NOTICE of CHANGE dated 18/03/16

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: NOTICE of CHANGE dated 18/03/16 IMPORTANT COMMUNICATION FOR THE USERS OF PRODUCT: ref. Following the new packaging of the kit, some changes were introduced in the Instruction for Use Manual (IFU) SCH m. - With the new packaging, the complete kit the product supplies only these components: «CMV AmpliMIX» and «CMV AmpliPROBE». When order ref. will be supplies olso following components: «Q - PCR Alert AmpliMASTER», «Q- CMV AmpliStandard» e «CPE - Internal Control» necessary for the assay. Detailed indications are reported in the enclosed Instructions for Use (IFU). The assay analytical principle and test reagents are unchanged. PLEASE NOTE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT Notice of Change SCH m dated 18/03/16 Pag. 1/1

2 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: Ref. Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: (CMV. AmpliMIX) (CMV. AmpliPROBE) Q - PCR Alert AmpliMASTER -M (RTS015-MM) (RTS015-MP) RTS000 -M_Front

3 0344 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO KIT pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 3 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 4 OTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 4 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 4 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 6 PROCEDIMENTO pág. 7 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 15 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 16 BIBLIOGRAFIA pág. 23 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 24 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 25 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: C O produto é um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e dosagem do DNA do Citomegalovírus humano (CMV) em amostras de DNA extraído do plasma colhido em EDTA, liquido amniótico, sangue total periférico colhido em EDTA, suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos. O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e no monitoramento da infecção de CMV. PRINCÍPIO DO TESTE O teste prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável incluído de sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para amplificação real time). Em cada pocinho se efectua uma reacção de amplificação específica para uma região do gene MIEA de CMV e para uma região do gene humano da beta-globina (Controlo Interno de inibição) utilizando o DNA extraído das amostras em exame. A sonda específica para CMV marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para CMV. A sonda específica para o Controlo Interno marcada com o fluoróforo VIC é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o Controlo Interno. A emissão da fluorescência aumenta com o aumentar dos produtos específicos da reacção de amplificação e é medida e registrada pelo equipamento. A elaboração dos dados permitem determinar a presença e a titulação do DNA de CMV na amostra de partida. A validação do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems da série DESCRIÇÃO DO KIT O kit completo fornece os seguintes componentes. CMV AmpliMIX Uma mistura de oligonucleotídeos primers para amplificação real time numa solução estabilizada, previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. Cada oligonucleotídeos de primers para CMV são específicos para uma região do exon 4 do gene MIEA de CMV (major immediate early antigen, HCMVUL123). Os oligonucleotídeos de primers para o Controlo Interno de inibição são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano da beta-globina. CMV AmpliPROBE Uma mistura de sondas fluorescentes para amplificação real time numa solução estabilizada, previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. A sonda para CMV é marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada pelo grupo MGB -NFQ. A sonda para CMV é específica para uma região do exon 4 do gene MIEA de CMV. A sonda para o Controlo Interno de inibição é marcada com o fluoróforo VIC e bloqueada pelo grupo MGB -NFQ. As sondas para o controlo interno de inibição específica para as regiões promotoras e 5' UTR do gene humano da beta-globina. O kit permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO KIT Componente Descrição Quantidade Classificação e etiquetagem CMV AmpliMIX CMV AmpliPROBE mistura de oligonucleotídeos primers Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB-NFQ e com VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl - 4 x 110 µl - SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 1 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 2 / 25

4 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água bidestilada estéril. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência Applied Biosystems da série 7000, calibrado como previsto pelo fabricante. OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, el control positivo de extracción, os reagentes optimizados para a amplificação e el DNA standard a quantidade reconhecida não estão incluídos neste kit. Para a extracção manual do DNA das amostras celulares, recomenda-se o uso do produto genérico «EXTRAcell» (ELITechGroup S.p.A., código EXTD02), kit de extracção do DNA de amostras celulares. Para a extracção manual do DNA das amostras celulares, recomenda-se o uso do produto genérico «EXTRAgen» (ELITechGroup S.p.A., código EXTG01), kit de extracção dos ácidos nucleicos de amostras não celulares. Para a extracção automática do DNA das amostras celulares, recomenda-se a utilização dos produtos genéricos «NucliSENS easymag Reagents» (biomérieux SA, códigos , , , , , ), kit de extracção dos ácidos nucleicos de amostras biológicas, com o instrumento «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, código ). Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, aconselha-se a utilização do produto genérico Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, aconselha-se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com poços de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. «CPE - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTRCPE), controlo positivo de extracção, uma solução estabilizada contendo dois DNA plasmídico e RNA genómico de fago MS2 para sistemas de extracção do RNA a partir de amostras biológicas celulares e não celular. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (ELITechGroup S.p.A., código RTS000), mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time e a determinação alélica. No caso em que seja solicitado um resultado quantitativo da análise (dosagem do DNA de CMV) «CMV tr. Q - PCR Standard» (ELITechGroup S.p.A., código STD015), DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler atentamente todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não utilizar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal competente e instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e equipamentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e equipamentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados numa única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes Os tubos que contenham o AmpliMIX e o AmpliPROBE são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 3 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 4 / 25

5 Amostras AMOSTRAS E CONTROLOS Este produto deve ser utilizado com as seguintes amostras biológicas: Plasma colhido em EDTA, liquido amniótico, sangue total periférico colhido em EDTA, suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos. Plasma colhido em EDTA As amostras de plasma destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas, em caso contrário devem ser congeladas e conservadas a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Para uma óptima conservação das amostras aconselha-se subdividí-las (volume mínimo 300 µl) e de conservá-las congeladas a -20ºC por um período máximo de 30 dias ou ainda a -20ºC por um período mais longo. Evitar submeter as amostras a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Quando se utilizam amostras congeladas, proceder ao descongelamento imediato, antes do início da extracção para evitar fenómenos de degradação dos ácidos nucléicos. Acrescentar 5 µl de CPE às amostras de plasma para o controlo interno antes de extrair o DNA como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAgen». Liquido amniótico As amostras de liquido amniótico destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas, em caso contrário devem ser congeladas e conservadas a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Para uma óptima conservação das amostras aconselha-se subdividí-las em mais aliquotas (volume mínimo 300 µl). Evitar submeter as amostras a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Quando se utilizam amostras congeladas, proceder ao descongelamento imediato, antes do início da extracção para evitar fenómenos de degradação dos ácidos nucléicos. Acrescentar 5 µl de CPE às amostras de liquido amniótico para o controlo interno antes de extrair o DNA como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAgen». Sangue total periférico colhido em EDTA As amostras de sangue total periférico destinados à extracção do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de três dias. Não congelar as amostras de sangue total periférico para evitar a lysine das células e a perda da titulação viral. Nota: quando se realiza a extracção manual do DNA com o kit «EXTRAcell», as amostras de Sangue total periférico devem ser pré-tratadas e o DNA deve ser extraído como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell». Nota: quando se realiza a extracção do DNA com o instrumento «NucliSENS easymag», utilize o protocolo de extracção Generic e siga estas indicações: coloque 100 µl de amostra na Strip de 8 poços, carregue a Strip no instrumento e inicie a extracção sem incubação para a lise; depois que o instrumento adicionou o EasyMAG Lysis Buffer, misture directamente no instrumento por três vezes o conteúdo da Strip com a pipeta multicanal fornecida, usando o programa 3; deixe incubar por 10 minutos e então adicione o EasyMAG Magnetic Silica ao conteúdo da Strip com a pipeta multicanal e o programa 3; prossiga com a extracção; recupere o DNA com 55 µl de tampão de eluição. Substâncias interferentes As amostras de plasma e de sangue total periférico não devem conter heparina. A heparina é um potente inibidor da DNA polimerase. As amostras de plasma, as suspensões de leucócitos e as suspensões de granulócitos não devem conter Ficoll, dextrano ou Hemoglobina. Estas substâncias podem causar a inibição da DNA polimerase. A quantidade de DNA genómico humano elevadas no DNA extraído da amostra podem inibir a reacção de amplificação. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos anti-virais, como Ganciclovir o Foscarnet, quimioterápicos ou imunosupressores. Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção de controlo negativo e uma reacção de controlo positivo. Para o controlo negativo utilizar 5 µl de água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controlo positivo utilizar 5 µl de AmpliSTANDARD, como descrito na secção seguinte. Controlos de qualidade É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado. PROCEDIMENTO Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar a sessão referindo-se à documentação do equipamento é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, iniciar o software apropriado e abrir uma sessão "absolute quantitation"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para CMV com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CMV"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o Controlo Interno com o "reporter" = "VIC" e o "quencher" = "none" (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar (Well Inspector) o "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação, standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos poços da mistura de reacção e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA nas amostras de partida é necessário preparar uma série de reacções com o DNA standard a quantidade reconhecida (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. Suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos As amostras de leucócitos e as amostras de granulócitos destinadas à extracção do DNA devem ser preparadas segundo as indicações do laboratório, suspendidas em Solução fisiológica estéril ou PBS estéril, contadas e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas. Não congelar as suspensões de leucócitos e as suspensões de granulócitos para evitar a lysine das células e a perda da titulação viral. O DNA deve ser extraído das suspensões de leucócitos e das suspensões de granulócitos como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell». SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 5 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 6 / 25

6 Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise quantitativa de 12 amostras. C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 CN Significado: C1 - C12: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; 10 2 : Standard 10 2 cópias; 10 3 : Standard 10 3 cópias; 10 4 : Standard 10 4 cópias; 10 5 : Standard 10 5 cópias. - Referindo-se à documentação do equipamento, programar no thermal cycler (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico indicando 45 ciclos e um volume de reacção de 25 µl e, se possível, escolher a opção "9600 emulation". Ciclo térmico de amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 mín. Desnaturação inicial 95 C 10 mín. 45 ciclos 95 C 15 seg. 60 C 1 mín. Caso se utilize um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar a sessão, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification" e programar Run mode: Fast 7500 ; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para CMV com o "reporter" = "FAM" e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CMV"; - programar (Detector Manager) o "detector" para a sonda para o controlo interno com o "reporter" = "VIC" (AP525 é equivalente ao VIC) e o "quencher" = "none" (não fluorescente) e chamá-lo "CI"; - para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar (Well Inspector) os "detector" (tipo de fluorescência para medir), o "passive reference" = "ROX" (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação ou standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos poços da mistura de reacção e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA na amostra de partida é necessário preparar uma série de reacções com os Q - PCR Standard (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. A modalidade de organização de uma análise quantitativa de algumas amostras é ilustrada como exemplo na secção anterior relativa ao procedimento para o instrumento 7300 Real Time PCR System. Referindo-se à documentação do instrumento, programar no software específico (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico: - acrescentar na fase de amplificação a passagem de extensão em 72 C (Add Step); Nota: a aquisição da fluorescência (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve ficar programada na passagem de hibridação em 60 C. - modificar os tempos como indicado na tabela a seguir; - programar um número de ciclos igual a 45; - programar um volume de reacção igual a 30 µl; Ciclo térmico Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. Amplificação e detecção (45 ciclos) 95 C 15 seg. 60 C (aquisição da fluorescência) 45 seg. 72 C 15 seg. Preparação da amplificação (Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Agitar delicadamente os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necessários para a sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reacções. Agitar delicadamente os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar um número de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Escrever "CMV" e a data na etiqueta dos tubos com tinta indelével. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar os tubos de AmpliSTANDARD necessários. Agitar delicadamente os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - ter Amplification microplate na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos poços. 1. Transferir 100 µl de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 2. Transferir 100 µl de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 3. Misturar por 5 segundos com o vortex a baixa velocidade, evitando produzir espuma. 4. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo. 5. Como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µl da mistura de reacção assim obtida nos poços da Amplification microplate. Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20º C por um máximo de um mês no tubo "CMV". Congelar e descongelar a mistura de reacção somente uma vez. 6. Como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 5 µl de DNA extraído da primeira amostra no correspondente pocinho da Amplification microplate, proceder igualmente com todos os outros DNA extraídos. 7. Como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de Água bidestilada estéril (não fornecida no kit) no pocinho da Amplification microplate do controlo negativo de amplificação. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 7 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 8 / 25

7 8. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de AmpliSTANDARD 10 2 cópias no correspondente pocinho da Amplification microplate como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Proceder do mesmo modo com os demais AmpliSTANDARD (10 3, 10 4, 10 5 cópias). 9. Fechar cuidadosamente a Amplification microplate com a Amplification Sealing Sheet. 10. Transferir a Amplification microplate no thermal - cycler para real time na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação e iniciar o ciclo térmico de amplificação salvando a configuração da sessão com uma identificacão única e reconhecivel (p.ex. "ano-mês-dia-cmv- EGSpA"). Nota: Ao término do ciclo térmico a Microplaca de amplificação deve ser removida do equipamento e eliminada para não gerar contaminações ao ambiente de trabalho com os produtos de reaccão. Jamar levantar a Amplification Sealing Sheet da Amplification microplate de modo a evitar a saída dos produtos de reacção. Análise qualitativa dos resultados Os valores registrados da fluorescência emitidos pela sonda específica para CMV (fluorescência FAM "CMV") e da sonda específica para a beta globina (fluorescência VIC "CI") nas reacções de amplificação devem ser analisadas pelo software apropriado. Antes de iniciar a análise, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: - programar manualmente (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15*; *Nota: No caso de uma amostra positiva a alta titulação de CMV, a fluorescência FAM da sonda específica para CMV pode iniciar a crescer antes do 15º ciclo. Neste caso o intervalo de cálculo da Nível de fluorescência de fundo deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluorescência FAM começa a crescer, por exemplo o ciclo 10 (Results > Component). Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "CMV" a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,1. Caso tenha sido utilizado um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM "CMV" a 0,1; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,05. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reacção de amplificação e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para determinar o Ciclo Limiar (Threshold cycle, Ct), o ciclo em que foi alcançado o valor Limiar de fluorescência. Os valores de Ct da sonda específica para CMV nas reacções de amplificação dos quatro AmpliSTANDARD a quantidade reconhecida são utilizados para calcular a Curva standard (Standard Curve) da sessão de amplificação e para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela seguinte: Reacção Q - PCR Standard 10 5 CMV (FAM CMV ) Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 25 POSITIVO CORRECTA Curva Standard CMV (FAM "CMV") Intervalo de aceitabilidade Amplificação / Detecção Coeficiente de Correlação (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação dos Q - PCR Standard 10 5 é Ct > 25 ou Ct Não determinado (Undetermined) ou se o valor do Coeficiente de correlação (R2) não entra nos limites, não foi detectada correctamente a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação ou de detecção (deslocamento incorrecto da mistura de reacção ou do controlo positivo, degradação da mistura de reacção ou do controlo positivo, programação incorrecta da posição do controlo positivo, programação incorrecta do ciclo térmico) que podem causar resultados incorrectos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 9 / 25 Os valores de Ct da sonda específica para CMV (Results > Report) na reacção de amplificação do Controlo negativo são utilizados para confirmar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Ciclo limiar do Controlo negativo CMV (FAM "CMV") Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct Não determinado NEGATIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Ct Não determinado, (Undetermined), foi detectada a presença do DNA alvo. Se são verificados problemas na fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Nas reacções de amplificação de cada amostra, os valores de Ct da sonda específica para CMV são utilizados para detectar a presença de DNA alvo. Nas reacções de amplificação de cada amostra, os valores de Ct da sonda específica para o Controlo Interno são utilizados para confirmar a extracção, a amplificação e a detecção. Nota: Verificar com o software do equipamento (Results, Amplification plot, delta Rn vs Cycle) que o Ct esteja determinado por um rápido e regular aumento dos valores de fluorescência e não por fenómenos de pico ou aumento do sinal de fundo. Este kit está em condições de detectar uma quantidade mínima de 10 cópias de DNA do gene MIEA de CMV para reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção, usando kits de extração «EXTRAcell» ou «EXTRAgen» (veja "Características da performance"). Os resultados relativos para cada amostra (Results > Report) são utilizados para a pesquisa de CMV, como descrito na tabela seguinte: CMV (FAM "CMV") Não determinado Determinado Ciclo limiar da amostra beta-globina (VIC "CI") Ct > 35 ou Não determinado Idoneidade da amostra Resultado do teste DNA de CMV não idóneo não válido - Ct 35 idóneo válido, negativo Ct > 35 ou Não determinado NÃO DETECTADO Idóneo* válido, positivo DETECTADO Ct 35 idóneo válido, positivo DETECTADO Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para a sonda especifica para CMV e Ct > 35 ou Ct Não determinado para a sonda especifica para o Controlo Interno, não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do gene humano do Controlo Interno. Neste caso se são verificados problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (ausência ou perdas de DNA ou presença de inibidores) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra. Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra, é Ct Não determinado para a sonda especifica para CMV e Ct 35 para a sonda especifica para o Controlo Interno, o DNA de CMV não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de CMV esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja "Características da perfomance"). Neste caso o resultado será um falso negativo. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 10 / 25

8 *Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de CMV, a amplificação do Controlo Interno pode dar como resultado um Ct > 35 ou Não determinado. No entanto a reacção de amplificação com baixa eficiência do Controlo Interno pode ser anulada da competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de CMV. Neste caso a amostra de qualquer maneira é idónea e o resultado do teste é válido. Análise quantitativa dos resultados Depois de ter realizado o procedimento para a análise qualitativa é possível desenvolver a análise quantitativa dos resultados relativos às amostras positivas. Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para CMV nas reacções de amplificação de cada amostra e a Curva standard da sessão de amplificação são utilizados para calcular a Quantidade (Quantity) de DNA alvo presente nas reacções de amplificação relativas às amostras. Este kit está em condições de dosar de a 20 cópias de DNA do gene MIEA de CMV para reacção de amplificação, correspondentes aos genomas Equivalentes para reacção, usando kits de extração «EXTRAcell» ou «EXTRAgen» (veja "Características da perfomance") como descrito na tabela seguinte: Resultado da amostra CMV (FAM "CMV") genomas Equivalentes de CMV por reacção Quantidade > 1 x 10 6 SUPERIORES A x 10 1 Quantidade 1 x 10 6 = Quantidade Quantidade < 2 x 10 1 INFERIORES A 20 Os resultados (Quantidade) das reacções de amplificação relativas as amostras (Results > Report) são utilizadas para calcular o número de genomas Equivalentes (geq) de CMV presentes na amostra de partida (Nc) segundo esta fórmula: Ve x Quantidade Nc (geq / ml) = Vc x Va x Ee Onde: Vc é o volume da amostra usado na extracção em relação à unidade de medida necessária; Ee é a eficiência da extracção expressa em decimais; Ve é o volume total obtido da extracção expressado em µl; Va é o volume do produto de extracção usado na reacção de amplificação expressado em µl; Quantidade é o resultado da reacção de amplificação relativa à amostra expressado em geq para reacção. Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAgen» e se quer obter o resultado expressado em geq / ml, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «EXTRAgen» Vc = 0,3 ml Ee = 0,8 (eficiência média de 80%) Ve = 15 µl Va = 5 µl 15 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,3 x 5 x 0,8 Nc (geq / ml) = 12,5 x Quantidade Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAcell», começando de células seguindo as instruções do manual de instruções para o uso e se quer obter o resultado expressado em geq / células, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «EXTRAcell» Vc = 5 ( células equivalente a 5 vezes a unidade de células) Ee = 1,0 (eficiência média de 100%) Ve = 100 µl Va = 5 µl 100 x Quantidade Nc (geq / células) = 5 x 5 x 1,0 Nc (geq / células) = 4 x Quantidade Quando se utiliza o sistema de extracção «EXTRAcell» e se quer obter o resultado expressado em geq / extracção, omit Vc, a fórmula torna-se: Fórmula simplificada para «EXTRAcell» Vc omit Ee = 1,0 (eficiência média de 100%) Ve = 100 µl Va = 5 µl 100 x Quantidade Nc (geq / extracção) = 5 x 1,0 Nc (geq / extracção) = 20 x Quantidade Quando se utilizam amostras de sangue total colhido em EDTA e o kit de extracção «NucliSENS easymag» e se deseja obter o resultado expresso em geq / ml, a fórmula é a seguinte: Fórmula simplificada para sangue total e «NucliSENS easymag» Vc = 100 µl Ee = 0,9 (eficiência média de 90%) Ve = 55 µl Va = 5 µl 55 x Quantidade Nc (geq / ml) = 0,1 x 5 x 0,9 Nc (geq / ml) = 122,2 x Quantidade Conversão dos resultados às Unidades Internacionais Quando se utilizam amostras de plasma colhido em EDTA e o kit de extracção «EXTRAgen» e se deseja obter o resultado expresso em UI / ml, a fórmula é a seguinte: Fórmula simplificada para plasma «EXTRAgen» Fc = 0,76 UI / geq Nc (UI / ml) = Nc (geq / ml) x Fc Nc (UI / ml) = 9,5 x Quantidade SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 11 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 12 / 25

9 Quando se utilizam amostras de sangue total colhido em EDTA e o kit de extracção «NucliSENS easymag» e se deseja obter o resultado expresso em UI / ml, a fórmula é a seguinte: Fórmula simplificada para Sangue total e «NucliSENS easymag» Fc = 0,86 UI / geq Nc (UI / ml) = Nc (geq / ml) x Fc Nc (UI / ml) = 105,1 x Quantidade Onde Fc é o factor de conversão estabelecido utilizando-se o material de referência calibrado aprovado pela OMS "1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques", NIBSC, Reino Unido, código 09/162 (veja as Características da perfomance ). LIMITES DO PROCEDIMENTO Utilizar precisamente com este produto o DNA extraído das seguintes amostras humanas: Plasma colhido em EDTA, liquido amniótico, sangue total periférico colhido em EDTA, suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos. Não utilizar com este produto o DNA extraído das amostras heparinizadas: A heparina inibe a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e causa resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído contaminado com Ficoll dextrano e hemoglobina. Estas substâncias inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos podendo causar resultados não válidos. Não utilizar com este produto DNA extraído com elevadas quantidades de DNA genómico humano que podem inibir a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos. Não estão disponíveis dados referentes às prestações deste produto com o DNA extraído das seguintes amostras líquido cefalorraquidiano (liquor). Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antivirais, como o Ganciclovir ou o Foscarnet, quimioterápicos ou imunosupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta identificação, recolecção, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorrectos, é necessário portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos. O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para o DNA de CMV, dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenómenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual. O uso deste produto requer pessoal competente e instruído para as manipulações de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificados como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. O uso deste produto requer a utilização de roupa de trabalho e a existência de área de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o usuário ou outras pessoas. O uso deste produto requer pessoal competente e instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos. O uso deste produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. O uso deste produto requer roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de CMV não está detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA de CMV esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja "Características da perfomance "); neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco resíduo não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco resíduo em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões incorrectas com com consequências graves para o paciente. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 13 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 14 / 25

10 Sensibilidade analítica: limites de detecção CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA solução branco nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como limite de detecção, está determinada utilizando dois painéis de diluição de CMV (grupo AD169) dentro da concentração limite. Cada amostra dos painéis foi empregada em 29 ou em 14 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação (veja parágrafo no produtos acessórios). As análises estatísticas dos dados obtidos foi realizada com a regressão Probit. Os limites de detecção foram calculados para a concentração às quais tem 95% e 50% de probabilidade de obter um resultado positivo. Para as amostras celulares o limite de detecção está determinado utilizando como material de referência calibrado um painel de plasmas (PeliCheck CMV-DNA-99, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos, ex VQC International) que foi acrescentado à célula negativa para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA) no modo de obter uma carga viral para geq/ extracção a 1gEq / extracção. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Limite de detecção com amostras celulares e «EXTRAcell» (geq / extracção) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% positividade 169 geq / extr. 105 geq / extr. 349 geq / extr. 50% positividade 25 geq / extr. 18 geq / extr. 35 geq / extr. Limite de detecção com amostras celularese e «EXTRAcell» (geq / reacção) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% positividade 8,5 geq / reac. 5,3 geq / reac. 17,5 geq / reac. 50% positividade 1,3 geq / reac. 0,9 geq / reac. 1,8 geq / reac. Para as amostras não celulares o limite de detecção está determinado utilizando como material de referência calibrado um painel de plasmas (PeliCheck CMV-DNA-99, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos) com uma concentração para geq/ ml a 1 geq/ ml. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Limite de detecção com amostras não celulares e «EXTRAgen» (geq / ml) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% positividade 164 geq / ml 105 geq / ml 348 geq / ml 50% positividade 32 geq / ml 24 geq / ml 44 geq / ml Sensibilidade analítica: intervalo linear de medida A sensibilidade analítica deste teste permite determinar uma titulação de a 20 moléculas de DNA solução branco nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como intervalo linear de medida, foi determinada utilizando um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a sucessiva) de DNA plasmídico que contém o produto de amplificação cuja concentração inicial foi medida com o espectrofotómetro. Os pontos do painel para 10 7 moléculas para reacções de 10 1 moléculas para reacção foram empregadas em 9 repetições para realizar a amplificação. A análise dos dados obtidos, realizada com a regressão linear, demonstrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação linear superior a 0,99). A sensibilidade analítica do teste, como intervalo linear de medida, foi verificada utilizando dois painéis de diluições (0,5 log10 entre uma diluição e a sucessiva) de CMV. Cada amostra dos painéis foi empregada em 29 ou em 14 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação. A análise dos dados obtidos, foi realizada com a regressão linear limitando a recta aos pontos que apresentam 100% de positividade e que originam um coeficiente de correlação linear superior a 0,99). Para as amostras celulares o intervalo linear de medida foi verificado como material de referência calibrado um painel de plasmas (PeliCheck CMV-DNA-99, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos) que foi acrescentado à célula negativa para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA) no modo de obter uma carga viral para geq/ extracção a 1gEq / extracção. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Intervalo linear de medida com amostras celulares e «EXTRAcell» ( Limite inferior Limite superior geq / extracção ** geq / reacção 15, * Para as amostras não celulares o intervalo linear de medida foi verificado utilizando como material de referência calibrado um painel de plasmas (PeliCheck CMV-DNA-99, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos) com uma concentração para geq/ ml a 1 geq/ ml. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Intervalo linear de medida com amostras não celulares e «EXTRAgen» Limite inferior Limite superior geq / ml ** geq / reacção 25, * * O limite superior do intervalo linear de medida como geq / reacção foi fixado a 10 6 moléculas / reacção, dentro de um logaritmo do valor do standard de amplificação AmpliSTANDARD de concentração mais alta, 10 5 moléculas / reacção). ** O limite superior do intervalo linear de medida como geq / extracção e geq / ml foi calculado do limite superior do intervalo linear de medida como geq / reacção como ilustrado na página 12 e 13. Limite de detecção com amostras não celulares e «EXTRAgen» (geq / reacção) Intervalo de confiança de 95% valor inferior valor superior 95% positividade 13,1 geq / reac. 8,4 geq / reac. 27,8 geq / reac. 50% positividade 2,6 geq / reac. 1,9 geq / reac. 3,5 geq / reac. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 15 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 16 / 25

11 Sensibilidade analítica: precisão O estudo da precisão do teste, entendida como variabilidade dos resultados obtidos com diferentes repetições de uma mesma amostra e analisados numa mesma sessão, permitiu determinar um Coeficiente de Variação percentual (CV %) médio de 24,3. Para as amostras celulares a precisão no interior da sessão foi determinada utilizando alguns dados obtidos pelo estudo do intervalo linear de medida. Os resultados são referidos na tabela seguinte. valor teórico geq / extracção Coeficiente de variação com amostras celulares e «EXTRAcell» Média dos valor teórico Desviação Nº repetições resultados geq / reacção standard geq / reacção CV % ,48 6,28 40, ,54 12,81 26, ,57 26,07 14, ,44 55,83 9,55 O CV % médio para as amostras celulares é de 22,8. Para as amostras não celulares a precisão no interior da sessão foi determinada utilizando alguns dados obtidos pelo estudo do intervalo linear de medida. Os resultados são referidos na tabela seguinte. valor teórico geq / ml Coeficiente de variação com amostras não celulares e «EXTRAgen» Média dos valor teórico Desviação Nº repetições resultados geq / reacção standard geq / reacção CV % ,23 11,20 42, ,33 25,76 25, ,83 51,86 22, ,67 173,68 15, ,57 618,19 22, , ,51 23, , ,95 28, , ,48 25,86 O CV % médio para as amostras não celulares é de 25,7. Sensibilidade analítica: exactidão O estudo da exactidão do teste, entendido como diferença entre o valor teórico da concentração de uma amostra e a média dos resultados obtidos com diferentes repetições desta amostra analisados numa mesma sessão, permitiu determinar uma Inexactidão percentual média de 14,3 %. Para as amostras celulares a inexactidão no interior da sessão foi determinada utilizando alguns dados obtidos pelo estudo do intervalo linear de medida. Os resultados são referidos na tabela seguinte. valor teórico geq / extracção Inexactidão com amostras celulares e «EXTRAcell» Média dos valor teórico Nº repetições resultados geq / reacção geq / reacção Inexactidão % ,48 2, ,54 4, ,57 15, ,44 16,89 A Inexactidão % média para as amostras celulares é de 9,9. Para as amostras não celulares a inexactidão no interior da sessão foi determinada utilizando alguns dados obtidos pelo estudo do intervalo linear de medida. Os resultados são referidos na tabela seguinte. valor teórico geq / ml Inexactidão com amostras não celulares e «EXTRAgen» Média dos valor teórico Nº repetições resultados geq / reacção geq / reacção Inexactidão % ,23 3, ,33 27, ,83 7, ,67 37, ,57 10, ,90 7, ,15 23, ,94 26,64 A inexactidão % média para as amostras não celulares é de 18,6. Sensibilidade analítica: Factor de conversão às Unidades Internacionais O factor de conversão a ser utilizado com este teste para transformar o resultado quantitativo de geq / ml às Unidades Internacionais / ml foi definido como 0,76 Unidades Internacionais / geq quando se utilizam amostras de plasma colhido em EDTA e o kit de extracção manual «EXTRAgen» e como 0,86 Unidades Internacionais / geq quando se utilizam amostras de sangue total e o sistema de extracção automático «NucliSENS easymag». O factor de conversão foi determinado utilizando-se um painel de quatro diluições (0,5 Log 10 entre uma diluição e a seguinte) de material de referência calibrado aprovado pela OMS ("1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques", NIBSC, Reino Unido, código 09/162) em plasma colhido em EDTA e em sangue total colhido em EDTA. Os quatro pontos do painel foram utilizados em 8 repetições para realizar o procedimento completo de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. A análise dos dados obtidos permitiu calcular um factor de conversão (Fc) médio igual a 0,76 Unidades Internacionais (UI) por geq de CMV detectado. Os resultados finais são mostrados na tabela a seguir. Conversão às Unidades Internacionais com «EXTRAgen» Conc. esperada UI / ml Conc. esperada Log 10 UI / ml Quantidade média geq / ml Quantidade média UI / ml Quantidade média Log 10 UI / ml , , , , , , , ,076 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 17 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 18 / 25

12 Os quatro pontos do painel foram utilizados em 8 repetições para realizar o procedimento completo de análise: extracção, com o sistema de extracção automático biomérieux SA e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. A análise dos dados obtidos permitiu calcular um factor de conversão (Fc) médio igual a 0,86 Unidades Internacionais (UI) por geq de CMV detectado. Os resultados finais são mostrados na tabela a seguir. Conversão às Unidades Internacionais com «NucliSENS easymag» Conc. esperada UI / ml Conc. esperada Log 10 UI / ml Quantidade média geq / ml Quantidade média UI / ml Quantidade média Log 10 UI / ml , , , , , , , ,975 Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção e quantificação nos diferentes genótipos / subtipos A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção e quantificação nos diversos genótipos /sub-tipos, está avaliada pelo confronto de sequências com banco de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos de primers AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados do gene MIEA de CMV, entre aqueles dos grupos AD169 e Towne, os tem demonstrado a ausência de mutações significativas. Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas A sensibilidade diagnóstica do teste, como confirmação de amostras clínicas positivas, foi verificada realizando-se a análise de painéis de amostras clínicas positivas para o DNA de CMV. Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento das análises, extracção, e amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. A sensibilidade diagnóstica foi verificada utilizando um painel de amostras de células positivas para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA) com um intervalo de cargas virais para 120 geq/ milhão de células para geq / milhão de células. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Leucócitos positivos para o DNA de CMV As discordâncias entre os resultados obtidos com este produto e os resultados obtidos com o COBAS AMPLICOR system podem ser entendidos com a heterogeneidade das amostras celulares positivas com baixa carga viral: As poucas células positivas se distribuem casualmente nas diversas divisões que podem ainda resultar com uma titulação superior ou inferior ao limite de detecção do teste. A sensibilidade diagnóstica deste teste foi igual a 88,3%. A sensibilidade diagnóstica foi verificada utilizando um painel de amostras de liquido amniótico positivas para o DNA de CMV (testadas com cultura de células e imunofluorescência). Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Liquidos amnióticos positivos para o DNA de CMV A sensibilidade diagnóstica deste teste foi superior a 94,7%. A sensibilidade diagnóstica foi verificada utilizando-se como material de referência 49 amostras de sangue total colhidas em EDTA, positivas para o DNA de CMV. Cada amostra foi utilizada para realizar o procedimento completo de análise: extracção, com o sistema de extracção automático «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, França) e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Sangue total colhido em EDTA positivo para o DNA de CMV A sensibilidade diagnóstica deste teste foi superior a 98,0%. Especificidade diagnóstica: amostras negativas A sensibilidade diagnóstica do teste, como confirmação de amostras clínicas negativas, foi verificada realizando-se a análise de painéis de amostras clínicas negativas para o DNA de CMV. Cada amostra dos dois painéis foi empregada para realizar o completo procedimento de análises, extracção e amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando-se um painel de leucócitos negativos para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA). Os resultados são referidos na tabela seguinte. Leucócitos negativos para o DNA de CMV As seis amostras celulares que resultam positivas com este produto são provenientes de pacientes em fase inicial ou terminal de infecção de CMV e ainda podendo ser consideradas amostras positivas para o DNA de CMV com baixa carga viral. As discordâncias entre os resultados obtidos com este produto e os resultados obtidos com o COBAS AMPLICOR system podem ser entendidos com a heterogeneidade das amostras celulares positivas com baixa carga viral: As poucas células positivas se distribuem casualmente nas diversas divisões que podem ainda resultar com uma titulação superior ou inferior ao limite de detecção do teste. A especificidade diagnóstica neste teste foi igual a 90,0%. Para as amostras não celulares a especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando um painel de amostras de plasma normais de doadores (Painel Normal Humano Plasma, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos). Todas as amostras são resultados negativos para o DNA de CMV como ilustrado na tabela seguinte. Painel de plasmas normais de doadores A especificidade diagnóstica neste teste foi superior a 98,3%. A especifidade diagnóstica foi avaliada utilizando um paneil de amostras de líquido amniótico negativas para o DNA de CMV (testadas com cultura de céllulas e imunofluorescência). Os resultados são apresentados na tabela a seguir. Liquidos amnióticos negativos para o DNA de CMV Das sete amostras de líquido amniótico que resultam positivas com este produto, seis foram confirmadas por sucessivos exames no recém-nascido. Uma amostra, por outro lado, resoltou um falso positivo que poderia ser explicado por una contaminação no momento da extracção do líquido amniótico. A especificidade diagnóstica deste teste foi superior a 93,7%. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 19 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 20 / 25

13 A especificidade diagnóstica foi verificada utilizando-se como material de referência 46 amostras de sangue total colhidas em EDTA, negativas para o DNA de CMV. Cada amostra foi utilizada para realizar o procedimento completo de análise: extracção, com o sistema de extracção automático «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, França) e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Sangue total colhido em EDTA negativo para o DNA de CMV A amostra com resultado discordante pode ser explicada pela heterogeneidade das amostras celulares positivas com baixa carga viral: as poucas células positivas se distribuem casualmente nas diversas alíquotas, que podem assim resultar com uma titulação superior ou inferior ao limite de detecção do teste. A especificidade diagnóstica deste teste foi superior 97,8%. Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes A sensibilidade analítica do teste, como cross reactiva com outros marcadores interferentes, foi avaliada para confronto de sequência com bancos de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos de primers do AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados dos diversos organismos da CMV, entre aqueles do genoma completo de HHV6, o vírus herpético humano mais similar ao CMV, demostrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. A especificidade analítica do teste, como cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada utilizando uma amostra testada positiva para o DNA de HHV6. Esta amostra foi empregada em 15 repetições para realizar o completo procedimento de análises, extracção e amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Para as amostras celulares a especificidade analítica foi verificada utilizando um sobrenadante de cultura positivo para o DNA de HHV6 testado que é agregado a células negativas para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA). Todas as repetições são resultados negativos para CMV como ilustrado na tabela seguinte. Sobrenadante de cultura positivo para o DNA de HHV6 + Células negativas para o DNA de CMV Para as amostras não celulares a especificidade analítica é verificada utilizando um sobrenadante de cultura positivo para o DNA de HHV6 testado diluído numa amostra de plasma normal (Normal Human Plasma, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos). Todas as repetições são resultados negativos para o DNA de CMV como ilustrado na tabela seguinte. Sobrenadante de cultura positivo para o DNA de HHV6 + Plasma normal Resistência: Contaminação cruzada A resistência do teste, como ausência de contaminação cruzada, foi verificada analisando os resultados das seis sessões em que amostras negativas para o DNA de CMV são alternadas a amostras fortemente positivas para o DNA de CMV. Seis séries de amostras, alternando três amostras positivas com duas amostras negativas, foram empregadas para realizar o completo procedimento de análises, extracção e amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Para as amostras celulares a ausência de contaminação cruzada foi verificada utilizando algumas amostras de células positivas para o DNA de CMV e elevada titulação testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA) e uma amostra de células negativas para o DNA de CMV (testado com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA). Nenhuma amostra negativa para o DNA de CMV resultou positiva para contaminação como ilustrado na tabela seguinte. Células positivas para o DNA de CMV Células negativas para o DNA de CMV Para as amostras não celulares a ausência de contaminação cruzada foi verificada utilizando como material de referência calibrado um plasma positivo para o DNA de CMV de alta titulação (PeliSpy CMV- DNA Monitor 10000, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos) e uma amostra de plasma normal (Normal Human Plasma, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos). Nenhuma amostra negativa para o DNA de CMV resultou positiva para contaminação como ilustrado na tabela seguinte. Plasma positivo para o DNA de CMV Plasma normal Resistência: taxa global de erros do sistema A confiabilidade do teste, como taxa global de erro do sistema que leva a resultados falsos negativos, foi verificada interpretando as análises de dois painéis de amostras positivas para o DNA de CMV com baixa titulação e com resultado menor a 1,7%. Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento das análises, extracção e amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Para as amostras celulares a taxa global de erro foi controlada utilizando um painel de amostras de células negativas para o DNA de CMV (testadas com COBAS AMPLICOR system, Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J., USA) levadas a 1200 geq / extracção com um plasma de referência calibrado (PeliCheck CMV-DNA-99, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos). Todas as amostras são resultados positivos para o DNA de CMV como ilustrado na tabela seguinte. Células positivizadas para o DNA de CMV Para as amostras não celulares a taxa global de erro foi controlada utilizando um painel de amostras de plasma normal de doadores (Painel Normal Human Plasma, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos) levadas a 1600 geq / ml com um plasma de referência calibrado (pelispy CMV-DNA Monitor 10000, AcroMetrix Europe B.V., Países Baixos). Todas as amostras são resultados positivos para o DNA de CMV como ilustrado na tabela seguinte. Plasma positivizado para o DNA de CMV Nota: Os dados e resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da performance do produto com as matrizes e os instrumentos estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "", FTP. BIBLIOGRAFIA T. E. Fenner et al. (1991) J Clin Microbiology 29: SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 21 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 22 / 25

14 PROBLEMAS E SOLUÇÕES SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS DNA branco não detectado na reacção do AmpliStandard ou Coeficiente de correlação da Curva standard não válido Possíveis causas Soluções Controlar os volumes de reagentes dispensados durante a Erro na preparação da mistura de reacção. preparação da mistura de reacção. Dispensar com atenção as reacções na microplaca seguindo o plano de trabalho. Erro na dispensação na microplaca. Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar os volumes de standard dispensados. Degradação da sonda. Utilizar uma nova alíquota de sonda. Número do catálogo. Limite superior de temperatura. Limites de temperatura. Degradação dos standard. Erro na programação do equipamento. Utilizar uma nova alíquota de standard. Controlar a posição das reacções dos standard programado no equipamento. Controlar o ciclo térmico programado no equipamento. Código do lote. Para utilizar antes do (último dia do mês). Presença de DNA alvo na reacção de Controlo negativo Possíveis causas Soluções Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Erro na dispensação na microplaca. Dispensar com atenção as amostras, controlos negativos e standard na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar a posição das amostras, controlos negativos e Erro durante a programação do equipamento. standard programada no equipamento. Microplaca mal fechada. Fechar cuidadosamente a microplaca Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Certificada pela DEKRA Certification B.V., the Netherland. Conteúdo suficiente para "N" teste. Contaminação da água bidestilada estéril. Contaminação da mix de amplificação. Utilizar uma nova divisão de água estéril. Utilizar uma nova alíquota de mix de amplificação. Atenção, consultar as instruções de uso. Contaminação da área para a extracção / preparação da reacção de amplificação. Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquoso, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Presença de fluorescência de fundo elevada nas reacções Possíveis causas Soluções Programar o intervalo de cálculo da "baseline" num âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja Erro na programação da "Baseline". estabilizada (controlar os registros "Results", "Component") e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a crescer, por exemplo do ciclo 9 ao ciclo 15. CONT Conteúdo. Manter distante da luz solar. Fabricante. A aquisição deste produto dá direito ao adquirente de utilizá-lo para a amplificação e a detecção de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto aos produtos licenciados para "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do adquirente. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 23 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 24 / 25

15 FOLHA DE TRABALHO A B C D E F G H SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 25 / 25

16 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 1 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 2 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 PROCEDIMENTO pág. 4 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 4 USO PREVISTO O produto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» é parte de um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e a dosagem do DNA branco com o método de amplificação real time em amostras de DNA extraído ou de cdna obtido por RNA extraído. O produto é um acessório dos produtos da série «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Standard» e «Positive Control» da ELITechGroup S.p.A. O produto é empregado na preparação de provas diagnósticas baseadas no método da amplificação real time. DESCRIÇÃO DO PRODUTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: +2 C +8 C O produto no formato completo (código RTS000) fornece a mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time AmpliMASTER, em uma solução estabilizada previamente dividida em quatro tubos e prontos para o uso. A mistura de reagentes fornece o sistema tampão, o cloreto de magnésio, os nucleotídeos trifosfatos, o fluoróforo ROX de referência passivo para a normalização da fluorescência, a enzima Uracil-N-glucosidase (UNG) para a inactivação das contaminações do produto de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase e activação térmica (hot start). Nota: as Microplacas para amplificação não devem ser utilizadas com os equipamentos Applied Biosystems da série 7000 que aumentam o bloco térmico "FAST". O produto no formato completo (código RTS000) permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. Produto formato completo código RTS000 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem AmpliMASTER mistura de reagentes optimizados 4 x 340 µl TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Cloreto de magnésio, Desoxiribonucleotídeos trifosfatos, ROX, Uracil-Nglicosidase, Tag DNA polimerase MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT - Câmara de fluxo laminar. - Luvas descartáveis em nitrilo ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de bancada ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água de grau molecular para biologia. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal - cycler para real time). OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes de primers (oligonucleotídeos), os reagentes de detecção (sondas fluorescentes), os DNAs standard a quantidade reconhecida, os controlos heterozigotos de DNA plasmídico, as microplacas para amplificação, os lâminas adesiva para amplificação não são incluídos neste kit. Para realizar esta fase analítica é necessário se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.: série «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleotídeos primers para a amplificação real time e sondas fluorescentes para a amplificação real time. série «Q - PCR Standard», DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. série «Positive Control», controlo heterozigoto de DA plasmídico. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, é necessário se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, é necessário se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com pocinhos de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. - SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 1/4 SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 2/4

17 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES PROCEDIMENTO Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121ºC durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análises. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. O kit «Q - PCR Alert AmpliMASTER» deve ser utilizado com os kits da série «Q - PCR Alert AmpliMIX» para obter a mistura de reacções. A AmpliMASTER está pronta para o uso, portanto deve ser utilizada directamente na preparação da mistura de reacção. O procedimento completo, que prevê a preparação e a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time), está descrito detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado ao kit «Q - PCR Alert AmpliMIX». As características da performance e os limites do procedimento do teste completo de pesquisa e dosagem do DNA branco estão descritas detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado aos kits da série «Q - PCR Alert AmpliMIX». Número do catálogo. Limites de temperatura. Código do lote. SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS Para utilizar antes do (último dia do mês). Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Européia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Fabricante. A aquisição deste produto dá direito ao adquirente utilizá-lo para a amplificação de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto a produtos licenciados "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do adquirente. SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 3/4 SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 4/4