JCV Q - PCR Alert Kit

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1 JCV Q - PCR Alert Kit ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 3 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 3 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 3 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 5 PROCEDIMENTO pág. 6 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 13 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 14 BIBLIOGRAFIA pág. 17 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 17 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 18 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: C O produto «JCV Q - PCR Alert Kit» é um teste qualitativo e quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e a dosagem do DNA do Poliomavírus humano JC (JCV) em amostras de DNA extraído do plasma colhido em EDTA e urinas colhidas sem conservantes. O produto é empregado, juntamente com dados clínicos e outros exames de laboratório, nos diagnósticos e na monitorização da infecção da JCV. PRINCÍPIO DO TESTE O teste prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção de fluorescência (thermal cycler para amplificação real time). Em cada pocinho efectuam-se duas reacções de amplificação: uma específica para a região do gene codificante do Large T antigen de JCV e uma específica para a região do gene humano codificante da beta Globina (Controlo Interno de inibição) utilizando o DNA extraído das amostras para testar. A sonda específica para JCV marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para JCV. A sonda específica para o Controlo Interno marcada com o fluoróforo VIC ou análogo, é activada quando híbrida com o produto da reacção de amplificação para o Controlo Interno. A emissão da fluorescência aumenta com o aumento dos produtos específicos da reacção de amplificação e é misturada e registrada pelo aparelho. A elaboração dos dados permite determinar a presença e a titulação do DNA de JCV na amostra de partida. A validação do teste foi realizada com instrumentos 7300 Real Time PCR System e 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument. DESCRIÇÃO DO PRODUTO O produto «JCV Q - PCR Alert Kit» fornece a mistura de reacção completa e pronta para usar JCV Q - PCR Mix para a amplificação real time com uma solução estabilizante; pré-alíquotada em quatro tubos. Cada tubo contém 540 µl de solução, suficiente para 25 testes. Os oligonucleotídeos primers e a sonda para JCV, (marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada do grupo MGB-NFQ), são específicos para uma região do gene que codifica o Large T antigen de JCV. Os oligonucleotídeos primers e a sonda para o Controlo Interno (marcada com o fluoróforo VIC ou análogo e bloqueada pelo grupo MGB-NFQ) são específicos para a região promotora e 5' UTR do gene humano codificante da beta-globina. A mistura de reacção fornece o sistema tampão, o cloreto de magnésio, os nucleotídeos trifosfatos, o fluoróforo ROX (referência passiva para a normalização da fluorescência), a enzima DNA polimerase de activação térmica (hot start). O produto permite efectuar 100 determinações, standard e controlos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO Componente Descrição Quantidade Classificação e Etiquetagem JCV Q - PCR Mix mistura de reacção completa 4 x 540 µl - MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerossol ou a deslocamento positivo (2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água bidestilada estéril. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fuorescência 7300 Real Time PCR System ou 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument calibrado como previsto pelo fabricante. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 1/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 2/18

2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, o controlo positivo de extracção, os acessórios para a amplificação, o controlo positivo de amplificação e os DNAs standard com quantidade conhecida não estão incluídos neste produto. Para a extracção manual do DNA das amostras a analisar, aconselha-se a utilização do produto genérico «EXTRAgen» (ELITechGroup S.p.A., código EXTG01), kit de extracção dos ácidos nucléicos de amostras não celulares. Para a extracção automática do DNA das amostras a analisar, aconselha-se a utilização dos produtos genéricos NucliSENS easymag Reagents (biomérieux SA, códigos , , , , , ), kit de extracção dos ácidos nucléicos de amostras biológicas, com o instrumento NucliSENS easymag (biomérieux SA, código ). Como controlo positivo de extracção e controlo de inibição é exigida a utilização dos produtos genéricos «CPE-DNA - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTREXTG) ou «CPE - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico para extracções do DNA de amostras não celulares. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, aconselha-se a utilização do produto genérico Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, aconselha-se a utilização do produto genérico Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com pocinhos de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja solicitada a detecção do DNA de JCV (análise qualitativa), aconselha-se a utilização do produto «JCV - Positive Control» (ELITechGroup S.p.A. código CTR176MR), controlo positivo de DNA plasmídico. Caso seja solicitada a detecção e quantificação do DNA de JCV (análise quantitativa), aconselha-se a utilização do produto «JCV Q - PCR Standard» (ELITechGroup S.p.A. código STD176MR), quatro diluições de DNA plasmídico de quantidade reconhecida para obter a curva standard. AMOSTRAS E CONTROLOS Urinas colhidas sem conservantes As amostras de urinas destinadas à extracção dos ácidos nucléicos devem ser colhidas em recipientes sem conservantes sempre de acordo com as indicações do laboratório, transportadas a temperatura ambiente (+18/+25ºC) e conservadas a temperatura ambiente (+18/+25ºC) por um máximo de quatro horas ou caso contrário, devem ser congeladas e conservadas a -20 C por um máximo de trinta dia s ou ainda a -70 C por um tempo maior. O congelamento das amostras de urinas causam frequentemente a formação de precipitados que podem interferir nas fases sucessivas do método: para a extracção utilizar apenas o sobrenadante. Recomenda-se subdividir em mais alíquotas as amostras para conservar congeladas de modo a não submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Nota: quando se realiza a extracção do DNA com o sistema «EXTRAgen» seguir as indicações oferecidas no Manual de instruções para o uso: partir de 300 µl de amostra, acrescentar 10 µl de CPE-DNA para o controlo interno no início da extracção, ressuspender os ácidos nucléicos em 60 µl de água ultrapura. Substâncias interferentes O DNA extraído da amostra de partida não deve conter heparina, hemoglobina, dextrano ou Ficoll, etanol para evitar fenómenos de inibição e a aparição de frequentes resultados não válidos. Quantidade de DNA genómico humano elevadas no DNA extraído da amostra podem inibir a reação de amplificação. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, Anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção para o controlo negativo e uma reacção para o controlo positivo. Para o controlo negativo utilizar água bidestilada estéril (não incluída no produto) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controlo positivo utilizar o produto «JCV - Positive Control» ou o produto «JCV Q - PCR Standard». Controlos de qualidade É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado. Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extraído das seguintes amostras clínicas: plasma colhido em EDTA e urinas colhidas sem conservantes. Plasma colhido em EDTA As amostras de plasma colhido em EDTA destinadas à extracção dos ácidos nucléicos devem ser colhidas segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8º C e conservadas a +2º / +8º C por um máximo de quatro horas ou conservadas congeladas a -20º C por um máximo de trinta dias ou ainda a -70º C por períodos mais longos. Recomenda-se subdividir em mais alíquotas as amostras para conservar congeladas de modo a não submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Nota: quando se realiza a extracção do DNA com o sistema «EXTRAgen» seguir as indicações oferecidas no Manual de instruções para o uso: partir de 300 µl de amostra, acrescentar 10 µl de CPE-DNA para o controlo interno no início da extracção, ressuspender os ácidos nucléicos em 60 µl de água ultrapura. Nota: Quando se realiza a extracção do DNA com o instrumento «NucliSENS easymag» utilizar o protocolo de extracção Generic com um volume de 500 µl. Adicionar uma quantidade de 10 µl de CPE - DNA ou 5 µl de CPE para o controlo interno antes a adição do reagente NucliSENS easymag Magnetic Silica, recuperar o DNA com 100 µl de tampão de eluição. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 3/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 4/18

3 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se podessem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerossol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121ºC durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se podessem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerossol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou o rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler atentamente todas as instruções fornecidas no produto antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no produto durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do produto. Utilizar somente os reagentes presentes no produto e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não utilizar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de produtos de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal competente e instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação para a área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas dentro de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerossol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para Aerossol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes A JCV Q - PCR Mix deve ser conservada em ambiente escuro a -20 C. A JCV Q - PCR Mix pode ser congelada e descongelada por um máximo de três vezes: ulteriores ciclos de congelamento / descongelamento podem causar uma perda no rendimento do produto. JCV Q - PCR Mix não apresenta frases de risco (R) e apresenta os seguintes conselhos de prudência (S): S 23-24/25. Não respirar gases/fumos/vapores/aerossol. Evitar o contacto com os olhos e a pele. PROCEDIMENTO Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar a sessão é necessário: - referindo-se à documentação do equipamento, ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantitation"; - referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para JCV com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "JCV ; - referindo-se à documentação do equipamento, programar o "detector" para a sonda para a beta- Globina com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CI ; - referindo-se à documentação do equipamento, para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar o "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação, standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos pocinhos da mistura de reação e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA nas amostras de partida é necessário preparar uma série de reacções com o Q - PCR Standard (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 12 amostras. C1 C2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C10 C11 C12 CN Significado: C1 - C12: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; 10 2 : Standard 102 cópias; 10 3 : Standard 10 3 cópias; 10 4 : Standard 10 4 cópias; 10 5 : Standard 10 5 cópias. Consultando a documentação do instrumento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico: - acrescentar na fase de amplificação a passagem de extensão em 72 C ; Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada na passagem de hibridação em 60 C. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 5/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 6/18

4 - modificar os tempos como indicado na seguinte tabela; - programar um número de ciclos equivalente a 45; - programar um volume de reacção equivalente a 40 µl. Ciclo térmico Fase Temperaturas Tempos Pré-aquecimento 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 95 C 15 sec. 60 C (aquisição da fluorescência) 45 sec. 72 C 15 sec. Caso se utilize um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar a sessão, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification" e programar Run mode: Fast 7500 ; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para JCV com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "JCV"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o controlo interno com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar (Well Inspector) os "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação ou standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos pocinhos da mistura de reação e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA na amostra de partida é necessário preparar uma série de reacções com os Q - PCR Standard (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. A modalidade de organização de uma análise quantitativa de 12 amostras é ilustrada como exemplo na secção anterior relativa ao procedimento para o instrumento 7300 Real Time PCR System. Referindo-se à documentação do instrumento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico: - acrescentar na fase de amplificação a passagem de extensão em 72 C (Add Step); Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada na passagem de hibridação em 60 C. - modificar os tempos como indicado na tabela a seguir; - programar um número de ciclos igual a 45; - programar o valor de volume de reação igual a 30 µl; Ciclo térmico Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 95 C 15 seg. 60 C (aquisição da fluorescência) 45 seg. 72 C 15 seg. Preparação da amplificação (Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los por 5 segundos para conduzir o conteúdo ao fundo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar os tubos JCV Q - PCR Mix necessários para a sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 25 reacções. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los por 5 segundos para conduzir o conteúdo ao fundo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar o tubo de JCV - Positive Control ou os tubos de JCV Q - PCR Standard. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los por 5 segundos para conduzir o conteúdo ao fundo e mantê-lo em gelo; - retirar a Amplification microplate que será utilizada na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos pocinhos. 1. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo sem criar bolhas, 20 µl de mistura de reacção JCV Q - PCR Mix nos pocinhos da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20ºC por um máximo de um mês. Congelar e descongelar a mistura de reacção por um máximo de 3 VEZES. 2. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de DNA extraído da primeira amostra no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem a amostra pipetando por três vezes o volume de 20 µl na solução de reacção. Prestar muita atenção para não criar bolhas. Proceder do mesmo modo com todos os outros DNAs extraídos. 3. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de Água bidestilada estéril (não fornecida no produto) no pocinho da Amplification microplate do controlo negativo de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem o controlo negativo pipetando por três vezes o volume de 20 µl na solução de reacção. Prestar muita atenção para não criar bolhas. 4. Com base ao tipo de resultado solicitado (qualitativo ou quantitativo), seguir umas das duas opções: - Quando se solicita um resultado qualitativo da análise (pesquisa do DNA de JCV): transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de JCV - Positive Control no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem o controlo positivo pipetando por três vezes o volume de 20 µl na solução de reacção. Prestar muita atenção para não criar bolhas. - Quando se solicita um resultado quantitativo da análise (dosagem do DNA de JCV): transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de JCV Q - PCR Standard 10 2 no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem o standard pipetando por três vezes o volume de 20 µl na solução de reacção. Prestar muita atenção para não criar bolhas. Proceder do mesmo modo com os outros JCV Q - PCR Standard 10 3, 10 4, Fechar cuidadosamente a Amplification microplate com a Amplification Sealing Sheet. 6. Transferir a Amplification microplate no thermal - cycler para real time na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação e iniciar o ciclo térmico de amplificação salvando a configuração da sessão com uma identificação única e reconhecível (p. ex. "ano-mês-dia-jcv- ELITECHGROUP"). Nota: Ao término do ciclo térmico a Microplaca de amplificação com os produtos de reacção deve ser removida do instrumento e eliminada para não gerar contaminações ambientais. Jamais levantar a Amplification Sealing Sheet da Amplification microplate de modo a evitar a saída dos produtos de reacção. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 7/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 8/18

5 Análise qualitativa dos resultados Os valores registrados da fluorescência emitida pela sonda específica para JCV (detector FAM "JCV") e pela sonda específica para o Controlo Interno (detector VIC "CI") nas reacções de amplificação devem ser analisadas com o software do equipamento. Antes de iniciar a análise, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - programar manualmente (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15; Nota: No caso de uma amostra positiva a alta titulação de JCV, a fluorescência FAM da sonda específica para JCV pode começar a crescer antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluorescência FAM começar a crescer (Results > Component). Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,1. Caso tenha sido utilizado um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o a 0,1; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,05. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reacção de amplificação e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para determinar o Ciclo Limiar (Ct, Threshold cycle), o ciclo em que foi alcançado o valor Limiar de fluorescência. Na reacção de amplificação com o JCV - Positive Control*, o valor de Ct para JCV (Results > Report) é utilizado para validar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: JCV - Positive Control Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 25 POSITIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do JCV - Positive Control é Ct > 25 ou Ct Não determinado (Undetermined) para JCV, não foi detectada correctamente a presença de DNA padrão. Se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (deslocamento incorrecto da mistura de reacção ou do controlo positivo, degradação da mistura de reacção ou do controlo positivo, programação incorrecta da posição do controlo positivo, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. *Nota: Quando este produto é utilizado para a dosagem do DNA de JCV, no lugar da reacção com o JCV - Positive Control foi preparada a série de reacções com os JCV Q - PCR Standard. Neste caso para confirmar a amplificação e a detecção deve-se tomar como referência a reacção de amplificação do JCV Q - PCR Standard 10 5 (Ct 25). Na reacção de amplificação do Controlo negativo, o valor de Ct para JCV (Results > Report) é utilizado para validar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Reacção Controlo negativo Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct Não determinado NEGATIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Ct Não determinado (Undetermined) para JCV, foi detectada a presença de DNA alvo. Se são verificados problemas na fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Nas reacções de amplificação de cada amostra, os valores de Ct para JCV são utilizados para detectar a presença de DNA alvo, enquanto os valores de Ct para o Controlo Interno são utilizados para confirmar a extracção, a amplificação e a detecção. Nota: Verificar com o software do equipamento (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) que o Ct esteja a ser determinado por um rápido e regular aumento dos valores de fluorescência e não por fenómenos de pico ou aumento gradual do sinal de fundo. Este produto tem capacidade de detectar uma quantidade mínima de 10 cópias de DNA do gene do Large T antigen de JCV por reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção (limite de detecção do produto, veja Características da performance na página 14). Os resultados como Ct das reacções de amplificação de cada amostra (Results > Report) são utilizados como descrito na tabela seguinte: Ct Não determinado Ct Determinado Reacção da amostra detector VIC "CI" Ct > 35 ou Ct Não determinado Idoneidade da amostra Resultado do teste DNA de JCV não idónea não válido - Ct 35 idónea válido, negativo Ct > 35 ou Ct Não determinado NÃO DETECTADO idónea válido, positivo PRESENTE Ct 35 idónea válido, positivo PRESENTE Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para JCV e Ct > 35 ou Não determinado para o Controlo Interno, não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do Controlo Interno. Neste caso se são verificados problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (perda de DNA ou presença de inibidores) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra. Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para JCV e Ct 35 para o Controlo Interno, o DNA de JCV não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de JCV esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja Características da perfomance na página 14). Neste caso o resultado será um falso negativo. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de JCV, a amplificação do Controlo Interno pode dar como resultado um Ct > 35 ou Ct Não determinado. No entanto, a reacção de amplificação com baixa eficiência do Controlo Interno pode ser anulada pela competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de JCV. Neste caso a amostra de qualquer maneira é idónea e o resultado positivo do teste é válido. Análise quantitativa dos resultados Depois de haver realizado o procedimento para análise qualitativa dos resultados é possível realizar análise quantitativa dos resultados relativos às amostras positivas. Os valores de Ct para JCV nas reacções de amplificação dos quatro JCV Q - PCR standard são utilizados para calcular a Curva standard (Results > Standard Curve) da sessão de amplificação e para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela seguinte: Curva Standard Intervalo de aceitabilidade Amplificação / Detecção Coeficiente de Correlação (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 9/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 10/18

6 Se o valor do Coeficiente de correlação (R2) não entra nos limites, se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (deslocamento incorrecto da mistura de reacção ou dos standard, degradação da mistura de reacção ou dos standard, programação incorrecta da posição dos standard, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Os valores de Ct para JCV nas reacções de amplificação de cada amostra e a Curva standard da sessão de amplificação são utilizados para calcular a Quantidade (Quantity) de DNA alvo presente nas reacções de amplificação relativas às amostras. Este produto está em condições de dosar de a 10 cópias de DNA do gene do Large T antigen de JCV para reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção (veja Características da perfomance na página 14) como descrito na tabela seguinte: Resultado da amostra genomas Equivalentes de JCV por reacção Quantidade > 1 x 10 6 SUPERIORES A x 10 1 Quantidade 1 x 10 6 = Quantidade Quantidade < 1 x 10 1 INFERIORES A 10 Os resultados (Quantidade) relativos a cada amostra (Results > Report) são utilizados para calcular os genomas Equivalentes (geq) de JCV presentes na amostra de partida (Nc) de acordo com esta fórmula: Ve x Quantidade Nc (geq / ml) = Vc x Va x Ee Onde: Vc é o volume da amostra usado na extracção expresso em ml, Ee é a eficiência da extracção expressa em decimas, Ve é o volume total obtido da extracção expresso em µl, Va é o volume do produto de extracção usado na reacção de amplificação expresso em µl; Quantidade é o resultado da reacção de amplificação relativa à amostra expresso em geq para reacção. Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAgen» a fórmula seria: Fórmula simplificada para «EXTRAgen» Vc = 0,3 ml Ee = 0,8 (eficiência média de 80%) Ve = 60 µl Va = 20 µl 60 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,3 x 20 x 0,8 Nc (geq / ml) = 12,5 x Quantidade Quando se utiliza o sistema de extracção «NucliSENS easymag» e se quer obter o resultado expresso em geq / ml, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «NucliSENS easymag» Vc = 0,5 ml Ee = 1,0 (eficiência média de 100%) Ve = 100 µl Va = 20 µl 100 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,5 x 20 x 1,0 Nc (geq / ml) = 10 x Quantidade Cálculo dos limites do intervalo da dosagem Os limites do intervalo de dosagem, quando se utiliza um método particular de extracção, podem ser calculados a partir do intervalo de dosagem da reacção de amplificação segundo esta fórmula: Ve x 10 geq Limite inferior (geq / ml) = Vc x Va x Ee Ve x geq Limite superior (geq / ml) = Vc x Va x Ee Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAgen» a fórmula seria: Limites do intervalo de dosagem com «EXTRAgen» Limite inferior (geq / ml) = 12,5 x 10 geq Limite superior (geq / ml) = 12,5 x geq de 125 a geq / ml Quando se utiliza o sistema de extracção «NucliSENS easymag» a fórmula torna-se: Limites do intervalo de medição linear com «NucliSENS easymag» Limite inferior (geq / ml) = 10 x 10 geq Limite superior (geq / ml) = 10 x geq de 100 a geq / ml SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 11/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 12/18

7 LIMITES DO PROCEDIMENTO CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE Utilizar com este produto somente o DNA extraído das seguintes amostras clínicas: plasma colhido em EDTA e urinas colhidas sem conservantes. Não utilizar com este produto o DNA extraído das amostras heparinizadas: a heparina inibe a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e causa resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído contaminado com hemoglobina, dextrano ou Ficoll, estas substâncias inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e podem causar resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído com elevadas quantidades de DNA genómico humano que podem inibir a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos. Não estão disponíveis dados referentes às prestações deste produto com o DNA extraído das seguintes amostras clínicas: líquido cefalorraquidiano (liquor), sangue inteiro. Não estão disponíveis dados relativos a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, Anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta identificação, recolecção, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorrectos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos. O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para JCV, dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. A forma de utilização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenómenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual. Este produto requer pessoal competente e instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer pessoal competente e instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos. Este produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de JCV não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não se pode descartar que o DNA de JCV esteja presente a uma titulação inferior no limite de detecção do produto (veja Características da performance na página 14); neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco residual não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco resíduo em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir para decisões erradas com consequências graves para o paciente. Sensibilidade analítica: limites de detecção A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA alvo nos 20 µl de DNA acrescentados à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica, como limite de detecção, está determinada utilizando um DNA plasmídico contendo o produto de amplificação cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. O DNA plasmídico foi diluído a uma titulação de 10 cópias / 20 µl em DNA genómico humano a uma titulação de 500 ng / 20 µl. Esta amostra foi empregada em 50 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas 10 cópias DNA plasmídico ng de DNA genómico humano Sensibilidade analítica: intervalo linear de medida A sensibilidade analítica deste teste permite determinar uma titulação de a 10 moléculas de DNA alvo nos 20 µl de DNA acrescentados à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como intervalo linear de medida, foi determinada utilizando um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a sucessiva) de DNA plasmídico contendo o produto de amplificação, cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. Os pontos do painel de 10 7 moléculas para reacções a 10 1 moléculas para reacção foram empregadas em 9 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. A análise dos dados obtidos, realizada com a regressão linear, demostrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação linear superior a 0,99). O limite superior do intervalo linear de medida foi fixado a 10 6 moléculas por reacção, dentro de um logaritmo do valor do standard de amplificação JCV Q - PCR Standard de concentração mais alta, (10 5 moléculas / 20 µl). O limite inferior do intervalo linear de medida foi fixado a 10 moléculas por reacção, dentro de um logaritmo do valor do standard de amplificação JCV Q - PCR Standard de concentração mais baixa, (10 2 moléculas / 20 µl). Os resultados são resumidos na tabela seguinte. Limite superior Limite inferior Intervalo linear de medida cópias DNA / reacção 10 cópias DNA / reacção Na página 12 são calculados os limites do intervalo de dosagem referentes ao sistema de extracção utilizado partindo dos limites do intervalo linear de medição anteriormente mencionados. Sensibilidade analítica: Precisão e Exactidão A precisão do teste, como variabilidade dos resultados obtidos em uma mesma sessão de amplificação com diferentes repetições de uma amostra, permitiu obter um Coeficiente de Variação percentual (CV %) médio de 16,6% no intervalo de 10 6 moléculas a 10 moléculas nos 20 µl de DNA acrescentados à reacção de amplificação. A exactidão do teste, como diferença entre a média dos resultados obtidos em uma mesma sessão com diferentes repetições de uma amostra e o valor teórico da concentração da amostra, permitiu determinar uma Inexactidão percentual média de 6,6% no interior do intervalo linear de 10 6 moléculas a 10 moléculas nos 20 µl de DNA acrescentados à reacção de amplificação. A precisão e exactidão foram determinadas utilizando os dados obtidos nas provas para o estudo do intervalo linear de medição. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 13/18 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 14/18

8 Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel para eficiência do teste A sensibilidade analítica do teste, como reprodutibilidade dos resultados em comparação com os resultados obtidos com outros métodos e em diferentes laboratórios, foi verificada com um painel para eficiência do teste. As provas foram realizadas utilizando como material de referência certificado um painel de diluições de JCV e de BKV dentro da concentração limite (QCMD 2008 JC and BK virus EQA Panel, Qnostics Ltd, Scotland, UK). Cada amostra do painel foi empregada em 2 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com o produto ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Provas com material de referência certificado Amostra Patógeno, matriz Resultado esperado Positivas / Repet. Média Ct JC.BK08-01 Negativas, meio de transporte negativo 0 / 2 não detectado JC.BK08-02 BKV-1B, meio de transporte forte positivo (BKV) 0 / 2 não detectado JC.BK08-03 BKV-1B, meio de transporte forte positivo (BKV) 0 / 2 não detectado JC.BK08-04 BKV-1B, meio de transporte fraco positivo (BKV) 0 / 2 não detectado JC.BK08-05 BKV-1B, meio de transporte fraco positivo (BKV) 0 / 2 não detectado JC.BK08-06 JCV-2B, plasma Positivo (JCV) 2 / 2 34,19 JC.BK08-07 JCV-2B, meio de transporte forte positivo (JCV) 2 / 2 32,07 JC.BK08-08 JCV-2B, meio de transporte positivo (JCV) 2 / 2 38,29 JC.BK08-09 Negativas, meio de transporte negativo 0 / 2 não detectado JC.BK08-10 JCV-2B, meio de transporte positivo (JCV) 2 / 2 37,88 JC.BK08-11 BKV-1B, plasma forte positivo (BKV) 2 / 2 não detectado JC.BK08-12 JCV-2B, meio de transporte fraco positivo (JCV) 0 / 2 não detectado Somente uma amostra do painel não foi identificada correctamente. Essa amostra (JC.BK08-12) é pouco positiva para o DNA de JCV e foi identificada correctamente somente por 30% dos 74 participantes do proficiency study. A discordância pode portanto ser explicada com um título do DNA de JCV inferior ao limite de detecção do produto. Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção e quantificação nos diferentes genótipos / subtipos A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção e quantificação nos diversos genótipos / sub-tipos, está avaliada pelo confronto de sequências com banco de dados nucleotídicos. O exame das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers e da sonda fluorescente no alinhamento das sequências disponibilizadas no banco de dados do gene que codifica o Large T antigen de JCV demonstrou a sua conservação e a ausência de mutações significativas. Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas A sensibilidade diagnóstica do teste, como confirmação de amostras clínicas positivas, foi avaliada utilizando algumas amostras clínicas positivas para o DNA de JCV resultando maior que 97,8%. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada utilizando como material de referência 23 amostras de plasma colhido em EDTA e 23 amostras de urinas, todas positivas para o DNA de JCV, (testadas com um método de amplificação real time). Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com o produto ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Plasma EDTA positivo para o DNA de JCV Urinas positivas para o DNA de JCV SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 15/18 Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes A especificidade analítica do teste, como ausência de reactividade cruzada com outros marcadores potencialmente interferentes, foi avaliada para confronto de sequência com bancos de dados nucleotídicos. A análise do alinhamento das sequências dos oligonucleotídeos primers e da sonda fluorescente com as sequências disponibilizadas no banco de dados dos diversos organismos da JCV, entre aqueles do genoma completo de BKV, o Poliomavírus humano mais similar ao JCV, demostrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada utilizando algumas amostras clínicas positivas para o DNA de BKV. A especificidade analítica foi verificada utilizando como material de referência 20 amostras de plasma colhido em EDTA e 22 amostras de urinas, todas negativas para o DNA de JCV, mas positivas para o DNA de BKV (testadas com um método de amplificação real time). Cada amostra foi utilizada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com o produto ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Plasma EDTA positivo para o DNA de BKV Urinas positivas para o DNA de BKV A amostra de urinas discordante é um resultado fortemente positivo (mais de cópias por reacção) para o DNA de JCV em duas sessões de análise independentes. O resultado obtido dificilmente pode ser explicado como uma reactividade cruzada e essa amostra poderia, ao contrário, apresentar um grupo de JCV não detectável pelo método de referência. A especificidade analítica do teste, como ausência de reactividade cruzada com outros marcadores potencialmente interferentes, foi avaliada utilizando um painel para proficiency test. A especificidade analítica foi verificada utilizando como material de referência certificado um painel que contém amostras positivas para BKV (QCMD 2008 JC and BK virus EQA Panel, Qnostics Ltd, Scotland, UK). Cada amostra do painel foi empregada em 2 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com o produto ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados são referidos ao parágrafo "Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel para eficiência do teste". Especificidade diagnóstica: amostras negativas A especificidade diagnóstica do teste, como confirmação de amostras negativas, foi avaliada utilizando algumas amostras clínicas negativas para o DNA de JCV resultando igual a 95,0%. A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando como material de referência 20 amostras de plasma colhido em EDTA e 20 amostras de urinas, todas negativas para o DNA de JCV (testados com um método de amplificação real time). Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com o produto ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Amostras N positivas negativas Plasma EDTA negativo para o DNA de JCV Urinas negativas para o DNA de JCV As duas amostras de plasma discordantes são resultados positivos muito fracos (cerca de uma cópia por reacção) para o DNA de JCV numa primeira sessão e negativos repetindo a análise. Essas amostras estão abaixo do limite de sensibilidade deste produto e provavelmente também do método de referência e, portanto, podem dar resultados positivos ou negativos de modo casual em sessões diferentes. Nota: Os dados e resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da performance do produto com as matrizes e os instrumentos estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "JCV Q - PCR Alert Kit", FTP. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 16/18

9 BIBLIOGRAFIA SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS P. Ferrante et al. (1995) J Med Vir 47: Número do catálogo. PROBLEMAS E SOLUÇÕES DNA branco não detectado na reacção do Positive Control ou dos Q - PCR Standard ou Coeficiente de correlação da Curva standard não válido Possíveis causas Soluções Dispensar com atenção os reagentes na microplaca seguindo o plano de trabalho. Erro na deslocamento na microplaca. Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar os volumes de controlo positivo ou de standard dispensados. Limite superior de temperatura. Código do lote. Para utilizar antes do (último dia do mês). Degradação da sonda. Degradação do controlo positivo ou standard. Erro na programação do equipamento. Utilizar uma nova alíquota de mistura de reacção. Utilizar uma nova alíquota do controlo positivo ou standard. Controlar a posição das reacções do controlo positivo ou standard programada no equipamento. Controlar o ciclo térmico programado no equipamento. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. DNA branco detectado na reacção de Controlo negativo Possíveis causas Soluções Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Erro na deslocamento na microplaca. Dispensar com atenção as amostras, controlo negativo e positivo ou standard na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar a posição de amostras, controlo negativo, Erro durante a programação do equipamento. controlo positivo ou standard programada no equipamento Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Manter distante da luz solar. Microplaca mal fechada. Contaminação da água bidestilada estéril. Contaminação da mistura de reacção. Fechar cuidadosamente a microplaca. Utilizar uma nova alíquota de água estéril. Utilizar uma nova alíquota de mistura de reacção. Fabricante. Contaminação da área para a extracção / preparação da reacção de amplificação. Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquosos, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Presença de fluorescência de fundo elevada nas reacções Possíveis causas Soluções Misturar com cuidado, pipetando por três vezes, amostras, Erro no deslocamento da amostra. controlo negativo e controlo positivo ou standard na mistura de reacção. Evitar a criação de bolhas. Programar o intervalo de cálculo da "baseline" em um âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja estabilizada (controlar os registros "Results", Erro na programação da "baseline". "Component") e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a crescer, por exemplo do ciclo 6 ao ciclo 15. Configurar o cálculo automático da "baseline" seleccionando a opção "autobaseline". SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 17/18 A aquisição deste produto dá direito ao adquirente de utilizá-lo para a amplificação e a detecção de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto aos produtos licenciados para "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do aquisição. «NucliSENS easymag» são marcas registadas da biomérieux. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 02 Pág. 18/18