Como obter uma planta transgénica à boleia do Agrobacterium tumefaciens
Participantes Adilson Vaz (Lisboa) Ana Rita Araújo (Aveiro) Ana Sofia Martins (Vila Real) André Pereira (Lisboa) Entidade: Universidade de Trás-os-Montes e Alto-Douro Local de Estágio: Dep. de Genética e Biotecnologia Coordenadora de Estágio: Ana Lúcia L Pinto e Sintra Período de estágio: 18-28 de Julho de 2006
Meios de Cultura Material vegetal utilizado Estirpes de Agrobacterium tumefaciens Co-cultura com A. tumefaciens Detecção histoquímica da transferência de genes Análise molecular Extracção de DNA PCR Electroforese
Meios de cultura A composição do meio de cultura varia com o material vegetal e com os objectivos da cultura Os meios de cultura para explantes vegetais contém geralmente: Macro e micro nutrientes Vitaminas Reguladores de crescimento Fonte de carbono (geralmente sacarose) Agente polimerizador (geralmente agar) Existe uma grande variedade de meios de cultura liofilizados disponíveis comercialmente como o meio de Nitsch e Nitsch (NN), o qual se utilizou.
Material vegetal utilizado Utilizaram-se plantas de tabaco estabelecido in vitro Em condições de assepsia, obtivemos discos foliares com um furador, os quais se cultivaram em meio NN suplementado com uma citocinina (BAP)
Estirpes de Agrobacterium Existem vários tipos de estirpes recombinantes de Agrobacterium tumefaciens No nosso estágio utilizámos: A. tumefaciens EHA 105 p35sgusint A. tumefaciens EHA 101 p35sgus
Plasmídeos das estirpes utilizadas A. tumefaciens EHA 105 p35sgusint Gene de selecção Gene repórter RB NOS-Pro NPTII (Kan R ) NOS-Ter CaMV 35S-Pro Intrão vegetal GUS (β-glucuronidase) CaMV-Ter LB A. tumefaciens EHA 101 p35sgus Gene de selecção Gene repórter A ausência ou presença do intrão vegetal na região codificante determina a ocorrência ou não de expressão do gus nas bactérias RB NOS-Pro NPTII (Kan R ) NOS-Ter CaMV 35S-Pro GUS (β-glucuronidase) CaMV-Ter LB
Transferência de genes mediada pelo A. tumefaciens (co-cultura) Discos foliares Sem co-cultura NN+BAP Co-cultura NN+BAP (cultura com Agrobacterium) Sem co-cultura NN+BAP (controlo do processo da transformação) Meio não selectivo NN+BAP+Cef (eliminação da bactéria e controlo da regeneração) Meio selectivo NN+BAP+Cef+Kan (eliminação da bactéria e regeneração de transformantes)
Cortam-se discos de folhas, os quais se inserem em meio NN em condições de assepsia.
Estirpes de Agrobacterium Existem vários tipos de estirpes recombinantes de Agrobacterium tumefaciens No nosso estágio utilizámos: A. tumefaciens EHA 105 p35sgusint A. tumefaciens EHA 101 p35sgus
Detecção Histoquímica A expressão do gene gusa nos discos foliares, através da actividade da β-glucuronidase, é detectada através de coloração histoquímica. Dá origem a um precipitado de cor azul indigo no local de clivagem, o que leva à identificação de células e tecidos transformados.
Detecção Histoquímica A expressão do gene gusa nos discos foliares no final da co-cultura (negativa no controlo; positiva no material submetido a co-cultura) A solução onde os discos foram colocados apresentava, no final do processo e apenas para o p35sgus, uma coloração azul indigo, indicador da presença de bactérias, devido à ausência do intrão no GUS
Devido ao curto período do estágio, utilizou-se material idêntico previamente preparado, permitindo eliminar o factor tempo de crescimento/resposta do material.
Detecção Histoquímica O aspecto da expressão do gene gusa nos rebentos induzidos nos discos, após 6 semanas de cultura. O controlo não apresenta marcação, como esperado O material NN+Cef deveria apresentar marcação O material NN+Cef+Km apresenta marcação, indicadora de transferência do plasmídeo
Extracção de DNA genómico (mini-extracção com CTAB) O cálculo da quantidade de DNA extraído foi efectuado por espectrofotometria no Nanodrop
PCR (Reacção em cadeia da polimerase) A análise molecular preliminar dos genes transferidos foi feita por PCR Para amplificar o material genético, foi necessário Primers (especificos para a detecção do NPTII e GUS Taq DNA Polimerase Solução tampão Água MgCl2 Mistura de dntp Termociclador
PCR (Reacção em cadeia da polimerase)
Electroforese dos produtos de PCR (preparando o gel de agarose)
Exemplo dos resultados do PCR para detecção dos genes transferidos para rebentos de tabaco Produtos de amplificação de rebentos de tabaco putativamente transgénicos, com os primers para o gene gus. poço 1: marcador molecular, graduado em fracções de 250 bp poço 2: controlo negativo dos iniciadores para o gene gus poço 3: controlo positivo com DNA do plasmídio p35sgusint poço 4: controlo com rebento de tabaco não transformado poço 5-7: produtos de PCR de rebentos induzidos em folhas co-cultivadas com EHA 105 p35sgusint.
Conclusão Observámos e executámos os passos principais da transformação de discos foliares de tabaco com estirpes recombinantes de Agrobacterium tumefaciens Acompanhámos algumas fases importantes da regeneração de transformantes de tabaco Executámos as técnicas de análise molecular preliminar para avaliação do estado transgénico de rebentos regenerados a partir de discos foliares co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens