IMPORTÂNCIA DOS MARCADORES MICROSSATÉLITES COMO PROVA FORENSE DE DNA NA INVESTIGAÇÃO DE VÍNCULO GENÉTICO

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1 IMPORTÂNCIA DOS MARCADORES MICROSSATÉLITES COMO PROVA FORENSE DE DNA NA INVESTIGAÇÃO DE VÍNCULO GENÉTICO Charlley Anchieta Lourenço Silva¹ Paulo Roberto Queiroz² 1 Químico e Farmacêutico. Universidade de Brasília - UnB, Brasil. Aluno da Pós-Graduação em Farmácia e Química Forense, Universidade Católica de Goiás/IFAR. charlley.silva18@gmail.com. 2 Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília UnB. Professor do IFAR/PUC-GO. Endereço: IFAR Instituto de Estudos Farmacêuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasília DF CEP: pqsilva@uol.com.br. Resumo Nas últimas décadas, a genética molecular propiciou um grande avanço na capacidade de identificação humana. No início, esse conhecimento era tratado de modo difuso, trabalhoso e com baixa credibilidade no meio forense. Então, nos anos 1990, houve um movimento governamental e científico para padronizar procedimentos nos laboratórios forenses, de modo a unificar a linguagem de troca de informações genéticas e facilitar a interpretação dos resultados. Foi com esse afã que os marcadores microssatélites (STR's) de DNA foram eleitos e tornaram-se uma espécie de moeda comum de troca de perfis de DNA até os dias de hoje, devido aos quesitos: segurança, automatização, pequeno conjunto de loci e alto poder de discriminação. Com essa motivação, o presente trabalho descreve a importância dos STR's como o principal meio de identificação humana como prova forenses de DNA nos exames de vínculo genético, particularmente de paternidade. A revisão traz um histórico sobre o marcador; define e aponta os tipos de STR's e os usados na esfera cível e criminal; destaca a técnica de PCR e os kits comercias; descreve as principais ferramentas estatísticas forenses; e relaciona as legislações brasileira relativas ao exame de DNA nos testes de paternidade. Palavras-chave: Kit. STR. PCR. Teste de Paternidade. Legislação de paternidade. Abstract In recent decades, molecular genetics has provided a major breakthrough in the ability of human identification. At first, this knowledge was treated so pervasive, intensive, and low credibility in forensics. Then, in 1990 there was a government and scientific movement to standardize procedures in forensic laboratories in order to unify the language of exchange genetic information to facilitate interpretation of results. It was with such zeal that the microsatellite (STR) DNA were elected and became a kind of "currency" common exchange of DNA profiles to the present day, due to requirements: security, automation, small set of loci and high discrimination power. With this motivation, the current work describes the importance of STR's as the primary means of human identification as evidence in forensic DNA testing genetic relationships, particularly fatherhood. The review brings the historical about marker, defines and indicates the types of STR's and what is used in civil and criminal sphere, highlights the use of PCR and commercial kits, describes the main statistical tools forensic; and lists the Brazilian laws regarding the examination DNA paternity tests. Keywords: Kit. STR. PCR. Paternity Test. Legislation Paternity. 1/20

2 1 INTRODUÇÃO O termo identidade deriva do latim idem que significa o mesmo e é definido como a qualidade do idêntico. Fala-se de identidade a partir de conceitos filosóficos, psicológicos, sociais, biológicos, jurídicos e médico-legais (GARCIA, 2009). Neste contexto podemos afirmar que identidade é o conjunto de caracteres físicos, funcionais e psíquicos, natos ou adquiridos, porém permanentes, que fazem com que uma pessoa seja ela mesma e não outra (ALCÂNTARA, 1982). Por outro lado, a identificação é um processo pelo qual se determina a identidade de algo ou alguma coisa. Para MARANHÃO (1998, p.53), identificação é exatamente o processo, método ou técnica, usado para evidenciar as propriedades exclusivamente individuais. Para tanto, os métodos de identificação precisam atender a alguns requisitos para terem validade científica. Os requisitos de validação dos métodos de identificação biológica são a unicidade, a imutabilidade (perenidade), a variabilidade (classificabilidade) e a praticabilidade (GARCIA, 2009). Os dois primeiros são características técnicas, já a variabilidade (classificabilidade) e a praticabilidade são requisitos técnicos dos achados biológicos (MUSSE, 2009). O sistema de identificação biométrico usa os princípios anteriormente descritos. Define-se biometria como a ciência da determinação da identidade de um indivíduo nos atributos físicos, químicos ou comportamentais da pessoa. Tem-se, como exemplo, a datiloscopia (GARCIA, 2009). Em 1892, as impressões digitais (impressões papiloscópicas) deixadas pelas extremidades dos dedos passaram a ter aplicações para fins de identificação pessoal, em virtude de suas características singulares. Nem os gêmeos idênticos têm impressões digitais iguais (BORÉM et al., 2001). No entanto, a identidade biológica mais autêntica é a estrutura gênica que está organizada na molécula do ácido desoxirribonucléico DNA que compõe um indivíduo. A combinação aleatória dos milhares de genes torna cada ser humano único (GARCIA, 2009). Na espécie humana existem cerca de 50 mil genes que codificam o ácido ribonucléico - RNA e proteínas. Estes genes codificadores de proteínas representam, aproximadamente, 10% do genoma. O restante são sequências de DNA com funções diversas da síntese de proteínas. É a variabilidade desse repertório de sequências de DNA, quais sejam as regiões hipervariáveis ou polimórficas, que se utiliza nos exames forenses de DNA. Os polimorfismos mais conhecidos são as regiões VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), conhecidas como minissatélites e as STR (Short Tandem Repeats), designadas por microssatélites (DOLINSKY, 2007). 2/20

3 Os VNTR s foram usados com sucesso para a tipagem do DNA por mais de 10 anos. No entanto, como as análises de loci de VNTR requerem grandes quantidades de DNA, esta metodologia não é tão eficiente para a tipagem de DNA degradado e amostras com pouca quantidade de DNA como, por exemplo, os preparados de DNA a partir de amostras biológicas coletadas do meio ambiente. Por outro lado, a análise de STR é uma metodologia mais simples que funciona mesmo com DNA em pouca quantidade ou degradado (GÓES, 2002). Essa modalidade de determinação/exclusão de paternidade surgiu no final do século passado. Os STR s, por serem sequências de DNA menores, permitem a análise de DNA já degradado, tais como, material biológico seco, em decomposição, decomposto ou carbonizado que contém pouco DNA analisável (FILHO, 2007). Os testes de vínculo biológico, também designados por testes de filiação biológica ou testes de paternidade (sentido lato), são realizados em geral a dois indivíduos com a finalidade de confirmar ou excluir uma relação genética de parentesco normalmente de filiação podendo, por isso, ter consequências jurídicas. A maioria visa identificar o pai biológico (testes de paternidade, em sentido restrito), mas existe também a possibilidade de se identificar a mãe biológica (teste de maternidade) (SANTOS, 2010). Desta forma, o objetivo desse trabalho foi descrever a importância dos marcadores microssatélites como prova de DNA na investigação de vínculo genético. 2 METODOLGIA Trata-se de um estudo qualitativo, descritivo, documental e retrospectivo de revisão bibliográfica. Foram utilizados artigos científicos constantes em bases de dados, tais como, Scielo, Science Direct e CAPES; portais de bibliotecas universitárias como da UnB e USP, entre outros; sites de organizações nacionais e internacionais de referência que trabalham com marcadores STR s e livros especializados sobre o assunto. Foram consultados também sites, legislações e livros jurídicos relativos ao tema. 3 DESENVOLVIMENTO 3.1 Definição de Microssatélite O DNA genômico apresenta regiões de cópia única e outras com níveis variáveis de repetições. Estas repetições podem ser longas (satélites), curtas (minissatélites) ou muito curtas (microssatélites) (MUNIZ, 2010). Os microssatélites ou repetições curtas in tandem (STR s) ou repetições de sequências simples (Simple Sequence Repeats SSR s), são 3/20

4 sequências de DNA contendo unidades básicas repetidas de dois a sete nucleotídeos de comprimento. Essas unidades repetem-se várias vezes em um determinado trecho do genoma. Embora o genoma humano contenha milhares de marcadores STR s, apenas um pequeno conjunto de loci base foi selecionado para uso em testes forenses de identificação humana (BUTLER, 2007). Os STR s de maior valor forense são aqueles que apresentam maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho, maior frequência de heterozigotos (maior que 90%) e baixa frequência de mutações (CARVALHO, 2009). Os marcadores moleculares podem ser agrupados em polimorfismos de comprimento e polimorfismos de sequência. Os primeiros incluem as regiões VNTR s e STR s. Dentre estes, os marcadores STR s são os mais utilizados. A chave da diversidade nessas regiões é baseada na variação do número de repetições entre os indivíduos, podendo ser estudadas com sondas de DNA, ou por meio de Reação em Cadeia de Polimerase - PCR. Já os polimorfismos de sequências são compostos de diferentes nucleotídeos em um determinado locus do genoma. Estas variações em sequências podem ser manifestadas como regiões de alelos alternativos ou substituições, adições ou deleções de bases. Em geral, originam-se de mutações pontuais (DOLINSKY, 2007). Os microssatélites também são classificados de acordo com o tipo de sequência que se repete: a) perfeito: a sequência das bases se repete e não ocorre interrupção; b) imperfeito: há presença de nucleotídeo diferente da estrutura repetitiva; c) interrompido: pelo menos uma das repetições apresenta nucleotídeos intercalados; d) ou composto: apresenta mais de um tipo de repetição em série adjacente (BHARGAVA, 2009). 3.2 Tipos de Microssatélites O Projeto Genoma Humano aumentou o conhecimento sobre o genoma humano e, portanto, há muito mais loci STR disponíveis agora do que havia há 10 anos. Mais de loci STR s tetranucleotídeos foram caracterizados e pode haver mais de um milhão dependendo de como eles são contados. As sequências de STR s são responsáveis por cerca de 3% do genoma total. No entanto, mesmo que o conjunto inicial de loci STR selecionado não seja consistente, um banco de dados de DNA eficaz só poderia ser construído por meio da geração de genótipos com um conjunto comum de marcadores genéticos. Os loci núcleo autossômicos atuais desempenham e desempenharão um papel vital nos testes de identidade humana. A existência dos kits STR aumentou ainda mais a utilização deles (BUTLER, 2006). É interessante notar que os loci STR base ocorrem entre os genes que apresentam um alto 4/20

5 grau de variabilidade. Além disso, eles não são diretamente responsáveis por características físicas como cor do cabelo ou, a cor dos olhos ou doenças genéticas (BUTLER, 2007). Além dos marcadores autossômicos, os marcadores de microssatélites do cromossomo Y (Y-STR s) são importantes na análise forense do DNA. Em 1990, fez-se a seleção de um conjunto núcleo de dez Y-STR o qual foi denominado de MHL (Minimal Haplotype loci ou Haplótipos Mínimos de loci). A análise dos microssatélites do cromossomo Y tem sido utilizada para elucidação de casos de estupro nos quais se tem mistura de material biológico (masculino e feminino). Além disso, pode-se realizar teste de paternidade sem a mãe. O cromossomo Y tem três regiões distintas. Duas regiões são homólogas ao cromossomo X e podem sofrer recombinação. No entanto, há uma exclusiva que não sofre recombinação com o cromossomo X e, por isso, é passada de pai para filho sem sofrer alterações. Estudos apontam um baixo índice de mutação nessa região do cromossomo Y, podendo os mesmos haplótipos serem encontrados ao longo de várias gerações de homens de uma mesma linhagem humana (DOLINSKY, 2007). Pesquisas com estes marcadores têm sido feitas em estudos visando entender como ocorreu o processo de evolução e migração do ser humano ao redor do planeta (MUNIZ, 2010). Um exemplo é o trabalho de FERREIRA et al. (2006) sobre a mistura étnica das subpopulações branca e mulata brasileiras. Eles demostraram que a miscigenação branca foi 89% européia, 6% africana e 5% ameríngea e a mulata, 93% européia e 7% africana. A inclusão dos marcadores do cromossomo X (CrX STR's) na identificação humana começou a partir da década de Embora mais de uma centena de CrX STR s tenha sido descrita, Szibor (2003) lista 55 microssatélites como estando em uso na identificação humana. FILHO (2010) usou os marcadores CrX STR s (DXS8378, DXS9898, DXS7133, GATA31E08, GATA172D05, DXS7423, DXS6809, DXS7132, DXS9902 e DXS6789) para fazer a caracterização genética da população do Distrito Federal. O Cromossomo X apresenta um modo peculiar de herança. Na transmissão paterna, comporta-se como uniparental enquanto que na transmissão materna, como biparental. Esta excentricidade torna-o particularmente útil para determinadas análises no âmbito da genética forense. Outra linha de trabalho que tem se destacado são os marcadores mini-str s. Moléculas de DNA expostas à água e/ou calor, ao longo do tempo, são suscetíveis a degradação, quebrando-se em pedaços menores. Estudos como de WIEGAND (2001) e DIXON (2006) têm demonstrado que é teoricamente previsível supor quais tipos de DNA podem ser recuperados de forma mais eficaz a partir de amostras de DNA degradado, quando os produtos de PCR são feitos de pedaços menores. As taxas de sucesso na recuperação de 5/20

6 informações a partir de amostras de DNA comprometido são melhores com os sistemas de mini-str s quando comparados aos kits de STR convencionais (BUTLER, 2007). 3.3 Uso dos Microssatélites (STR) na Identificação Humana Ao longo do tempo as sociedades humanas vêm empregando diversos métodos para conhecer a filiação entre as pessoas quando se tem dúvidas, especialmente em casos de paternidade. Inicialmente, estabelecia-se a paternidade por meio de métodos antropométricos, mas que foram eliminados devido à subjetividade. Mudou-se, então, para provas a partir de grupos sanguíneos e antígenos eritrocitários. Em seguida, para antígenos leucocitários, proteínas séricas ou enzimas de eritrócitos. Estas análises eram melhores que as anteriores, no entanto não totalmente confiáveis, além de laboriosas e complexas do ponto de vista técnico. Então, apareceram os polimorfismos de comprimentos dos fragmentos de restrição (do inglês, Restriction Fragment length polymorfism RFLP); porém por ser uma técnica com vários passos metodológicos restritivos, seu uso na predição de paternidade era questionável. Por fim, no ano de 1985, JEFFREY et al. descobriram um método de identificação individual que denominaram DNA Fingerprinting ou impressão digital genética, que prometia ser a solução definitiva das diversidades humanas desde a medicina legal, tanto em criminalística como nos testes de paternidade (REY, 2009). Em 1984, nasceu a impressão digital do DNA depois de um experimento chave entre amostras do trio (pai/mãe/filho) de babuíno, foca, vaca, rato e planta de tabaco. Este experimento comparou as amostras e detectou fragmentos variáveis de DNA. Observaram que pai e mãe eram diferentes, porém, o filho era a união de padrões de DNA dos pais. Tal sistema era compatível para todas as outras espécies testadas. Na ocasião, usaram-se marcadores VNTR s para estabelecer as relações familiares. Os STR s substituíram os RFLP s como principal método de identificação genômica (SOUZA, 2010). Os STR s podem ser analisados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase, ou PCR, sendo possível realizar a tipagem do DNA com quantidades mínimas de amostras biológicas (DOLINSKY, 2007; MUNIZ, 2010). Os marcadores STR s foram primeiramente descritos como ferramentas eficazes para testes de identificação humana no início de Necessitou-se de quase uma década para que o CODIS (Combined DNA Index System) do FBI (Federal Bureal of Investigation) selecionasse os 13 marcadores STR s núcleo e os publicasse em novembro de A partir de então, devido ao seu uso no NDNAD (National DNA Database ou banco de dados 6/20

7 nacional) dos EUA bem como em outros bancos de dados da justiça criminal em todo o mundo, os loci STR s passaram a dominar a informação genética humana até os dias de hoje. Nos EUA e no Reino Unido, mais de 5 milhões de perfis de DNA já estão armazenados em bancos de dados na justiça criminal com informações de conjuntos e subconjuntos desses loci. Além disso, quase um milhão de amostras são analisadas anualmente com o núcleo base de loci STR s como parte de investigação de paternidade (BUTLER, 2006). O uso dos microssatélites como marcadores polimórficos de DNA aumentou consideravelmente em número de trabalhos e em organismos analisados. Observa-se seu uso em estudos de mapeamento genético, instabilidade genômica em câncer, genética populacional, análise forense, conservação biológica, antropologia molecular e trabalhos de evolução histórica humana, bem como em análise genética de diversos organismos (BHARGAVA, 2009). Como exemplo de aplicação dessa tecnologia, SIMMS et al. (2008) relatam que o arquipélago das Bahamas foi influenciado por um vasto leque de colonização. No entanto, Bahamas permanecia insuficientemente caracterizada do ponto de vista genético e pouco se conhecia sobre a contribuição de cada grupo para a cadeia de ilhas. O estudo foi realizado analisando-se 15 loci STR autossômicos rotineiramente utilizados em aplicações forenses. E, quando comparado este conjunto com grupos africanos, revelaram perfis genéticos similares às populações do oeste africano e angola (SOUZA, 2010). No Brasil alguns estudos foram realizados usando-se os marcadores autossômicos STR. CALLEGARI-JACQUES et al., (2003) utilizaram os marcadores CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D18S51 e D21S11 com o objetivo de avaliar o grau de contribuição gênica européia, africana e indiana na população brasileira. Foram analisados 1037 indivíduos residentes nas cinco diferentes regiões sóciogeográficas do Brasil. O estudo determinou que o percentual de contribuição européia, como esperado pela história destas populações, era maior no Sul (82%) e menor no Norte (71%). O componente Africano era menor no Sul (11%), enquanto os valores mais elevados foram encontrados no Centro-Oeste e Sudeste (20%). Os valores extremos para a fração de ameríndios foram encontrados nas regiões Sul e Sudeste (8%) e Norte (18%). 3.4 Microssatélites Usados na Esfera Cível Embora o genoma humano contenha milhares de marcadores STR s, apenas um pequeno conjunto de loci base foi selecionado para uso em testes forenses de identificação 7/20

8 humana. O Serviço de Ciência Forense (do inglês, Forensic Science Service FSS) dos EUA começou a se interessar pelos loci STR s e a estudar sua variação na população na década de 90. A Real Polícia Montada Canadense (do inglês, Royal Canadian Mounted Police RCMP) e alguns laboratórios Europeus também contribuíram com os esforços iniciais para tipagem desses STR s. Os primeiros multiplex FSS kit capaz de amplificar múltiplos loci STR simultaneamente aplicados em casos forenses eram formados pelos quatro loci: TH01, VWA, FES/FPS e F13A1. A segunda geração multiplex (SGM) consistia dos seguintes loci: TH01, VWA, FGA, D8S1179, D18S51 e D21S11. O primeiro banco de dados do Reino Unido foi lançado em abril de 1995 e utilizou os loci da SGM acrescido da amelogenina, um teste para tipagem do sexo. A Tabela 1 traz os 13 loci CODIS utilizados nos EUA desde A maior parte da Europa utiliza 10 loci essenciais dos quais oito são do núcleo CODIS (D3S1358, FGA, D8S1179, TH01, VWA, D16S539, D18S51 e D21S11) mais os marcadores D2S1338 e D19S433. Esses loci tornaram-se uma espécie de moeda comum de troca de dados para teste de identidade humana no tratamento de casos forenses, devido à facilidade de uso dos kits comerciais STR (BUTLER, 2006; SOUSA, 2010). Tabela 1: Características dos 13 microssatélites do núcleo base do sistema CODIS. Locus TPOX D3S1358 FGA D5S818 CSF1PO D7S820 D8S1179 TH01 VWA D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 UB [GAAT] [TCTG]. [CTTT] [AGAT] [TAGA] [GATA] [TCTA]. [TCAT] [TCTG]. [TATC] [GATA] [AGAA] [TCTA]. [TCTA] [TCTG] [TCTA] [TCTG]* FA ,2-51, , ,2 LCr 2p25.3 3p q31.3 5q23.2 5q33.1 7q q p p q q q q21.1 Fonte: BUTLER et al. (2006), com adaptações. UB Unidade básica de repetição, FA freqüência alélica, LCr localização cromossômica. * Repetições complexas Na virada do século, novos kits multiplex foram desenvolvidos e eram capazes de detectar os 13 loci do sistema CODIS em uma única reação. Isto se deu em virtude da introdução dos métodos de detecção por fluorescência e do advento dos sequenciadores de DNA. Houve ainda um acréscimo de outros marcadores ao kit base. A Promega Corporation, em 2000, lançou o PowerPlex 16 kit que acrescentou aos 13 loci base a amelogenina e dois loci pentanucleotídios denominado Penta D e Penta E. A Applied Biosystems lançou, em 2001, seu 16plex kit Identifiler que incluiu ao núcleo base a amelogenina e dois loci tetranucleotídeos (D2S1338 e D19S433). A Tabela 2 resume os principais kits STR que se tornaram disponíveis na última década (BUTLER, 2006). 8/20

9 TABELA 2 Resumo dos principais kits comerciais de microssatélites comumente utilizados. Nome dos kits Loci STR s inclusos Probabilidade Aleatória Promega Corporation PowerPlex 1.1 and 1.2 CSF1PO, TPOX, TH01, VWA, D16S539, D13S317, D7S820, D5S x PowerPlex 2.1 D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, VWA, D8S1179, TPOX, FGA, Penta E 3.4 x (Para Hitachi FMBIO) PowerPlex ES FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, SE33, amelogenina 1.3 x PowerPlex 16 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 1.2 x D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, amelogenina PowerPlex 16 BIO CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 1.2 x (Para Hitachi FMBIO) D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, amelogenina Applied Biosystems AmpFlSTR Blue D3S1358, VWA, FGA 1.0 x 10-3 AmpFlSTR Green I TH01, TPOX, CSF1PO, Amelogenina 7.8 x 10-4 AmpFlSTR Cofiler (CO) D3S1358, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820, D16S539, Amelogenin 2.0 x 10-7 AmpFlSTR Profiler Plus (Pro) D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, 2.4 x Amelogenin. AmpFlSTR Profiler Plus ID D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, 2.4 x Amelogenin, (extra unlabeled D8-R primer) AmpFlSTR Profiler D3S1358, VWA, FGA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, Amelogenin. 9.0 x AmpFlSTR SGM Plus (SGM) D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA, 4.5 x Amelogenin. AmpFlSTR Sefiler (SE) FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, 5.1 x SE33, amelogenina AmpFlSTR Identifiler (ID) CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 7.2 x D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, amelogenina. Fonte: BUTLER et al. (2006), com adaptações. *Frequências alélicas utilizadas para os cálculos de probabilidade aleatória (para indivíduos sem parentesco) a partir de dados da população caucasiana dos EUA. Ajustamentos estruturais para subpopulações não foram calculados (isto é, somente foram utilizados p² e 2pq). 3.5 Microssatélites Versos PCR Em 1983, KARY MULLIS et al., desenvolveram a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia de Polimerase). Isso permitiu que pequenas quantidades de DNA fossem amplificadas exponencialmente. Assim, fragmentos curtos de DNA, como os STR s, puderam ser utilizados (SOUZA, 2010). Essa técnica usa a mesma enzima Taq DNA polimerase que participa da replicação do material genético nas células. Essa enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador ou primer) já esteja pareado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese (RUMJANEK, 2001). Após a amplificação, determina-se o número de repetições presentes em cada alelo encontrado no perfil de DNA. Isso é feito medindo-se o comprimento dos fragmentos STR s por meio de eletroforese em gel ou capilar. Cada STR amplificado é marcado com um identificador fluorescente durante a PCR. Assim, ao indicar a coloração e o tempo de migração dos fragmentos em relação ao padrão interno, o tamanho deles pode ser determinado. Instrumentos utilizados nesse tipo de separação são analisadores genéticos como ABI Prism 310 e ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) (BUTLER, 2007). Os kits comerciais oferecem escadas alélicas caracterizáveis pelos sequenciadores. As escadas permitem calibrar, por pares de base (pb), os produtos de PCR ao final da 9/20

10 genotipagem. A Figura 1 mostra a escada alélica do kit Identifiler AmpFlSTR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Este kit contém 205 alelos em 16 loci co-amplificáveis sendo 15 STR s mais a amelogenina. Os tamanhos dos produtos de PCR de 100 a 500 pb para os STR são compatíveis com os fragmentos de DNA degradado encontrados nas cenas de crime. A amplificação de múltiplos loci STR simultaneamente, ou multiplexação, é possível devido à variação dos tamanhos e das emissões fluorescentes dos produtos da PCR. O uso de múltiplos loci permite um alto poder de discriminação em um único teste com pouco consumo de material (1 ng ou menos) (BUTLER, 2007). Figura 1. Painéis separados por cores da escada alélica do kit Identifiler AmpFlSTR de calibração dos STR s. A determinação do genótipo em amostras processadas é realizada pela comparação do tamanho dos alelos em relação ao padrão interno. O pico do padrão GS500, em 250 pb, normalmente não é utilizado devido à migração anômala. Fonte: BUTLER et al. (2006), com adaptações. Os processos baseados em PCR têm diversas vantagens em relação aos de VNTR. Citam-se: método simples e fácil, de resultados rápidos, com capacidade muito superior para amplificar quantidades mínimas de DNA (nanogramas). Por outro lado, há algumas desvantagens: os procedimentos baseados na metodologia de PCR são suscetíveis a erro por contaminação; os loci STR s são menores que os VNTR s, por isso necessitam de um maior número de marcadores para obter o mesmo grau de discriminação; alguns loci amplificados por PCR estão associados a genes funcionais, que podem estar sujeitos à seleção natural e ocasionar diferenças entre os subgrupos populacionais (SOUZA, 2010). 3.6 Parâmetros Estatísticos para Análises de Marcadores Na estrutura populacional mais simples, as uniões ocorrem aleatoriamente. É evidente que a população não se une deste modo. As pessoas escolhem os parceiros de acordo com 10/20

11 atributos físicos e comportamentais como altura e personalidade e não pelos marcadores usados para estudos forenses como os VNTR s e STR s. Usa-se, assim, a união aleatória para se referir à escolha de parceiros independentemente da relevância do genótipo nos loci e da ascendência. As proporções esperadas após uniões aleatórias são chamadas proporções Hardy-Weinberg (HW). Assim, supondo-se que no loco A, 1/10 dos alelos sejam A 1 e 1/25 sejam A 2. Então, 1/10 dos óvulos portam o alelo A 1 e, destes, 1/10 serão fertilizados por um espermatozóide A 1. Após a fertilização, tem-se (1/10)x(1/10) = (1/10) 2 = 1/100 óvulos com o genótipo homozigoto A 1 A 1. Igualmente, tem-se (1/10)x(1/25) = 1/250 óvulos fecundados com o genótipo heterozigoto A 1 A 2. Como A 1 A 2 se equivale à frequência de A 2 A 1, têm-se o dobro: 1/125. O mesmo se aplica ao genótipo homozigoto A 2 A 2 : (1/25)x(1/25) = 1/625 (DUARTE, 2001). Generalizando, se p = 1/10 e q = 1/25, as frequências genotípicas poderão ser escritas como: A 1 A 1 = p 2, A 1 A 2 = 2pq e A 2 A 2 = q 2. Estas proporções estão fundamentadas no binômio de Newton: (p + q)² = p 2 + 2pq + q 2, ou seja, populações com essas proporções genotípicas são consideradas em equilíbrio de HW (THOMPSON, 1993). Afastamentos das proporções HW nas populações ocorrerem por três razões principais. Primeira, os pais podem ser parentes, levando à consanguinidade, o que diminui a proporção dos heterozigotos e aumenta os homozigotos. Segundo, a população pode estar subdividida em grupos raciais (negros, hispânicos, índios americanos, leste-asiáticos, brancos) e terem parceiros com origem comum. Assim, em termos genéticos, compartilham os mesmos ancestrais. A estrutura populacional é, qualitativamente, as da consanguinidade: diminuição de heterozigoto e aumento de homozigoto. Terceira, pessoas com genótipos diferentes podem sobreviver e se reproduzir em graus diferentes (ou seja, há uma seleção). Não será considerada esta possibilidade nesse trabalho; entretanto, os loci base usados na análise forense são escolhidos por serem seletivamente neutros (DUARTE, 2001). Os cálculos forenses são convencionalmente efetuados de duas formas: a probabilidade de uma coincidência aleatória (probabilidade de identidade aleatória) calculada a partir das frequências dos marcadores de DNA em um banco de dados e a razão de verossimilhança (RV). A RV é a razão entre a probabilidade de se obter uma identidade de perfis genéticos, quando o DNA na amostra da prova e do suspeito vierem da mesma pessoa, e a probabilidade de uma identidade se os DNA s vierem de pessoas diferentes. Se as amostras vêm da mesma pessoa a probabilidade de identidade é um, logo RV é a recíproca da probabilidade de identidade aleatória. Uma RV de significa que é vezes mais provável obter uma identidade dos perfis se as amostras de DNA vierem da mesma pessoa do 11/20

12 que se elas se originaram de dois indivíduos quaisquer aleatoriamente escolhidos da população (DUARTE, 2001). A Teoria de Bayes procura responder ao questionamento: qual é a probabilidade de que a prova e a amostra do suspeito venham da mesma pessoa? Para isso necessita-se de presumir um valor para a probabilidade a priori de que duas amostras tenham uma origem comum, mas que a probabilidade de tal evento estimada venha a partir de provas que não a do DNA. O princípio é melhor compreendido em termos de chance (odds). Define-se chance pela relação entre a probabilidade de que um evento ocorra e a probabilidade de que não ocorra: chance = prob/(1 prob); se a probabilidade for 2/3, a chance a favor é 2/1, ou melhor, de 2:1. Por outro lado, a chance final (a posteriori) de que o suspeito e a prova vieram da mesma pessoa é definida como: Chance a posteriori = Chance a priori x RV. Supondo-se que RV seja um milhão, como quando há inclusão de prova de DNA. Se a chance a priori for de 1:100, a chance a posteriori será de :1 (DUARTE, 2001). A relação entre odds posteriores e anteriores é rotineiramente usada na análise de paternidade. Odds pode ser convertido em probabilidade pela relação Prob = Odds/(odds + 1), pois Odds = Prob(1 Prob). Assim RV, que não é uma probabilidade, pode ser usada para obter uma probabilidade. Se um suposto pai não foi excluído por grupo sanguíneo, enzima e prova do DNA, um índice de paternidade é calculado. O índice de paternidade (PI) é uma razão de verossimilhança. Essa RV consiste na probabilidade de combinação do perfil mãefilho-pai, se o suposto pai for o pai verdadeiro, dividido pela probabilidade desta combinação, se um homem aleatoriamente escolhido for o pai. Rotineiramente, os cálculos fazem uso de um banco de dados ou bancos de dados adequados à(s) raça(s) das pessoas envolvidas. Para tanto, partindo-se da relação Prob = Odds(Odds + 1), considerando a probabilidade a priori de 1/2 e PI = Odds, chegamos à relação: Prob = PI/(PI+1). Esta probabilidade a posteriori é chamada de probabilidade de paternidade PP (DUARTE,2001). Por exemplo, considere o PI = 335,42, tem-se um PP = 335,42/(336,42) = 0,9970 ou 99,70% (JACEWICZ, 2004). Na identificação humana são utilizados normalmente entre treze e vinte marcadores STR s. Nos estudos de paternidade para cada locus haverá coincidência entre um dos alelos da criança com um dos presentes em sua mãe e o outro alelo deverá estar presente no pai e recebe o nome de alelo paterno-obrigatório. Segundo a Sociedade Brasileira de Medicina Legal, a exclusão de paternidade é declarada quando o suposto pai não apresenta três ou mais dos alelos paterno-obrigatórios definidos para o investigando (CARVALHO, 2009). 12/20

13 Salienta-se que, atualmente, há vários programas computacionais desenvolvidos para simplificar os cálculos de RV dos testes de paternidade e determinações de parentesco. Os programas são construídos com base nos conceitos do Teorema de Bayes, probabilidade condicional e análise de vínculo genético (FUNG, 2003). 3.7 Poder de Exclusão O conceito de poder de exclusão foi inicialmente descrito por FISHER em Podese ilustrar o poder de exclusão médio considerando as seguintes proposições: A probabilidade de que duas pessoas escolhidas aleatoriamente tenham um certo genótipo é o quadrado de sua frequência genotípica na população. A probabilidade de que duas pessoas aleatoriamente escolhidas tenham o mesmo genótipo não especificado é a soma dos quadrados das frequências de todos os genótipos. Baseando-se na Tabela 3, que traz dados do locus DQA (genes do complexo de histocompatibilidade), faz-se a soma dos quadrados das frequências esperadas dos genótipos para a população negra como: 0,023² + 0,079² ,092² = 0,078. Efetuando-se o mesmo cálculo para a população branca, o valor gerado é 0,063. Assim, a média das frequências genotípicas é cerca de 0,070. Portanto, o poder de exclusão de que a probabilidade de duas pessoas não terem o mesmo genótipo é dado por: 1 0,070 = 0,94 ou 94% (DUARTE, 2001). Tabela 3. Frequência (%) dos genótipos DQA para populações negras e brancas. Ge 1,1/1,1 1,1/1,2 1,1/1,3 1,1/2 1,1/3 1,1/4 1,2/1,2 1,2/1,3 1,2/2 1,2/3 1,2/4 1,3/1,3 1,3/2 1,3/3 1,3/4 2/2 2/3 2/4 3/3 3/4 4/4 THo THe Ne 2,3 7,9 1,4 3,6 3,5 9,1 6,9 2,4 6,4 6,2 16 0,2 1,1 1,1 2,7 1,5 2,9 7,4 1,4 7,2 9,2 21,5 78,9 Br 1,9 5,4 2,3 3 5,5 7,4 3,9 3,4 4,3 7,9 10,7 0,7 1,9 3,4 4,6 1,2 4,4 5,9 4 10, Dados obtidos da obra de Moura Duarte, 2001, p. 105, com adaptações. Genótipos homozigoto em negrito. Ge genótipos, Ne negros, Br brancos, THo total de homozigoto e THe - total de heterozigoto. DQA genes pertencentes ao lócus do complexo de histocompatibilidade. No entanto, se houver n loci, e a soma dos quadrados das frequências dos genótipos no loco i for P i, então o poder de exclusão acumulado será 1 (P 1.P 2...P n ). Por exemplo, se cinco loci com o poder de DQA for usado, dará um poder de exclusão de: 1 (0,070) 5 = 0, Percentualmente é de 99,9998% (DUARTE, 2001). 3.8 Viabilidade dos STR s na Investigação de Paternidade Os testes de vínculo biológico são realizados com a finalidade de confirmar ou excluir uma relação de parentesco, normalmente de filiação. A identificação individual consiste na determinação de um perfil genético de DNA, estabelecido pela caracterização dos vários microssatélites (SANTOS, 2010). Esses marcadores STR s são comercializados na forma de 13/20

14 kits que fornecem uma pré-mistura de oligonucleotídios, padrões, enzima, tampão enzimático e dntp s. Os kits estabelecem perfis de STR e fornecem resultados por meio de um conjunto uniforme de loci STR base. Isso torna possível a partilha nacional e internacional de perfis de DNA. Eles são preferidos pela maioria dos laboratórios forenses comparados aos ensaios convencionais. Embora caros, os kits ajudam a simplificar, a padronizar procedimentos e a eliminar o ônus do controle de qualidade dos componentes da PCR (BUTLER, 2007). Apesar da praticidade dos kits e da automação laboratorial, deve-se ter atenção às frequências alélicas nas populações. Sabe-se que diferentes populações apresentam alelos em frequências diferentes e algumas vezes únicos; por isso, necessita-se estudar os diferentes marcadores na população para saber quais são os alelos presentes e em que frequência, para definir quais são os melhores marcadores a serem utilizados (CARVALHO, 2009). Baseando-se nisso, um exemplo esclarecedor da viabilidade dos marcadores STR s é o estudo de RODRIGUES et al., (2007) feito na população de Belém/PA. Eles determinaram as frequências alélicas e os parâmetros estatísticos para os 13 loci base CODIS. Observaram que praticamente todos os loci analisados atingiram o equilíbrio de HW, com exceção de um. Os parâmetros investigados mostraram valores médios elevados, tais como, poder de discriminação (DP = 93%), poder de exclusão (PE = 62%) e heterozigose observada (Ho = 79%). Dessa forma, o poder de discriminação e a probabilidade de exclusão para os 13 loci STR s foram 99, % e 99,9998%, respectivamente. Portanto, os 13 marcadores são adequados para as análises forenses e testes de paternidade para a população amazonense. A busca pela verdade em um processo judicial impede que o reconhecimento ou não da filiação seja baseado em suposições ou presunções, sendo o exame de DNA um meio capaz de conferir certeza praticamente absoluta (99,99%) da filiação. Assim, a prova genética obtida pelo teste baseado em marcadores de DNA é uma das provas mais eletivas, pelo grau de eficácia e confiabilidade que assegura (SILVA, 2008). 3.9 Legislação Envolvendo Paternidade Em termos de processos cíveis de parentesco, existem os seguintes tipos de ações que procuram determinar vínculo genético: investigações de paternidade ou maternidade e negatórias de paternidade ou maternidade (FIDA, 2009). Segundo FILHO (2007, p.67): investigação de paternidade é, antes de tudo, uma ação de estado, ou seja, é a posição jurídica determinada, donde decorrem certos direitos e obrigações. Existem três derivações de estado: individual, político e familiar. O primeiro é o 14/20

15 modo de ser da pessoa, de sua constituição orgânica: idade, sexo e saúde. Já o estado político é a qualidade jurídica, ou seja, é a nacionalidade, a naturalidade e a cidadania. Mas, o estado que interessa à Ação de Investigação de Paternidade é o familiar que determina a posição ocupada pela pessoa no seio da família: vínculo conjugal, parentesco por consanguinidade e por afinidade. Assim, o estado das pessoas pode ser: casada, solteira, viúva, separada, divorciada, parentes (consanguíneos e afins) ou, ainda, deter o estado de filiação adotiva. Contudo, a Investigação de Paternidade é, por outro lado, uma ação declaratória; ela tem por escopo a declaração judicial de que o autor é filho do réu. Proferida a sentença em favor do filho, a sua posição fica definida, é filho natural reconhecido; tem direito ao uso do patronímico do pai; de ser alimentado e educado por ele e de suceder-lhe. Este é, talvez, o maior atributo da filiação: ser o herdeiro de seu pai. Ademais, igualmente de estado é a Ação Negatória de Paternidade, cuja sentença é constitutiva negativa ou desconstitutiva, na medida em que extingue a relação jurídica de filiação estabelecida (FILHO, 2007). A Constituição Federal, no 6º do art. 227, assegura a todos os filhos, havidos ou não da relação de casamento, ou por adoção, os mesmos direitos e qualificações, proibidas quaisquer designações discriminatórias relativas à filiação. O fundamento jurídico da ação de investigação encontra-se no art. 27 da Lei nº 8.069, de julho de 1990, combinado com as disposições do art. 2º da lei de 29 de dezembro de 1992; esses dispositivos estabelecem a legitimação ativa para promover a ação de investigação. A legitimação é do filho que, nesse momento, detém o poder de agir, e encontrase respaldada pelo art do Código Civil. Se o filho não exercer seu direito e falecer, depois da maioridade, perece o direito! Seus herdeiros, se os tiver, não poderão acionar, fato que não sucede, se a ação já tiver sido iniciada pelo de cujus. Essa ação é, por isso, personalíssima. Já a legitimidade para propor a ação negatória, além do pai presumido, compete ao pai biológico, à mãe e a quaisquer pessoas ligadas ao filho por parentesco, sucessão ou obrigação alimentar. Esta ação é própria e personalíssima (FILHO, 2007). Salienta-se que o art. 2º da lei nº 8.560/1992 teve a introdução do art. 2º-A pela Lei nº de julho de Este novo artigo prevê que, na ação de investigação de paternidade, todos os meios legais, bem como os moralmente legítimos, serão hábeis para provar a verdade dos fatos. Com isso, ele traz, em seu parágrafo único, que a recusa do réu em se submeter ao exame de código genético DNA gerará a presunção de paternidade, a ser apreciada em conjunto com o contexto probatório. 15/20

16 A prova judiciária civil está prevista no Capítulo VI das provas do Código de Processo Civil, a partir do art. 332 até o art Há várias definições doutrinárias sobre prova judiciária. Segundo BLIKSTEIN (2008, p.59): provar resume-se na realização de uma tarefa necessária e obrigatória, para constituir estado de convencimento no espírito do juiz, este na condição de órgão julgador, a respeito de um fato alegado e sua efetiva ocorrência, tal como foi descrito. Prova judiciária, por seu turno, é o meio demonstrativo de veracidade entre o fato material (fato constitutivo do direito) e o fundamento jurídico do pedido. A nível federal, a Lei nº 1.060, de 5 de fevereiro de 1950, estabelece as normas para a concessão de assistência judiciária gratuita aos necessitados. A Lei nº , de 6 de dezembro de 2001, introduziu ao art. 3º da lei anterior o VI. Este parágrafo prevê a isenção das despesas com a realização do exame de código genético DNA que for requisitado pela autoridade judiciária nas ações de investigação de paternidade ou maternidade. No âmbito do Distrito Federal, a Lei nº 1.097, de 4 de junho de 1996, trata da realização de exames de DNA para instruir processos de reconhecimento de paternidade e maternidade. Ela assegura, em seu art. 3º, a gratuidade dos exames de DNA às pessoas reconhecidamente necessitadas, como previsto na lei 1.060/1950. O Decreto nº , de junho de 1997, regulamentou a Lei 1.097/1996. Dispôs no art. 2º que os exames de DNA serão realizados pela Divisão de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal (DPDNA/PCDF), atualmente conhecido como Instituto de Pesquisa de DNA Forense (IPDNA). Caso os envolvidos nos exames de DNA não sejam amparados pelo benefício da gratuidade, deverão restituir aos cofres da PCDF a quantia de R$ 1.674,00, a título de taxas de serviços prestados (PCDF, 2011). 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS A contribuição da ciência e tecnologia para o meio forense nas últimas décadas não tem comparativos na história da humanidade. A participação da biologia molecular para o progresso na capacidade de identificação humana é incontestável. Este avanço se deve à percepção e aplicação do polimorfismo presente no DNA de cada ser vivo. A descoberta dos marcadores moleculares, em especial os microssatélites, foi um marco na capacidade de individualização biológica. Os STR s detêm os requisitos essenciais de validação dos métodos de identificação biológica, pois suas características técnicas de evidenciação da unicidade e da imutabilidade (perenidade) do DNA são únicas e inigualáveis. Aliadas a estas, eles possuem ainda os requisitos técnicos de classificabilidade e praticidade em virtude da automatização 16/20

17 dos processos laboratoriais e do avanço da informática. Esse progresso foi possível pelos aperfeiçoamentos dos métodos de PCR, dos sequenciadores e pelo surgimento dos kits multiplex que juntos produzem perfis genéticos a partir de nanogramas de DNA, em pouco tempo, totalmente informatizado e, muitas vezes, em uma única corrida reacional. Daí ser o conjunto base de STR, que hoje está em torno de 18 marcadores, considerado uma moeda de troca de informações gênicas no meio científico. Em termos judiciários, o laudo pericial genético possui peso decisório, considerado por alguns juristas como a rainha de todas as provas devido ao grau de confiança conferido a ele. A técnica da PCR tem muitas vantagens, sendo decisiva para a comunidade científica e judiciária na revelação dos perfis de STR s entre indivíduos. Entretanto, devido à sensibilidade é muito suscetível a contaminação pelos manipuladores e fontes gênicas alheias. Os procedimentos baseados nessa técnica necessitam de uma rotina de boas práticas laboratoriais que é fundamental para a qualidade dos laudos periciais. Esse quesito tem sido argumento forte de defesa nos processos judiciais. No Brasil não há legislações específicas que regulamentam as atividades nos laboratórios, muito menos fiscalização para averiguar a qualidade dos laudos. Seria interessante, no Brasil, se catalogar os vários estudos nas diversas regiões brasileiras para se ter a percepção exata das frequências dos marcadores STR s e se todas as subpopulações regionais estão cobertas. Nos trabalhos analisados, os resultados dos 13 loci CODIS foram comparados com outras regiões e muitos desses marcadores apresentaram diferenças significativas. Por fim, vislumbrando o intuito de modernização e de vanguarda do judiciário, à semelhança dos julgamentos on line e dos processos digitais, considerando o avanço tecnológico, a redução da complexidade dos exames de vínculo genético e a redução do valor dos insumos para produção dos perfis de DNA, o judiciário brasileiro poderia ser o provedor dos próprios laudos periciais genéticos para a esfera cível. Não há, a princípio, impedimentos legais. Esse salto resolveria um problema procedimental recorrente de morosidade processual, a ausência insistente do suposto pai na hora da coleta de material biológico nos laboratórios. Com um laboratório institucional, o trio (mãe-filho-pai) já sairia da audiência e seria conduzido a um posto de coleta. Isso possibilitaria julgamentos mais céleres. Além desse ganho, os tribunais judiciários teriam um corpo qualificado de profissionais institucionais capazes de assistir os juízes de forma imparcial, rápida e permanente. 17/20

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