NOTICE of CHANGE dated 22/02/16

ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, 185 10149 Torino ITALY Uffici: Tel. +39-011 976 191 Fax +39-011 936 76 11 E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: www.elitechgroup.com NOTICE of CHANGE dated 22/02/16 IMPORTANT COMMUNICATION FOR THE USERS OF PRODUCT: «HVS1 Q - PCR Alert AmpliMIX» code Due to new product packaging, the Instruction for Use Manual (IFU) of SCH mrts031m reported following changes: The product kit (code ) now includes the product «HSV1 Q - PCR Alert AmpliPROBE» (previously identified by code RTS031-P). The external aluminum envelope was removed from product packaging. For this reason the packaging of the product (code RTS031- M) is made by a rigid plastic box containing all reagents tubes. All changes are reported in detail in the enclosed Instructions for Use (IFU). The product changes do not affect in any way the formulation of its reagents, their protocol of use and performance analytics. For this reason, the present IFU may also be used in association with the previous version of the product. PLEASE NOTE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT Notice of Change nr. SCH mrts031m_en, 22/02/16 Page 1/1

ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO KIT pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 3 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 3 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 5 PROCEDIMENTO pág. 6 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 13 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 14 BIBLIOGRAFIA pág. 16 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 17 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 18 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, 185 10149 Torino ITALY Escritórios: Tel. +39-011 976 191 Fax +39-011 936 76 11 E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: www.elitechgroup.com -20 C O produto é parte de um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e a dosagem do DNA do Herpes vírus humano de Simplex do tipo 1 (HSV1) em amostras de DNA extraído dos tampões de lesões mucocutâneas e do plasma colhido em EDTA. O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e na monitorização da infecção da HSV1. PRINCÍPIO DO TESTE O teste prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time). Em cada pocinho se efectua uma reacção de amplificação específica para uma região do gene codificante a glicoproteína D (gpd) de HSV1 e para uma região do gene humano codificante a beta- Globina (controlo interno de idoneidade da amostra) utilizando o DNA extraído das amostras em exame. Uma sonda específica para HSV1 marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para HSV1. Outra sonda específica para o controlo interno marcada com o fluoróforo VIC é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o controlo interno. A emissão da fluorescência aumenta com o aumentar dos produtos específicos da reacção de amplificação e é misturada e registrada pelo aparelho. A elaboração dos dados permite determinar a presença e a titulação do DNA de HSV1 na amostra de partida. A estandardização do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems da série 7000. DESCRIÇÃO DO KIT O kit fornece dois dos três reagentes necessários para a recuperação da mistura de reacção e completar a execução do teste: HSV1 AmpliMIX Mistura de oligonucleotídeos primers AmpliMIX para amplificação real time em solução estabilizada, previamente dividida em quatro tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. HSV1 AmpliPROBE Mistura de sondas fluorescentes AmpliPROBE para amplificação real time em solução estabilizada; previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. Os oligonucleotídeos primers e a sonda para HSV1 (marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada do grupo MGB-NFQ), são específicos para uma região do gene que codifica a glicoproteína D (gpd) de HSV1 (região US6). Os oligonucleotídeos primers e a sonda para controlo interno de idoneidade da amostra (marcada com o fluoróforo VIC e bloqueada do grupo MGB-NFQ), são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano da beta-globina. O kit permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO KIT Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem HSV1 AmpliMIX HSV1 AmpliPROBE mistura de oligonucleotídeos primers Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB- NFQ e com VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl 4 x 110 µl Oligonucleotídeos, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Triton X-100 Oligonucleotídeos fluorescentes, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Triton X-100 - - SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 1/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 2/19

MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em nitrílica ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de mesa (12.000-14.000 RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, 50-200 µl, 200-1000 µl). - Água de grau molecular para biologia. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal - cycler para real time). OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, el control positivo de extracción, os reagentes optimizados para a amplificação, el controlo positivo de amplificação ou o DNA standard a quantidade reconhecida não estão incluídos neste kit. Para realizar esta fase analítica é necessário a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.: «CPE - Internal Control» (código CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico para extracções do DNA das amostras não celulares; «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time; No caso em que seja solicitado um resultado qualitativo da análise (pesquisa do DNA de HSV1): «HSV1 / HSV2 - Positive Control» (código CTR03), controlo positivo de DNA plasmídico; No caso em que seja solicitado um resultado quantitativo da análise (dosagem do DNA de HSV1): «HSV1 - PCR Standard» (código STD031), DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. Para a extração manual do DNA das amostras a analisar, é necessário a utilização o seguinte produto: «EXTRAgen» (código EXTG01, ELITechGroup S.p.A.), kit de extracção dos ácidos nucléicos das amostras não celulares. Para a extração automática do DNA das amostras a analisar, é necessário a utilização dos seguintes produtos: NucliSENS easymag Reagents (biomérieux SA, códigos 280130, 280131, 280132, 280133, 280134, 280135), kit de extracção dos ácidos nucléicos de amostras biológicas, com o instrumento NucliSENS easymag (biomérieux SA, código 200111). Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, é necessário a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, é necessário a utilização do produto genérico Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com pocinhos de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3 % pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 3/19 Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados errados, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análises. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes Os tubos que contenham o AmpliMIX e o AmpliPROBE são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 4/19

AMOSTRAS E CONTROLOS PROCEDIMENTO Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extraído das seguintes amostras biológicas: tampões de lesões mucocutâneas e do plasma colhido em EDTA. Tampões de lesões mucocutâneas Os tampões de lesões mucocutâneas para a extracção do DNA devem ser colhidos segundo as indicações do laboratório, colocadas em meio de transporte para culturas celulares ou Solução fisiológica estéril ou PBS estéril, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas ou conservadas congeladas a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Aconselha-se subdividir em mais alíquotas as amostras para conservar congeladas de modo a não submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. As instruções para o eventual pré-tratamento da amostra clínica e para a extracção do DNA estão contidas no Manual de instruções para o uso de «EXTRAgen». Plasma colhido em EDTA O plasma colhido em EDTA deve ser colhido segundo as indicações do laboratório, transportado a +2º / +8ºC e conservado a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas ou conservado congelado a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Aconselha-se subdividir em mais alíquotas as amostras para conservar congeladas de modo a não submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. As instruções para o eventual pré-tratamento da amostra clínica e para a extracção do DNA estão contidas no Manual de instruções para o uso de «EXTRAgen» ou do instrumento «NucliSENS easymag». Quando se realiza a extracção do DNA de plasma com o instrumento «NucliSENS easymag» utilizar o protocolo de extracção Generic 2.0.1 com um volume de 500 µl de amostra e com 55 µl de tampão de eluição. Adicionar uma quantidade de 5 µl de CPE para cada amostra a ser extraído após a adição do reagente NucliSENS easymag Magnetic Silica. Substâncias interferentes O DNA extraído da amostra de partida não deve conter heparina, hemoglobina, dextrano, Ficoll, etanol ou 2-propanol para evitar fenómenos de inibição e a aparição de frequentes resultados não válidos. Quantidade de DNA genómico humano elevadas no DNA extraído da amostra podem inibir a reação de amplificação. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção de controlo negativo e uma reacção de controlo positivo. Para o controlo negativo utilizar água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controlo positivo utilizar o produto «HSV1 / HSV2 - Positive Control» ou o produto «HSV1 Q - PCR Standard». Controlos de qualidade É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 5/19 Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar a sessão é necessário: - referindo-se à documentação do equipamento, ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantitation"; - referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para HSV1 com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamálo "HSV1 ; - referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para a beta- Globina com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CI ; - referindo-se à documentação do equipamento, para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar o "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação, standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos pocinhos da mistura de reação e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA nas amostras de partida é necessário preparar uma série de reacções com o Q - PCR Standard (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 11 amostras. C1 C9 C2 C10 C3 C11 C4 CN C5 10 2 C6 10 3 C7 10 4 C8 10 5 Significado: C1 - C11: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; 10 2 : Standard 10 2 cópias; 10 3 : Standard 10 3 cópias; 10 4 : Standard 10 4 cópias; 10 5 : Standard 10 5 cópias. - Referindo-se à documentação do equipamento, programar no thermal cycler os parâmetros do ciclo térmico com 45 ciclos e um volume de reação de 25 µl. Para equipamento Applied Biosystems da série 7000 escolher a opção "9600 emulation". Ciclo térmico de amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 mín. Desnaturação inicial 95 C 10 mín. 45 ciclos 95 C 15 seg. 60 C 1 mín. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 6/19

Caso se utilize um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar a sessão, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification" e programar Run mode: Fast 7500 ; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para HSV1 com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "HSV1"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o controlo interno com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar (Well Inspector) os "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação ou standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos pocinhos da mistura de reação e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA na amostra de partida é necessário preparar uma série de reacções com os Q - PCR Standard (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. A modalidade de organização de uma análise quantitativa de 12 amostras é ilustrada como exemplo na secção anterior relativa ao procedimento para o instrumento 7300 Real Time PCR System. Referindo-se à documentação do instrumento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico: - acrescentar na fase de amplificação a passagem de extensão em 72 C (Add Step); Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada na passagem de hibridação em 60 C. - modificar os tempos como indicado na tabela a seguir; - programar um número de ciclos igual a 45; - programar o valor de volume de reação igual a 30 µl; Ciclo térmico Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 95 C 15 seg. 60 C (aquisição da fluorescência) 45 seg. 72 C 15 seg. Preparação da amplificação (Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Centrifugar os tubos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar os tubos de HSV1 AmpliMIX necessários para a sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reacções. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar um número de tubos de HSV1 AmpliPROBE iguais aos dos tubos de HSV1 AmpliMIX. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de HSV1 AmpliMIX. Escrever com tinta indelével "HSV1" e a data na etiqueta dos tubos. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar o tubo de HSV1 / HSV2 - Positive Control ou os tubos de HSV1 Q - PCR Standard. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los por 5 segundos para reconduzir o conteúdo ao fundo e mantê-los em gelo; - retirar a Amplification microplate que será utilizada na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos pocinhos. 1. Transferir 100 µl de HSV1 AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 2. Transferir 100 µl de HSV1 AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 3. Misturar por 5 segundos com o vortex a baixa velocidade, evitando produzir espuma. 4. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo. 5. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µl da mistura de reacção assim obtida nos pocinhos da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20º C por um máximo de um mês no tubo "HSV1". Congelar e descongelar a mistura de reacção SOMENTE UMA VEZ. 6. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 5 µl de DNA extraído da primeira amostra no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, proceder igualmente com todos os outros DNA extraídos. 7. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de agua de grau molecular para biologia (não fornecida no kit) no pocinho da Amplification microplate do controlo negativo de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. 8. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reação, 5 µl de HSV1 / HSV2 - Positive Control no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Nota: Quando este produto é usado para a quantificação do DNA do HSV1. transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reação, 5 µl de HSV1 Q - PCR Standard 10 2 cópias no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Proceder do mesmo modo com os HSV1 Q - PCR Standard (10 3, 10 4, 10 5 cópias). 9. Fechar cuidadosamente a Amplification microplate com a Amplification Sealing Sheet. 10. Transferir a Amplification microplate no thermal - cycler para real time na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação e iniciar o ciclo térmico de amplificação salvando a configuração da sessão com uma identificação única e reconhecível (p. ex. "ano-mês-dia-hsv1- EGSpA"). Nota: Ao término do ciclo térmico a Microplaca de amplificação com os produtos de reacção deve ser removida do instrumento e eliminada para não gerar contaminações ambientais. Jamais levantar a Amplification Sealing Sheet da Amplification microplate de modo a evitar a saída dos produtos de reacção. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 7/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 8/19

Análise qualitativa dos resultados Os valores registrados da fluorescência emitida pela sonda específica para HSV1 (detector FAM "HSV1") e pela sonda específica para o Controlo Interno (detector VIC "CI") nas reacções de amplificação devem ser analisadas com o software do equipamento. Antes de iniciar a análise, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - programar manualmente (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15; Nota: No caso de uma amostra positiva a alta titulação de HSV1, a fluorescência FAM da sonda específica para HSV1 pode começar a crescer antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluorescência FAM começar a crescer. Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "HSV1" a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,1. Caso tenha sido utilizado um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "HSV1" a 0,1; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,05. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reacção de amplificação e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para determinar o Ciclo Limiar (Threshold cycle, Ct), o ciclo em que foi alcançado o valor Limiar de fluorescência. Na reacção de amplificação com o HSV1 / HSV2 - Positive Control*, o valor de Ct para HSV1 é utilizado para convalidar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: HSV1 / HSV2 - Positive Control detector FAM HSV1 Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 25 POSITIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do HSV1 / HSV2 - Positive Control é Ct > 25 ou Ct Não determinado (Undetermined) para HSV1, não foi detectada correctamente a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (deslocamento incorrecto da mistura de reacção ou do controlo positivo, degradação da mistura de reacção ou do controlo positivo, programação incorrecta da posição do controlo positivo, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. *Nota: Quando este produto é utilizado para a dosagem do DNA de HSV1, no lugar da reacção com o HSV1 / HSV2 - Positive Control foi preparada a série de reacções com os HSV1 Q - PCR Standard. Neste caso para confirmar a amplificação e a detecção deve-se tomar como referência a reacção de amplificação do HSV1 Q - PCR Standard 10 5. Na reacção de amplificação do Controlo negativo, o valor de Ct para HSV1 é utilizado para convalidar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Reacção Controlo negativo detector FAM "HSV1" Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct Não determinado NEGATIVO CORRECTA Nas reacções de amplificação de cada amostra, os valores de Ct para HSV1 são utilizados para detectar a presença de DNA branco, enquanto os valores de Ct para o Controlo Interno são utilizados para confirmar a extracção, a amplificação e a detecção. Nota: Verificar com o software do equipamento (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) que o Ct esteja determinado por um rápido e regular aumento dos valores de fluorescência e não por fenómenos de pico ou aumento gradual do sinal de fundo. Este kit está em grau de detectar uma quantidade mínima de 10 cópias de DNA do gene da gpd de HSV1 para reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção (limite de detecção do produto, veja parágrafo nas Características da performance). Os resultados relativos para cada amostra são utilizados para a busca de HSV1, como descrito na tabela seguinte: detector FAM HSV1 Não determinado Determinado Ciclo limiar da amostra detector VIC CI Ct > 35 ou Não determinado Idoneidade da amostra Resultado do teste DNA de HSV1 não idôneo não válido - Ct 35 idôneo válido, negativo Ct > 35 ou Não determinado NÃO REVELADO Idôneo* válido, positivo PRESENTE Ct 35 idôneo válido, positivo PRESENTE Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para HSV1 e Ct > 35 ou Ct Não determinado para o Controlo Interno, não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do Controlo Interno. Neste caso verificaram-se problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (degradação do DNA da amostra, amostra com um número insuficiente de células, perda do DNA durante a extracção ou presença de inibidores no extracto) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra. Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para HSV1 e Ct 35 para o Controlo Interno, o DNA de HSV1 não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de HSV1 esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja Características da perfomance). Neste caso o resultado será um falso negativo. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. *Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de HSV1, a amplificação do Controlo Interno pode dar como resultado um Ct > 35 ou Ct Não determinado. No entanto, a reacção de amplificação com baixa eficiência do Controlo Interno pode ser anulada da competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de HSV1. Neste caso a amostra de qualquer maneira é idónea e o resultado positivo do teste é válido. Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Ct Não determinado (Undetermined) para HSV1, foi detectada a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 9/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 10/19

Análise quantitativa dos resultados Depois de haver realizado o procedimento para análise qualitativa dos resultados é possível realizar análise quantitativa dos resultados relativos às amostras positivas. Os valores de Ct para HSV1 nas reacções de amplificação dos quatro HSV1 Q - PCR standard são utilizados para calcular a Curva standard (Results > Standard Curve) da sessão de amplificação e para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela seguinte: Curva Standard detector FAM "HSV1" Intervalo de aceitabilidade Amplificação / Detecção Coeficiente de Correlação (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA Se o valor do Coeficiente de correlação (R2) não entra nos limites, se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (deslocamento incorrecto da mistura de reacção ou dos standard, degradação da mistura de reacção ou dos standard, programação incorrecta da posição dos standard, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Os valores de Ct para HSV1 nas reacções de amplificação de cada amostra e a Curva standard da sessão de amplificação são utilizados para calcular a Quantidade (Quantity) de DNA branco presente nas reacções de amplificação relativas às amostras. Este kit está em condições de dosar de 1.000.000 a 10 cópias de DNA do gene codificante a gpd de HSV1 para reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção (veja parágrafo nas Características da perfomance), como descrito na tabela seguinte: Resultado da amostra detector FAM HSV1 genomas Equivalentes de HSV1 por reacção Quantidade > 1 x 10 6 SUPERIORES A 1.000.000 1 x 10 1 Quantidade 1 x 10 6 = Quantidade Quantidade < 1 x 10 1 INFERIORES A 10 Os resultados (Quantidade) relativos a cada amostra são utilizados para calcular os genomas Equivalentes (geq) de HSV1 presentes na amostra de partida (Nc) de acordo com esta fórmula: Ve x Quantidade Nc = Vc x Va x Ee Onde: Vc é o volume da amostra usado na extracção em relação à unidade de medida requerida; Ee é a eficiência da extracção expressa em decimais; Ve é o volume total obtido da extracção expressado em µl; Va é o volume do produto de extracção usado na reacção de amplificação expressado em µl; Quantidade é o resultado da reacção de amplificação relativa à amostra expresso em geq por reacção. Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAgen» e se quer obter o resultado expressado em geq / ml, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «EXTRAgen» Vc = 0,3 ml Ee = 0,8 (eficiência média de 80%) Ve = 15 µl Va = 5 µl 15 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,3 x 5 x 0,8 Nc (geq / ml) = 12,5 x Quantidade Quando se utiliza o sistema de extracção «NucliSENS easymag» e se quer obter o resultado expresso em geq / ml, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «NucliSENS easymag» Vc = 0,5 ml Ee = 1,0 (eficiência média de 100%) Ve = 55 µl Va = 5 µl 55 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,5 x 5 x 1,0 Nc (geq / ml) = 22 x Quantidade Cálculo dos limites do intervalo da dosagem Os limites do intervalo de medição linear quando se utiliza um método particular de extracção, podem ser calculados a partir do intervalo de medição linear da reacção de amplificação, segundo esta fórmula: Ve x 10 geq Limite inferior (geq / ml) = Vc x Va x Ee Ve x 1.000.000 geq Limite superior (geq / ml) = Vc x Va x Ee Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAgen» a fórmula seria: Limites do intervalo de medição linear com «EXTRAgen» Limite inferior (geq / ml) = 12,5 x 10 geq Limite superior (geq / ml) = 12,5 x 1.000.000 geq de 125 a 12.500.000 geq / ml Quando se utiliza o sistema de extracção «NucliSENS easymag» a fórmula torna-se: Limites do intervalo de medição linear com «NucliSENS easymag» Limite inferior (geq / ml) = 22 x 10 geq Limite superior (geq / ml) = 22 x 1.000.000 geq de 220 a 22.000.000 geq / ml SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 11/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 12/19

LIMITES DO PROCEDIMENTO CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE Utilizar precisamente com este produto o DNA extraído das seguintes amostras humanas: tampões de lesões mucocutâneas e do plasma colhido em EDTA. Não utilizar com este produto o DNA extraído das amostras heparinizadas: A heparina inibe a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e causa resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído contaminado com hemoglobina, dextrano, Ficoll, etanol ou 2-propanol: estas substâncias inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e podem causar resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído com elevadas quantidades de DNA genómico humano que podem inibir a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos. Não estão disponíveis dados referentes às prestações deste produto com o DNA extraído das seguintes amostras clínicas: líquido cefalorraquidiano (liquor), sangue inteiro colhido em EDTA, líquido amniótico. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta recolecção, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados icorrectos, é necessário portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos. O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para HSV1, dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenómenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual. Este produto requer pessoal competente e instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer pessoal competente e instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos. Este produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de HSV1 não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não se pode descartar que o DNA de HSV1 esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja parágrafo nas Características da performance); neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco resíduo não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco resíduo em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões erradas com com consequências graves para o paciente. Sensibilidade analítica: limites de detecção A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA solução branco nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como limite de detecção, está determinada utilizando um DNA plasmídico contendo o produto de amplificação cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. O DNA plasmídico foi diluído a uma titulação de 10 cópias / 5 µl em DNA genómico humano a uma titulação de 500 ng / 5 µl. Esta amostra foi empregada em 50 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivos negativos 10 cópias DNA plasmídico + 500 ng de DNA genómico humano 50 50 0 Sensibilidade analítica: intervalo linear de mistura A sensibilidade analítica deste teste, como intervalo linear de mistura, permite determinar uma titulação de 1.000.000 a 10 moléculas de DNA branco nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como intervalo linear de mistura, foi determinada utilizando um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a sucessiva) de DNA plasmídico contendo o produto de amplificação, cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. Os pontos do painel para 10 7 moléculas para reacções de 10 1 moléculas para reacção foram empregadas em 9 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. A análise dos dados obtidos, realizada com a regressão linear, demostrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação linear superior a 0,99). O limite superior do intervalo linear de mistura, foi fixado a 10 6 moléculas / 5 µl, dentro de um logaritmo do valor do standard de amplificação HSV1 Q - PCR Standard de concentração mais alta, (10 5 moléculas / 5 µl). O limite inferior do intervalo linear de mistura, foi fixado a 10 moléculas / 5 µl, dentro de um logaritmo do valor do standard de amplificação HSV1 Q - PCR Standard de concentração mais baixa, (10 2 moléculas / 5 µl). Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte. Intervalo linear de medida Cópias de DNA / reação Limite superior 1.000.000 Limite inferior 10 Na página 11 são calculados os limites do intervalo de medição linear expressos em geq / ml referidos ao kit de extracção utilizado. Sensibilidade analítica: Precisão O estudo da precisão do teste, entendido como variabilidade dos resultados obtidos com diferentes repetições de uma amostra em uma mesma sessão, permitiu determinar um Coeficiente de Variação percentual (CV %) médio de 9,6% ao interior do intervalo linear de medida de 10 6 moléculas / 5 µl de 10 moléculas / 5 µl de 10 moléculas /5 µl. Sensibilidade analítica: Exactidão O estudo da exactidão do teste, como diferença entre a média dos resultados obtidos em uma mesma sessão com diferentes repetições de uma amostra e o valor teórico da concentração da amostra, permitiu determinar uma Inexactidão percentual média de 6,4% no interior do intervalo linear de medida de 10 6 moléculas / 5 µl de 10 moléculas / 5 µl. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 13/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 14/19

Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel para proficiency test A sensibilidade analítica do teste, como reprodutibilidade dos resultados em comparação com os resultados obtidos com outros métodos e em diferentes laboratórios, foi verificada com um painel de plasmas para proficiency test. Os testes foram realizados utilizando como material de referência calibrado um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a sucessiva) de HSV1 em plasma entre a concentração limite PeliCheck HSV- 1/2-DNA-02, AcroMetrix Europe B.V., the Netherlands). Cada amostra do painel foi empregada em 3 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Testes com material de referência calibrado Valor teórico Valor teórico Valor teórico Média dos resultados Repetições Positivos NDU / ml NDU / extracção NDU / reacção geq / reacção 5,0 1,5 0,4 3 2 3,49 50,0 15,0 4,0 3 3 35,19 500,0 150,0 40,0 3 3 319,09 5.000,0 1500,0 400,0 3 3 4112,44 50.000,0 15000,0 4000,0 3 3 31597,30 O produto demonstrou estar em condições de reproduzir correctamente os resultados obtidos com outros métodos em diferentes laboratórios. Neste teste uma NDU (NAT Detection Unit) da AcroMetrix Europe B.V. demonstra-se equivalente a aproximadamente 9 geq calculados com o produto «HSV1 Q - PCR Standard» da ELITechGroup S.p.A. Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção e quantificação nos diferentes genótipos / subtipos A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção e quantificação nos diversos genótipos /sub-tipos, está avaliada pelo confronto de sequências com banco de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers do AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados do gene que codifica a glicoproteína D (gpd) de HSV1 demonstrou sua conservação e a ausência de mutações significativas. Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas A sensibilidade diagnóstica do teste, como confirmação das amostras clínicas positivas, foi verificada utilizando como material de referência alguns tampões mucocutâneos positivos para o DNA de HSV1. A sensibilidade diagnóstica foi verificada utilizando 5 tampões mucocutâneos positivos para o DNA de HSV1 (testados com um método de amplificação nested). Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivos negativos Tampões para amostras genitais positivos para o DNA de HSV1 5 5 0 Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes A sensibilidade analítica do teste, como cross reactiva com outros marcadores interferentes, foi avaliada para confronto de sequência com bancos de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers do AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados dos diversos organismos da HSV1, entre aqueles do genoma completo de HSV2, o Herpes vírus humano mais similar ao HSV1, demostrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 15/19 A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada utilizando como material de referência algumas amostras de tampões para amostras genitais para o DNA de HSV2. A especificidade analítica do teste foi verificada utilizando 22 tampões para amostras genitais positivos para o DNA de HSV2 (testados com um método de amplificação nested). Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivos negativos Tampões para amostras genitais positivos para o DNA de HSV2 22 1 21 Uma amostra positiva para o DNA de HSV2 resultou positiva também para o DNA de HSV1 a uma titulação inferior de 125 geq / ml (105 geq / ml). Este título está abaixo do limite de detecção da maior parte dos métodos de amplificação podendo produzir resultados positivos de modo estatístico. Ademais outras 9 amostras positivas para o DNA de HSV2 com uma titulação similar (aproximadamente 10 7-10 8 geq / ml) resultou negativas para HSV1. Esta positividade não parece portanto imputável a uma cross reactividade com HSV2. Especificidade diagnóstica: amostras negativas A especificidade diagnóstica do teste, como confirmação das amostras clínicas negativas, foi avaliada interpretando a análise de um painel de plasmas normais de doadores e de algumas amostras de tampões para amostras genitais negativos para o DNA de HSV1 e resultou igual a 89,8%. A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando um painel de amostras de plasma normais de doadores (Painel Normal Humano Plasma, AcroMetrix Europe B.V., the Netherlands). Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivos negativos Painel de plasmas normais de doadores 28 3 25 As discordâncias entre os resultados obtidos com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os esperados podem ser explicados pelo fato de que os plasmas são presumivelmente negativos para o DNA de HSV1, um vírus que é muito difundido na população e provoca infecções recorrentes que na maior parte dos casos não tem interesse clínico. As 3 amostras resultados positivos tem uma titulação inferior de 125 geq / ml (16 e 29 e 12 geq / ml). A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando 21 tampões para amostras genitais negativos para o DNA de HSV1 (testados com um método de amplificação nested). Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análises, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivos negativos Tampões para amostras genitais negativos para o DNA de HSV1 21 2 19 As discordâncias entre os resultados obtidos com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os obtidos com o sistema de amplificação nested podem ser explicados com a titulação inferior de 125 geq / ml (63 e 11 geq / ml) das 2 amostras de resultados positivos. Estas titulações estão abaixo do limite de detecção da maior parte dos métodos de amplificação podendo produzir resultados positivos de modo estatístico. Nota: Os dados e resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da performance do produto com as matrizes e os instrumentos estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "", FTP RTS031. BIBLIOGRAFIA E. Aurelius et al. (1993) J. Med. Virology 39: 179 186 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 16/19

PROBLEMAS E SOLUÇÕES SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS DNA alvo não detectado na reacção do Positive Control ou dos Q - PCR Standard ou Coeficiente de correlação da Curva standard não válido Possíveis causas Soluções Controlar os volumes de reagentes dispensados durante a Erro na preparação da mistura de reacção. preparação da mistura de reacção. Dispensar com atenção os reagentes na microplaca seguindo o plano de trabalho. Erro na deslocamento na microplaca. Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar os volumes de controlo positivo ou de standard dispensados. Número do catálogo. Limite superior de temperatura. Código do lote. Degradação da sonda. Utilizar uma nova divisão de mistura de reacção. Para utilizar antes do (último dia do mês). Degradação do controlo positivo ou standard. Erro na programação do equipamento. Utilizar uma nova divisão do controlo positivo ou standard. Controlar a posição das reacções do controlo positivo ou standard programada no equipamento. Controlar o ciclo térmico programado no equipamento. DNA alvo detectado na reacção de Controlo negativo Possíveis causas Soluções Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Erro na deslocamento na microplaca. Dispensar com atenção as amostras, controlo negativo e positivo ou standard na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar a posição de amostras, controlo negativo e Erro durante a programação do equipamento. controlo positivo ou standard programada no equipamento Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Microplaca mal fechada. Contaminação da água de grau molecular para biologia. Contaminação da mistura de reacção. Contaminação da área para a extracção / preparação das reacções de amplificação. Fechar cuidadosamente a microplaca. Utilizar uma nova divisão de água. Utilizar uma nova divisão de mistura de reacção. Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquoso, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Fabricante. Presença de fluorescência de fundo irregular ou elevada nas reacções Possíveis causas Soluções Programar o intervalo de cálculo da "baseline" em um âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja estabilizada (controlar os registros "Results", Erro na programação da "baseline". "Component") e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a crescer, por exemplo do ciclo 9 ao ciclo 15. Configurar o cálculo automático da "baseline" seleccionando a opção "autobaseline". A aquisição deste produto dá direito ao adquirente de utilizá-lo para a amplificação e a detecção de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto aos produtos licenciados para "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do adquirente. «NucliSENS easymag» são marcas registadas da biomérieux. SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 17/19 SCH mrts031m_pt 01/02/16 Revisão 04 Pág. 18/19