CHLAMYDIA tr. ELITe MGB Kit reagente para a amplificação Real Time do DNA

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1 ÍNDICE -20 C USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 3 MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 3 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 3 OUTROS PRODUTOS NECESSÁRIOS pág. 4 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 4 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 5 PROCEDIMENTO pág. 6 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO pág. 12 CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO pág. 13 BIBLIOGRAFIA pág. 17 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 18 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 19 AVISO PARA O COMPRADOR: LICENÇA LIMITADA pág ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: PRINCÍPIO DO TESTE O teste prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para amplificação real time). Em cada poço realizam-se três reacções de amplificação a partir do DNA extraído da amostra a testar: uma específica para uma região do gene dnab-like do plasmídeo endógeno (presente em cerca de 7 a 10 cópias por célula) de C. trachomatis, uma específica para a região do gene ompa do cromossoma de C. trachomatis e uma específica para a região do gene humano que codifica para a beta globina (controlo interno de inibição). As sondas com tecnologia ELITe MGB específicas para C. trachomatis marcadas com o fluoróforo FAM são activadas quando se hibridam com os produtos específicos das reacções de amplificação para C. trachomatis. A sonda com tecnologia ELITe MGB específica para o Controlo Interno marcada com o fluoróforo AP525 (equivalente a VIC) é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o Controlo Interno. A emissão da fluorescência aumenta com o aumento dos produtos específicos da reacção de amplificação e é medida e registada pelo aparelho. A elaboração dos dados permite detectar a presença e a titulação do DNA de C. trachomatis na amostra de partida. A validação do teste foi realizada com os instrumentos 7300 Real Time PCR System e 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument. Na figura a seguir é ilustrado em síntese o mecanismo de activação e de emissão da fluorescência da sonda com tecnologia ELITe MGB. Observar como a sonda não é hidrolisada durante o ciclo de amplificação. primer 3 Q 3 DNA modelo R 3 sonda ELITe MGB DNA polimerase fluorescência desnaturação USO PREVISTO O produto é um teste qualitativo de amplificação dos ácidos nucleicos para a detecção do DNA da Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) em amostras de DNA extraído da primeira urina da manhã sem conservantes. 3 R Q 3 hibridação / detecção O produto é utilizado no diagnóstico e na monitorização da infecção por C. trachomatis, juntamente com os dados clínicos do paciente e com os resultados de outros exames de laboratório. R Q extensão 3 3 ELITe MGB e o logo ELITe MGB são registados como marcas comerciais na União Europeia. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 1/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 2/21

2 DESCRIÇÃO DO PRODUTO O produto fornece a mistura de reacção completa e pronta a usar "CHLA. tr. Q - PCR Mix " para a amplificação real time numa solução estabilizante, pré-aliquotada em quatro tubos. Cada tubo contém 540 µl de solução, suficiente para 25 testes. Os primers de oligonucleótidos e a sonda para C. trachomatis (estabilizada pelo grupo MGB, marcada com o fluoróforo FAM e inactivada pelo quencher não fluorescente) são específicos para uma região do gene dnab-like do plasmídeo endógeno de C. trachomatis e para uma região do gene ompa do cromossoma de C. trachomatis. Os primers de oligonucleótidos e a sonda para o Controlo Interno (estabilizada pelo grupo MGB, marcada com o fluoróforo AP525, equivalente a VIC, e inactivada pelo quencher não fluorescente) são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano codificante da beta-globina. A mistura de reacção fornece o tampão, o cloreto de magnésio, os nucleotídeos trifosfatos, o fluoróforo AP593, usado no lugar do ROX ou do Cy5 como "passive reference" para a normalização da fluorescência, a enzima Uracil-N-glucosidase (UNG) para a inactivação das contaminações do produto de amplificação e a enzima DNA polimerase Platinum Tfi exo- de activação térmica (hot start). O produto permite efectuar 100 determinações, incluindo standard e controlos. MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO Componente Descrição Quantidade Classificação dos perigos CHLA. tr. Q - PCR Mix mistura de reacção completa 4 x 540 µl - MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vórtex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerossol ou pontas estéreis de deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água bidestilada estéril. - Termostato programável com sistema óptico de detecção da fuorescência 7300 Real Time PCR System ou 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument calibrado como previsto pelo fabricante. OUTROS PRODUTOS NECESSÁRIOS Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, o controlo positivo de extracção, as microplacas para a amplificação e o controlo positivo de amplificação não estão incluídos neste produto. Para a extracção manual do DNA das amostras a analisar, aconselha-se a utilização dos produtos genéricos «EXTRAblood» (ELITechGroup S.p.A., código EXTB01), kit de extracção do DNA de amostras celulares e não celulares. Para a extracção automática do DNA das amostras a analisar, aconselha-se a utilização dos produtos genéricos «NucliSENS easymag Reagents» (biomérieux SA, códigos , , , , , ), kit de extracção dos ácidos nucléicos de amostras biológicas, com o instrumento «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, código ). Como controlo positivo de extracção de ácidos nucleicos de amostras não celulares e controlo de inibição, é exigida a utilização dos produtos genéricos «CPE-DNA - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTREXTG), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico ou «CPE - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA e RNA plasmídico. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 3/21 Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, aconselha-se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com poços de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, aconselha-se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com poços de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Como controlo positivo de amplificação, aconselha-se a utilização do produto principal «CHLAMYDIA tr. - ELITe Positive Control» (ELITechGroup S.p.A. código CTR098PLD), controlo positivo de DNA plasmídico. Amostras AMOSTRAS E CONTROLOS Este produto deve ser utilizado com DNA extraído a partir de amostras clínicas da primeira urina da manhã recolhidas sem conservantes. Primeira urina da manhã recolhida sem conservantes As amostras da primeira urina da manhã destinadas à extracção dos ácidos nucléicos devem ser colhidas em recipientes sem conservantes de acordo com as indicações do laboratório, transportadas à temperatura ambiente (+18 / +25 ºC) e conservadas à temperatura ambiente (+18 / +25 C) por um máximo de quatro horas ou, caso contrário, devem ser conservadas a +2 / +8 C por um máximo de três dias. Se possível, evite congelar amostras da primeira urina da manhã. A congelação pode causar a precipitação dos inibidores e lise das células com diminuição do título de DNA bacteriano. Nota: quando se realiza a extracção do DNA de amostras da primeira urina da manhã com o kit «EXTRAblood» seguir as indicações fornecidas no Manual de instruções para o uso, no tratamento das amostras clínicas: - com amostras frescas, partir de uma amostra de no máximo de células, adicionar 10 µl de CPE-DNA como controlo interno na fase inicial da extracção, recuperar o DNA com 100 µl de tampão de eluição. - com amostras congeladas, partir de uma amostra de no máximo 1 ml, centrifugar e ressuspender o depósito em 200 µl de solução fisiológica (não fornecida no produto), adicionar 10 µl de CPE-DNA como controlo interno na fase inicial da extracção, recuperar o DNA com 100 µl de tampão de eluição. Nota: quando se realiza a extracção do DNA de amostras da primeira urina da manhã com o instrumento «NucliSENS easymag» utilizar o protocolo de extracção Generic e seguir estas indicações: partir de uma amostra de 2 ml, centrifugar a RPM durante 10 minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o depósito em 200 µl de solução fisiológica (não fornecida no produto), transferir 200 µl de amostra para a Strip de 8 poços, colocar a Strip no instrumento e iniciar a extracção sem incubação para a lise; depois do instrumento ter adicionado o EasyMAG Lysis Buffer, misturar directamente no instrumento por três vezes o conteúdo da Strip com a pipeta multicanal fornecida, usando o programa 3; deixar incubar por 10 minutos e então adicionar NucliSENS easymag Magnetic Silica e 10 µl de CPE-DNA para o controlo interno ao conteúdo da Strip com a pipeta multicanal e o programa 3; prosseguir com a extracção; recuperar o DNA com 100 µl de tampão de eluição. Substâncias interferentes O DNA extraído da amostra inicial não deve conter mucoproteínas, etanol ou 2-propanol para evitar fenómenos de inibição e a possibilidade de frequentes resultados inválidos. Elevada quantidade de DNA genómico humano no DNA extraído da amostra pode inibir a reacção de amplificação. Não existem dados disponíveis acerca de eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, Anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 4/21

3 Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção para o controlo negativo e uma reacção para o controlo positivo. Como controlo negativo, utilize água bidestilada estéril (não fornecida no kit). Como controlo positivo, utilize os componentes «CHLAMYDIA tr. - ELITe Positive Control». Controlos de qualidade É aconselhável para a validação do todo o procedimento de análise de cada sessão, extracção e amplificação, a utilização de uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou de material de referência calibrado. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se pudessem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerossol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3 % pelo menos durante 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se pudessem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerossol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contêm ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e protecção para os olhos e rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de manipular as amostras e os reagentes. Eliminar os desperdícios de reagentes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler atentamente todas as instruções fornecidas no produto antes de realizar o teste. Respeitar as instruções fornecidas no produto durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do produto. Utilizar somente os reagentes presentes no produto e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não utilizar reagentes provenientes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal competente e instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados exclusivamente para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação para a área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas numa câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerossol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados numa câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados numa única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para Aerossol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a difusão no ar para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes A CHLA. tr. Q - PCR Mix deve ser conservada em ambiente escuro a -20 C. A CHLA. tr. Q - PCR Mix pode ser congelada e descongelada no máximo três vezes: ciclos de congelação / descongelação posteriores podem causar uma perda no rendimento do produto. A CHLA. tr. Q - PCR Mix não apresenta frases de risco (R) e apresenta os seguintes conselhos de segurança (S): S 23-24/25. Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos e com a pele. PROCEDIMENTO Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar a sessão, de acordo com a documentação do equipamento, é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computador, abrir o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para C. trachomatis, com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CHLA. TR."; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o controlo interno, com o "reporter" = "VIC" (AP525 é equivalente ao VIC) e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer poço em uso da microplaca, programar (Well Inspector) os "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (AP593 é usado em vez de ROX, normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação ou standard com a relativa quantidade conhecida). Preencher o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso e transcrever estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência para os poços da mistura de reacção e das amostras. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 5/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 6/21

4 Ilustra-se a seguir a título de exemplo, como pode ser organizada a análise qualitativa de 12 amostras. (Another CP is missing in the picture) C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 CN CP Legenda: C1 - C12: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; CP: controlo positivo de amplificação. De acordo com a documentação do equipamento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do thermal cycle: - acrescentar na fase de amplificação a passagem de extensão a 72 C (Add Step); Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada no passo de hibridação a 60 C. - modificar os tempos como indicado na tabela "Thermal cycle ; - programar um número de ciclos igual a 45; - programar o valor de volume para a simulação com software da transferência térmica na reacção ( Sample volume ) a 30 µl; Thermal cycle Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 94 C 2 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 94 C 10 seg. 60 C (aquisição da fluorescência) 30 seg. 72 C 20 seg. Caso se utilize um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar a sessão, de acordo com a documentação do equipamento, é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computador, abrir o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification" e programar Run mode: Fast 7500 ; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para C. trachomatis com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CHLA. TR."; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o controlo interno com o "reporter" = "VIC" (AP525 é equivalente ao VIC) e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer poço em uso da microplaca, programar (Well Inspector) os "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "Cy5" (AP593 é usado em vez de Cy5, normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação ou standard com a relativa quantidade conhecida). Preencher o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso e transcrever estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência para os poços da mistura de reacção e das amostras. A organização de uma análise qualitativa de 12 amostras é ilustrada como exemplo na secção anterior relativa ao procedimento para o instrumento 7300 Real Time PCR System. De acordo com a documentação do equipamento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do thermal cycle: - acrescentar na fase de amplificação o passo de extensão a 72 C (Add Step); Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada no passo de hibridação a 60 C. - modificar os tempos como indicado na tabela Thermal cycle ; - programar um número de ciclos igual a 45; - programar o valor de volume para a simulação com software da transferência térmica na reacção ( Sample volume ) a 30 µl; Thermal cycle Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 94 C 2 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 94 C 10 seg. 60 C (aquisição da fluorescência) 30 seg. 72 C 20 seg. Preparação da amplificação (Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los durante 5 segundos para reconduzir o conteúdo ao fundo e mantê-los em gelo; - retirar e descongelar os tubos CHLA. tr. Q - PCR Mix necessários para a sessão, lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 25 reacções. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los durante 5 segundos para reconduzir o conteúdo ao fundo e mantê-los em gelo; - retirar e descongelar um tubo de CHLA. tr. gen. - Positive Control (controlo positivo da reacção de amplificação real time específica para a região do gene ompa do cromossoma de C. trachomatis) e uma de CHLA. tr. pl. - Positive Control (controlo positivo da reacção de amplificação real time específica para a região do gene dnab-like do plasmídeo endógeno de C. trachomatis). Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los durante 5 segundos para reconduzir o conteúdo ao fundo e mantê-los em gelo; - retirar a Amplification microplate que será utilizada na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos nos poços. 1. Transferir, depositando cuidadosamente no fundo, sem criar bolhas, 20 µl de mistura de reacção CHLA. tr. Q - PCR Mix nos poços da Amplification microplate, como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20ºC no máximo um mês. Congelar e descongelar a mistura de reacção no máximo 3 VEZES. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 7/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 8/21

5 2. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de DNA extraído da primeira amostra no correspondente poço da Amplification microplate, como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem a amostra pipetando o DNA extraído três vezes na mistua de reacção. Evitar a criação de bolhas. Proceder do mesmo modo com todos os outros DNA extraídos. 3. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de Água bidestilada estéril (não fornecida no produto) no poço da Amplification microplate do controlo negativo de amplificação, como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem o controlo negativo pipetando por três vezes a Água bidestilada estéril na solução de reacção. Evitar a criação de bolhas. 4. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 20 µl de CHLA. tr. gen. - Positive Control no correspondente poço da Amplification microplate, como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Misturar bem o controlo pipetando por três vezes o CHLA. tr. gen. - Positive Control na solução de reacção. Evitar a criação de bolhas. Proceder do mesmo modo com o CHLA. tr. pl. - Positive Control. 5. Fechar cuidadosamente a Amplification microplate com a Amplification Sealing Sheet. 6. Colocar a Amplification microplate no thermal - cycler para real time na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação e iniciar o ciclo térmico de amplificação guardando a configuração da sessão com uma identificação única e reconhecível (p. ex. "ano-mês-dia-chla. tr.- ELITECHGROUP"). Nota: No fim do ciclo térmico a Amplification microplate (Microplaca de amplificação) com os produtos de reacção deve ser removida do equipamento e descartada para não gerar contaminações ambientais. Jamais levantar a Amplification Sealing Sheet da Amplification microplate de modo a evitar a saída dos produtos de reacção. Na figura a seguir é ilustrado em síntese o procedimento de preparação das reacções de amplificação. 1) acrescentar 20 µl de Q-PCR Mix 2) acrescentar 20 µl de DNA extraído 3) acrescentar 20 µl de Controlo Negativo 4) acrescentar 20 µl de Positive Control Análise qualitativa dos resultados Os valores registrdos da fluorescência emitida pela sonda específica para C. trachomatis (detector FAM "CHLA. TR.") e pela sonda específica para o Controlo Interno (detector VIC "CI") nas reacções de amplificação devem ser analisadas com o software do equipamento. Antes de iniciar a análise, de acordo com a documentação do equipamento, é necessário: - programar manualmente (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15; Nota: No caso de uma amostra positiva com um elevado título de C. trachomatis, a fluorescência FAM da sonda específica para C. trachomatis pode começar a aumentar antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluorescência FAM começar a aumentar (Results > Component). Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "CHLA. TR." a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,05. Caso tenha sido utilizado um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "CHLA. TR." a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,1. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reacção de amplificação e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para determinar o Ciclo Limiar (Threshold cycle, Ct), o ciclo em que foi alcançado o valor Limiar de fluorescência. Na reacção de amplificação com o CHLA. tr. gen. - Positive Control e CHLA. tr. pl. - Positive Control, os valores de Ct para C. trachomatis (Results > Report) são utilizados para validar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Reacção CHLA. tr. gen. - Positive Control detector FAM "CHLA.TR." Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 26 POSITIVO CORRECTA Reacção CHLA. tr. pl. - Positive Control detector FAM "CHLA.TR." Intervalo de aceitabilidade Amplificação / Detecção Ct 26 POSITIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação dos Positive Control é Ct > 26 ou Ct Não determinado (Undetermined) para C. trachomatis, não foi detectada correctamente a presença do DNA alvo. Isto significa que existiram problemas duante a fase de amplificação ou de detecção (distribuição incorrecta da mistura de reacção ou do controlo positivo, degradação da mistura de reacção ou do controlo positivo, programação incorrecta da posição do controlo positivo, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Na reacção de amplificação do Controlo negativo, o valor de Ct para C. trachomatis (Results > Report) é utilizado para validar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Reacção Controlo negativo detector FAM "CHLA. TR." Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct Não determinado NEGATIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Ct Não determinado (Undetermined) para C. trachomatis, foi detectada incorrectamente a presença do DNA alvo. Isto significa que existiram problemas a fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 9/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 10/21

6 Nas reacções de amplificação de cada amostra, o valor de Ct para C. trachomatis é utilizado para detectar a presença do DNA alvo, enquanto o valor de Ct para o Controlo Interno é utilizado para validar a extracção, a amplificação e a detecção. Nota: Verificar com o software do equipamento (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) que o Ct esteja a ser determinado por um rápido e regular aumento dos valores de fluorescência e não por picos ou aumento irregular do sinal de fundo. Este produto é capaz de detectar uma quantidade mínima de aproximadamente 6,6 cópias de DNA de C. trachomatis por reacção de amplificação, usando o kit de extracção «EXTRAblood» (veja as Características do desempenho na página 13). Não estão disponíveis materiais de referência de ordem superior ou aprovados pela OMS para C. trachomatis. Portanto, o limite de detecção deste teste foi determinado utilizando como material de referência calibrado um "proficiency panel" que foi testado por 163 laboratórios no QCMD 2009 C. trachomatis DNA (CTDNA09B) EQA Panel B (Qnostics, Escócia, Reino Unido). Os resultados como Ct das reacções de amplificação de cada amostra (Results > Report) são utilizados como descrito na tabela seguinte: detector FAM "CHLA. TR." Ct Não determinado Ct Determinado Reacção da amostra detector VIC "CI" Ct > 35 ou Ct Não determinado Idoneidade da amostra Resultado do teste DNA de C. trachomatis não idónea inválido - Ct 35 idónea válido, negativo Ct > 35 ou Ct Não determinado NÃO DETECTADO idónea válido, positivo DETECTADO Ct 35 idónea válido, positivo DETECTADO Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para C. trachomatis e Ct > 35 ou Ct Não determinado para o Controlo Interno, não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do Controlo Interno. Neste caso verificaram-se problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (degradação do DNA da amostra, perda do DNA durante a extracção ou presença de inibidores no extracto) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra. Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para C. trachomatis e Ct 35 para o Controlo Interno, o DNA de C. trachomatis não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de C. trachomatis esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja Características da perfomance na página 13). Neste caso o resultado será um falso negativo. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de C. trachomatis, a amplificação do Controlo Interno pode dar como resultado um Ct > 35 ou Ct Não determinado. No entanto, a reacção de amplificação com baixa eficiência do Controlo Interno pode ser anulada da competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de C. trachomatis. Neste caso a amostra de qualquer maneira é idónea e o resultado positivo do teste é válido. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO Utilizar com este produto somente o DNA extraído das seguintes amostras clínicas: primeira urina da manhã colhida sem conservantes. Não utilizar com este produto DNA extraído contaminado com mucoproteínas, etanol ou 2-propanol: estas substâncias inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e podem causar resultados inválidos. Não utilizar com este produto DNA extraído com elevadas quantidades de DNA genómico humano que podem inibir a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos. Não estão disponíveis dados pertinentes acerca de inibição causada por medicamentos antibióticos, Anti-virais, quimioterápicos ou imunossupressores. Não estão disponíveis dados referentes ao desempenho deste produto com o DNA extraído das seguintes amostras clínicas: zaragatoas cervicais e uretrais, esperma, líquido lacrimal. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta identificação, recolha, transporte, conservação e preparação das amostras. Para evitar resultados incorrectos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos. O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para CHLA. tr., dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. No entanto, as contaminações podem ser evitadas somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual. Este produto requer pessoal competente e instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer pessoal competente e instruído para os procedimentos de biologia molecular, tais como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos. Este produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Por causa das diferenças intrínsecas às diversas tecnologias, recomenda-se realizar estudos de correlação para estimar essas diferenças antes de passar para uma nova tecnologia. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de C. trachomatis não foi detectado no DNA extraído da amostra, mas não se pode descartar que o DNA de C. trachomatis esteja presente num título inferior ao limite de detecção do produto (ver Características do desempenho na página 13); neste caso o resultado será um falso negativo. Um resultado inválido obtido com este produto indica que não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do Controlo Interno; nesse caso, a análise da amostra deverá ser repetida a partir da extracção, com possíveis atrasos na obtenção do resultado. Eventuais polimorfismos na região do genoma bacteriano na qual se hibridam os primers de iniciação e a sonda do produto podem comprometer a detecção do DNA de C. trachomatis. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo de diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados inválidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco residual não pode ser eliminado ou reduzido. Este risco residual em situações particulares, como os diagnósticos pré-natais e de urgência, pode levar a decisões erradas com consequências potencialmente graves para o doente. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 11/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 12/21

7 Sensibilidade analítica: limites de detecção CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 6,6 cópias de C. trachomatis nos 20 µl de DNA adicionados à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste foi verificada utilizando um painel de diluições de C. trachomatis dentro da concentração-limite (0,5 log 10 entre uma diluição e a seguinte). O painel foi preparado utilizando amostras da primeira urina da manhã de voluntários presumivelmente negativas para o DNA de C. trachomatis tornadas positivas com o material de referência calibrado e certificado QCMD 2009 Chlamydia trachomatis DNA EQA Panel B (CTDNA09B, sorotipo LGV L2, Qnostics Ltd, Escócia, Reino Unido) com uma concentração de 316 cópias / extracção a 1 cópia / extracção. Cada amostra do painel foi utilizada em 24 repetições para realizar o procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. A análise estatística foi realizada com a regressão Probit. O limite de detecção foi definido como a concentração à qual a probabilidade de obter um resultado positivo é de 95%. Os resultados são apresentados nas tabelas a seguir. Limite de detecção com amostras da primeira urina da manhã e «EXTRAblood» (cópias / extracção) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% de positividade 21,0 cópias / extracção 12,2 cópias / extracção 57,1 cópias / extracção Limite de detecção com amostras da primeira urina da manhã e «EXTRAblood» (cópias / extracção) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% de positividade 4,2 cópias / extracção 2,4 cópias / extracção 11,4 cópias / extracção A conversão de cópias/extracção a cópias/reacção foi calculada dividindo por 5, pois 20 µl em 100 µl de DNA eluído são adicionados à reacção de amplificação. Sensibilidade analítica: intervalo linear de medida A sensibilidade analítica deste teste, permite identificar como amostras positivas com uma quantidade de DNA de aproximadamente a 10 moléculas nos 20 µl de DNA acrescentados à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste foi avaliada para ambas as reacções de amplificação real time específicas para C. trachomatis utilizando dois painéis de diluições (1 log 10 entre uma diluição e a seguinte) de dois DNAs plasmídicos, um contendo o produto de amplificação da região do gene dnab-like do plasmídeo endógeno de C. trachomatis, o outro contendo o produto de amplificação da região do gene ompa do cromossoma de C. trachomatis. As concentrações iniciais dos plasmídeos foram medidas no espectrofotómetro. As diluições dos dois painéis desde 10 7 moléculas por reacção até 10 1 moléculas por reacção foram testadas com 9 replicados para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. A análise dos dados obtidos, realizada com a regressão linear, demonstrou que o teste apresenta uma resposta linear para todas as diluições com ambos os painéis (coeficiente de correlação linear superior a 0,99). O intervalo dinâmico estende-se, portanto, de 10 moléculas por reacção a pelo menos de moléculas por reacção para ambas as reacções de amplificação. Neste intervalo, o coeficiente de variação percentual (CV%) médio dos valores de Ct foi inferior a 2% para ambas as reacções. Sensibilidade analítica: reprodutibilidade com painel de material de referência certificado A sensibilidade analítica do teste, como reprodutibilidade dos resultados em comparação com os resultados obtidos com outros métodos e em diferentes laboratórios, foi verificada com um painel de referência certificado. Os testes foram realizados utilizando-se como material de referência calibrado e certificado um painel de diluições de C. trachomatis dentro da concentração-limite (sorotipo LGV L2, QCMD 2009 Chlamydia trachomatis DNA EQA Panel B, Qnostics Ltd, Escócia, Reino Unido). Cada amostra do painel foi utilizada em 2 replicados realizando o procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados estão apresentados na tabela a seguir. Testes com material de referência certificado e «EXTRAblood» Amostra Patógeno, matriz Resultado esperado Positivas / Repet. Média Ct CTB09-01 C. trachomatis, urina positivo 2 / 2 33,30 CTB09-02 C. trachomatis*, urina forte positivo 2 / 2 25,10 CTB09-03 Negativo, urina negativo 0 / 2 Não Detectado CTB09-04 C. trachomatis, urina positivo 2 / 2 33,37 CTB09-05 C. trachomatis, urina forte positivo 2 / 2 28,92 CTB09-06 C. trachomatis, urina positivo 2 / 2 37,77 CTB09-07 C. trachomatis, urina positivo 2 / 2 34,78 CTB09-08 C. trachomatis, zaragatoa forte positivo 2 / 2 26,70 CTB09-09 C. trachomatis, zaragatoa fraco positivo 2 / 2 36,81 CTB09-10 C. trachomatis, zaragatoa positivo 2 / 2 33,51 *Swedish Variant. Todas as amostras foram detectadas correctamente. Sensibilidade de diagnóstico: eficiência de detecção e quantificação nos diferentes genótipos / subtipos A sensibilidade de diagnóstico do teste, como eficiência de detecção e quantificação dos diferentes genótipos / subtipos, foi avaliada pela comparação de sequências com bancos de dados de nucleotídeos. A análise das regiões seleccionadas, para a hibridação dos primers de oligonucleotídeos e da sonda fluorescente, no alinhamento das sequências disponíveis no banco de dados do gene dnab-like do plasmídeo endógeno de C. trachomatis, demonstrou a sua conservação e a ausência de mutações significativas nos seguintes sorotipos: A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, LGV1, LGV2, LGV3. A análise das regiões seleccionada para a hibridação dos primers de oligonucleotídeos e da sonda fluorescente, no alinhamento das sequências disponíveis no banco de dados para a delecção do plasmídeo endógeno de C. trachomatis (Ripa T., Nilsson P., Euro Surveill Nov 9; 11 (11): E ) demonstrou que essas regiões não estão envolvidas na deleção e, portanto, a reacção de amplificação pode ocorrer normalmente. A análise das regiões seleccionadas, para a hibridação dos primers de oligonucleotídeos e da sonda fluorescente, no alinhamento das sequências disponíveis no banco de dados do gene ompa do cromossoma de C. trachomatis demonstrou a sua conservação e a ausência de mutações significativas. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 13/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 14/21

8 Sensibilidade de diagnóstico: confirmação de amostras positivas A sensibilidade de diagnóstico do teste, como confirmação de amostras clínicas positivas, foi avaliada utilizando algumas amostras clínicas positivas para o DNA de C. trachomatis. A sensibilidade de diagnóstico foi avaliada utilizando como material de referência 80 amostras de células da primeira urina da manhã, positivas para o DNA de C. trachomatis (testadas com um produto CE IVD de amplificação em tempo real). Cada amostra foi testada para a realização do procedimento completo de análise, extracção manual «EXTRAblood» e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Células da primeira urina da manhã positivas para o DNA de C trachomatis Uma amostra deu um resultado negativo válido discordante, provavelmente por causa de um baixo título e do congelamento / descongelamento. A sensibilidade de diagnóstico do teste neste ensaio resultou superior a 98,7%. A sensibilidade de diagnóstico foi avaliada utilizando-se como material de referência 69 amostras de células da primeira urina da manhã positivas para o DNA de C. trachomatis (testadas com um produto CE IVD de amplificação em tempo real). Cada amostra foi testada para a realização do procedimento completo de análise, extracção automático «NucliSENS easymag» e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Células da primeira urina da manhã positivas para o DNA de C trachomatis Uma amostra deu um resultado negativo válido discordante, provavelmente por causa de um baixo título e do congelamento / descongelamento. A sensibilidade de diagnóstico do teste neste ensaio resultou superior a 98,6%. Especificidade analítica: ausência de reacção cruzada com marcadores potencialmente interferentes A especificidade analítica do teste, como ausência de reacção cruzada com outros marcadores potencialmente interferentes, foi avaliada pela comparação das sequências com bancos de dados de nucleótidos. A análise do alinhamento das sequências dos primers de oligonucleotídeos e da sonda fluorescente para a detecção do gene dnab-like do plasmídeo endógeno com as sequências disponíveis no banco de dados de organismos diferentes da C. trachomatis, entre os quais de Chlamydia muridarum e Chlamydophila pneumoniae, demonstrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. O exame do alinhamento das sequências dos primers de oligonucleotídeos e da sonda fluorescente para a detecção do gene ompa do cromossoma com as sequências disponíveis no banco de dados de organismos diferentes da C. trachomatis, entre os quais de Chlamydia psittaci e Chlamydophila pneumoniae, demonstrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. A especificidade analítica do teste, como ausência de reacção cruzada com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada utilizando-se algumas amostras clínicas negativas para o DNA de C. trachomatis mas positivas para o DNA de outros agentes patogénicos, que foram confirmadas como negativas. A especificidade analítica foi verificada utilizando como material de referência amostras de DNA extraído de culturas de Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium (Minerva Biolabs GmbH, Alemanha), Neisseria gonorrhoeae, Chlamydophila pneumoniae e Chlamydia psittaci (Vircell SL, Espanha). Estes microrganismos causam infecções urogenitais como C. trachomatis e encontram-se frequentemente nas mesmas amostras clínicas. Cada amostra foi testada para a realização do procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Ureaplasma urealyticum Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Neisseria gonorrhoeae Chlamydophila pneumoniae Chlamydia psittaci Especificidade de diagnóstico: confirmação de amostras negativas A especificidade de diagnóstico do teste, como confirmação de amostras negativas, foi avaliada utilizando-se algumas amostras negativas para o DNA de C. trachomatis. A especificidade de diagnóstico foi avaliada utilizando-se como material de referência 60 amostras de células da primeira urina da manhã, negativas para o DNA de C. trachomatis (testadas com um produto CE IVD de amplificação em tempo real). Cada amostra foi testada para a realização do procedimento completo de análise, extracção manual «EXTRAblood» e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Células da primeira urina da manhã negativas para o DNA de C. trachomatis Uma amostra deu um resultado inválido, provavelmente por causa de inibidores na amostra. Esta amostra não foi utilizada para o cálculo da especificidade de diagnóstico. A especificidade de diagnóstico do teste neste ensaio resultou superior a 98,3%. A especificidade de diagnóstico foi avaliada utilizando-se como material de referência 60 amostras de células da primeira urina da manhã, negativas para o DNA de C. trachomatis (testadas com um produto CE IVD de amplificação em tempo real). Cada amostra foi testada para a realização do procedimento completo de análise: extracção automático «NucliSENS easymag» e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Células da primeira urina da manhã negativas para o DNA de C. trachomatis A especificidade de diagnóstico do teste neste ensaio resultou superior a 98,3%. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 15/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 16/21

9 Robustez: ausência de contaminação cruzada A robustez do teste, como ausência de contaminação cruzada, foi verificada analisando-se os resultados de cinco sessões, em que amostras negativas para o DNA de C. trachomatis foram alternadas com amostras tornadas positivas para o DNA de C. trachomatis. Nenhuma amostra negativa para o DNA de C. trachomatis resultou em positiva. A ausência de contaminação cruzada foi verificada utilizando como material de referência células obtidas de amostras da primeira urina da manhã de voluntários presumivelmente negativos para o DNA de C. trachomatis e células da mesma amostra positivadas com os dois DNAs plasmídicos contendo os dois produtos de amplificação. Os dois plasmídeos foram adicionados num título de cópias/extracção (DNA plasmídico com amplicon dnab-like) e cópias/extracção (DNA plasmídico com amplicon ompa), de modo a simular uma amostra com um título de cópias de C. trachomatis. Cinco séries de 12 amostras, alternando-se uma amostra positiva com uma amostra negativa, foram testadas para a realização do procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Células da primeira urina da manhã negativas para o DNA de C. trachomatis Células da primeira urina da manhã positivadas para o DNA de C. trachomatis Robustez: taxa global de erros do sistema A robustez do ensaio, como taxa global de erro do sistema que leva a resultados falsos negativos, foi verificada realizando-se a análise de um painel de amostras tornadas positivas para o DNA de C. trachomatis com baixo título e com resultado inferior a 1,7%. A taxa global de erro foi verificada utilizando como material de referência células obtidas de amostras da primeira urina da manhã de voluntários presumivelmente negativos para o DNA de C. trachomatis positivadas com o material de referência certificado e calibrado para o DNA de C. trachomatis (QCMD 2009 Chlamydia trachomatis DNA EQA Panel B, Qnostics Ltd, Escócia, Reino Unido) num título de 100 cópias/extracção. Cada amostra do painel foi testada para a realização do procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são mostrados na tabela a seguir. Células da primeira urina da manhã positivizadas para o DNA de C. trachomatis Nota: Os dados e resultados completos dos ensaios realizados para a avaliação das características do desempenho do produto com as matrizes e os equipamentos estão registados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "", FTP. BIBLIOGRAFIA Østergaard L. et al. (1990) J Clin Microbiol 28: K.S. Sriprakash et al. (1987) Plasmid 18: Tam J. E. et al. (1992) Plasmid 27: L. J. Hayes et al. (1990) J Gen Microbiol 136: E. A. Lukhtanov et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35: e30 PROBLEMAS E SOLUÇÕES DNA alvo não detectado na reacção do Controlo Positivo Possíveis causas Soluções Dispensar com atenção os reagentes na microplaca seguindo o plano de trabalho. Incorrecta distribuição na microplaca. Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar os volumes de controlo positivo dispensados. Degradação da sonda. Degradação do controlo positivo. Erro na programação do equipamento. Utilizar uma nova alíquota de mistura de reacção. Utilizar uma nova alíquota do controlo positivo. Controlar a posição das reacções do controlo positivo programada no equipamento. Controlar o ciclo térmico programado no equipamento. DNA alvo detectado na reacção do Controlo negativo Possíveis causas Soluções Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Incorrecta distribuição na microplaca. Dispensar com atenção as amostras, controlo negativo e controlo positivo na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar a posição de amostras, controlo negativo e Erro durante a programação do equipamento. controlo positivo programada no equipamento. Microplaca mal fechada. Contaminação da água bidestilada estéril. Contaminação da mistura de reacção. Contaminação da área para a extracção / preparação das reacções de amplificação. Fechar cuidadosamente a microplaca. Utilizar uma nova alíquota de água estéril. Utilizar uma nova alíquota de mistura de reacção. Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquosos, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Presença de fluorescência de fundo irregular ou elevada nas reacções Possíveis causas Soluções Ter atenção, pipetando três vezes, quando se misturaram Incorrecta distribuição da amostra. as amostras, controlo negativo e controlo positivo na mistura de reacção. Evitar a criação de bolhas. Programar o intervalo de cálculo da "baseline" num âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja estabilizada (controlar os registos "Results", "Component") Erro na programação da "baseline". e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a aumentar, por exemplo do ciclo 6 ao ciclo 15. Configurar o cálculo automático da "baseline" seleccionando a opção "autobaseline". SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 17/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 18/21

10 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS AVISO PARA O COMPRADOR: LICENÇA LIMITADA 0344 Número do catálogo. Limite superior de temperatura. Código do lote. Para utilizar antes do (último dia do mês). Dispositivo médico de diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos de diagnósticos in vitro. Certificada pela DEKRA Certification B.V., the Netherlands. Conteúdo suficiente para "N" teste. Este produto é vendido com base no contrato de licença entre a Epoch Biosciences, LLC e suas afiliadas e a Life Technologies, Inc. O preço de compra deste produto inclui os direitos - limitados e não transferíveis - de utilizar somente esta quantidade de produto, unicamente para actividades do comprador que sejam directamente ligadas ao diagnóstico humano. Para informações sobre a compra de uma licença para este produto para fins diferentes dos especificados acima, contactar o Licensing Department de Life Technologies, Inc., 5791 Val Allen Way, Carlsbad, CA outlicensing@lifetech.com. Os reagentes de detecção ELITe MGB são cobertos por uma ou mais das patentes US número 5,801,155, 6,127,121, 6,312,894, 6,426,408, 6,485,906, 6,492,346, 6,660,845, 6,699,975, 6,727,356, 6,790,945, 6,949,367, 6,972,328, 7,045,610, 7,319,022, 7,368,549, 7,381,818, 7,556,923, 7,662,942, 7,671,218, 7,715,989, 7,723,038, 7,759,126, 7,767,834, 7,794,945, 7,897,736, 8,008,522, 8,067,177, RE 38,416 e das patentes EP número , , , e bem como por pedidos de patentes que actualmente estão pendentes. A compra deste produto implica numa licença limitada, não transferível e não exclusiva (sem o direito de revender, reembalar ou sublicenciar) com base nas patentes U.S. número 6,030,787, 5,723,591 e 5,876,930 e nas correspondentes patentes estrangeiras, unicamente para usar este produto num ensaio em que a detecção de uma sequência de um ácido nucléico não inclua o corte de uma sonda de ácido nucléico, com exclusão de qualquer outra finalidade. Nenhuma outra licença com base nestas patentes ou qualquer outra patente é atribuída, expressamente, implicitamente ou excepcionalmente. Esta licença limitada permite à pessoa ou à entidade legal à qual este produto foi fornecido, de usar o produto e os seus dados gerais, somente para o diagnóstico humano. Nem a ELITechGroup S.p.A., nem os seus licenciados atribuem qualquer outra licença, explícita ou implícita para qualquer outra finalidade. Atenção, consultar as instruções de uso. CONT Conteúdo. Manter distante da luz solar. Fabricante. «NucliSENS easymag» são marcas registadas da biomérieux. SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 19/21 SCH m_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 20/21