demidova; Hamblin, (2004), as características ideais dos fotossensibilizadores são: Devem ter baixos níveis de toxicidade para os seres humanos e animais experimentais no escuro, e baixa incidência de toxicidade de funcionamento durante a irradiação; Devem absorver a luz em comprimentos de onda no vermelho ou entre a luz vermelha e infra-vermelha, que tem a finalidade de penetrar nos tecidos; Eles devem ter faixas de absorção relativamente elevadas (> M -1 cm- 1 ) para minimizar a dose do fotossensibilizador (FS) necessária para alcançar o efeito desejado. A síntese do FS deve ser relativamente fácil e a matéria-prima disponível para sua produção deve ser viável em larga escala. Devem ser um composto puro com uma composição constante, prazo de validade estável e ser solúvel em água ou em uma mistura de solventes aquosos inofensivos.

32 31 Não devem agregar indevidamente em ambientes biológicos, pois isso reduz sua eficiência fotoquímica. A eliminação farmacocinética do paciente deve ser rápida, ou seja, deve ser menor que um dia para que não seja necessária a proteção pós-tratamento à exposição prolongada da luz com a pele. Deve apresentar um intervalo de tempo curto entre a aplicação e a eliminação para facilitar o tratamento ambulatorial que é mais agradável para o paciente e de baixo custo. Não trazer dor ao paciente, já que a terapia fotodinâmica, normalmente, não requer anestesia ou sedação profunda. Não causar mutagenicidade ou carcinogenicidade. Habilidade de poder ser empregado com outras modalidades terapêuticas, tanto no tratamento do câncer, como na terapêutica antimicrobiana. Para que uma molécula possa atuar como um eficiente fotossensibilizador, deve possuir a capacidade de absorver a luz visível, passando para um estado excitado e transferindo esta energia para o oxigênio molecular. Moléculas que possuem tais características são tipicamente estruturas planares rígidas possuindo um alto grau de conjugação. Os fotossensibilizadores mais empregados na PDT incluem as phenothiazinium, porphyrin e phthalocyanine que apresentam estruturas planas, simples e tricíclicas, tipicamente de natureza catiônica. Os compostos mais amplamente usados são o azul de metileno (MB) e azul de toluidina (TBO). Ambos são eficientes na produção de oxigênio singleto e apresentam absorção máxima de luz com comprimento de onda de 656 nm, para MB, e 625, para TBO (DONNELLY et al., 2008). Na endodontia, os fotossensibilizadores derivados das fenotiazinas têm sido amplamente empregados nas pesquisas envolvendo PDT. As fenotiazinas são compostos heteroaromáticos tricíclicos, corantes azuis, como o corante azul de toluidina e o azul de metileno. Em baixas concentrações não produzem ação citotóxica e a dose necessária para a morte bacteriana é menor que a dose para causar danos a células, como queratinócitos e fibroblastos (FIMPLE et al., 2008). Segundo Wainwright (2008), as fenotiazinas são mais efetivas contra espécies de microrganismos gram-positivos do que contra espécies gram-negativas.