1. INTRODUÇÃO Peroxidases (POD) (EC.1.11.1.7) são enzimas que pertencem à classe das oxidoredutases, cuja função é catalisar a oxidação de componentes celulares, tais como peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) ou peróxidos orgânicos (KVARATSKHELIA et al., 1997). Elas são largamente distribuídas nos reinos animal e vegetal, assim como em microrganismos (BILES & MARTYN, 1993). Os estudos preliminares com as peroxidases deram início em 1809, devido à variação na coloração de tecidos vegetais e leite, na presença de peróxidos; no entanto o nome peroxidase só foi usado um século depois, em pesquisa de enzimas de raiz forte (Armoracia lapathifolia). Estes estudos mostraram uma atividade oxidativa durante o amadurecimento de frutos, que levaram ao descobrimento da presença do guaiacol e peróxido de hidrogênio para determinar a atividade da peroxidase (ROBINSON, 1991). As peroxidases extraídas de plantas têm sido objetos de estudo de muitos pesquisadores, por se tratar de uma enzima com vasta área de aplicação. São amplamente usadas em kits de diagnóstico laboratorial, como teste ELISA e Western-Blot, e na determinação de glicose (MC CLEAR & GLENNIE-HOLMES,1985; CASELLA et al., 1989); também na autenticidade de alimentos (ANGUITA et al., 1997), ensaios de higiene (CHANG & HUANG, 1994) e determinação de componentes de alimentos (ARNAO et al., 1996). A fonte comercial mais utilizada de POD é a raiz forte, que é geralmente cultivada e colhida em países de clima frio. Assim novas fontes de POD precisam ser obtidas para atender a crescente demanda, em países tropicais, como o Brasil.
2 Zizyphus joazeiro Martius, espécie vegetal vulgarmente conhecida como juazeiro ou juá, ocorre em todos os Estados do nordeste do Brasil, inclusive no polígono da seca (BARROS et al., 1970). A POD de folhas de Zizyphus joazeiro M., nova fonte dessa enzima é obtida por extração simples do material de origem, juazeiro, amplamente distribuído no nordeste brasileiro como planta nativa, produzindo folhas durante todo o ano.
3 2. OBJETIVOS 2.1. Geral Avaliar a presença de oxidoredutases em folhas e frutos do juazeiro (Zizyphus joazeiro Martius) e caracterizar bioquimicamente aquela de maior atividade. 2.2. Específicos Identificar a presença de oxidoredutases, polifenoloxidase e peroxidase, em folhas e frutos do juazeiro. Isolar e semipurificar a oxidoredutase de maior atividade pelo uso de precipitação fracionada com sulfato de amônio. Caracterizar bioquimicamente a oxidoredutase semipurificada, de maior atividade, quanto ao ph e temperatura ótimos, sua inativação e estabilidade térmicas. Avaliar a inibição da oxidoredutase de maior atividade com o uso em várias concentrações de ácido ascórbico, metabissulfito de sódio e hexametafosfato de sódio.
4 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Peroxidase 3.1.1. Considerações gerais A peroxidase (POD) ou peróxido de hidrogênio óxido-redutase (E.C. 1.11.1.7), pertence às oxidoredutases. É capaz de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador para o H 2 O 2 (SIEGEL, 1993) e foi inicialmente observada em raiz forte e no leite há mais de um século pela produção de cor na presença de guaiacol. Os primeiros estudos indicaram uma atividade oxidativa durante o amadurecimento dos frutos, que levaram ao descobrimento da presença do guaiacol e peróxido de hidrogênio para determinar a atividade de peroxidases. As enzimas de raiz forte têm sido estudadas de forma mais intensa por apresentarem notadamente maior atividade (ROBINSON, 1991). A oxidação fenólica mediada pela POD parece estar associada com a deterioração da qualidade nutricional, sabor, cor e textura de alimentos processados (ROBINSON, 1991). A atividade da peroxidase tem sido relacionada com a existência de isoenzimas catiônicas e/ou aniônicas (VAN HUYSTEE, 1987), além do que, uma dada fruta pode ter ambos tipos de isoenzimas (FILS et al., 1985). Os extratos preparados de plantas para verificar a atividade enzimática da peroxidase e polifenoloxidase têm mostrado que essas enzimas podem ocorrer tanto na forma solúvel como também na forma ionicamente ligada à parede celular (CLEMENTE, 1998; CLEMENTE & PASTORE, 1998).
5 Por um longo tempo a peroxidase tem atraído atenção por causa do nível de atividade residual depois do branqueamento em processos de conservação de alimentos, sendo usada como um indicador de sua efetividade. Altas correlações entre o desenvolvimento de off-flavour em vegetais congelados durante o armazenamento e a atividade residual da peroxidase têm mostrado proveitosa utilidade da mesma como um índice para a qualidade do branqueamento (SERVANT et al., 1986). As peroxidases têm sido correlacionadas em plantas com: resistência a doenças, lignificação e suberização, proteção contra H 2 O 2 e outros oxidantes, com tolerância à seca, à degradação da clorofila e à senescência. Também têm sido relacionadas com atividades antifúngicas (ABELES & BILES, 1991; PENG & KUC, 1992; REUVENI et al., 1992). Os substratos da peroxidase mais comumente usados são: guaiacol, o- dianisidina, o-toluidina e benzidina. Um dos grandes inconvenientes de alguns destes é sua natureza mutagênica e cancerígena, com conseqüente risco na hora do seu manejo (HERZOG & FAHIMI, 1973). 3.1.2. Mecanismo de ação A ação catalítica da POD consiste inicialmente em uma reação com H 2 O 2, transferindo dois elétrons para o grupo prostético de ferro heme. Dolphin et al. (1971) compararam os espectros óticos de absorção da oxidação de dois elétrons de cobalto octaetilporfirina, que resultou em um π-cátion radical estável, com o do composto I de HRP (Horseradish Peroxidase) e concluíram que este último também contém um π-cátion radical no grupo heme,
6 explicando, portanto o alto nível de oxidação, estabilidade e espectro ótico do composto I. Convencionalmente é aceito que o composto I reage com um doador de H +, descendo um grau de sua oxidação, transformando-se no composto II, formando radical livre a partir do doador de H +. O composto II, por conseguinte reage com outro doador de H +, retornando ao estado inicial de oxidação de Fe 3+, e produzindo mais um radical livre e uma molécula de água. Os radicais livres formados na oxidação do H 2 O 2 a partir dos doadores de H +, reagirão de acordo com sua natureza química. Reed (1975) definiu peroxidase como uma enzima catalisando a reação geral: ROOH + AH 2 H 2 O + ROH + A Uma versão mais simples foi dada por Dutcher et al. (1951): H 2 O 2 + peroxidase H 2 O + O Reed (1975) declarou que a sua é a reação peroxidásica verdadeira e geralmente a reação considerada de maior importância. Na sua reação, ROOH pode ser HOOH ou algum outro peróxido orgânico. O complexo doador de hidrogênio e dois passos da oxidação estão envolvidos. Na equação seguinte, AH 2 representa o doador de H e A o doador oxidado: POD + H 2 O 2 Composto I (1) Composto I + AH 2 Composto II + AH (2) Composto II + AH POD + A (3) Estudos mostram que o índice de perda de atividade de POD parece seguir cinética de primeira ordem (LU & WHITAKER, 1974). O passo 3 do mecanismo proposto parece ser o limite.
7 O doador de hidrogênio para POD não é específico com respeito a compostos orgânicos (REED, 1975). Para algumas peroxidases o número de diferentes doadores de hidrogênio é pequeno. Por exemplo, HRP usa somente peróxido de hidrogênio, peróxido de metil-hidrogênio e peróxido de etilhidrogênio. Peroxidase também oxida iodetos, libertando o iodo (SUMNER & SOMERS, 1947). 3.1.3. Importância das peroxidases Em plantas, peroxidases são apresentadas como glicoproteínas envolvidas em muitos processos: crescimento e desenvolvimento de plantas (RIQUELME & CARDEMIL, 1993); biossíntese de lignina (BRUCE & WEST, 1989); enrijecimento de parede (FRY, 1980). A ação da peroxidase em plantas constitui proteção antioxidativa. A atividade desta enzima pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresse. Sob condições de estresse, as plantas tendem a aumentar a atividade da peroxidase e às vezes, é a primeira enzima a ter atividade alterada, independentemente do substrato utilizado ou do estresse aplicado (SIEGEL, 1993). Rossi & Lima (2001) analisaram a POD como indicador de estresse causado pelo cádmio durante a germinação de sementes de feijão. A POD está relacionada a qualidade e processamento de alimentos, particularmente quanto ao flavour de alimentos crus e produtos processados (VAMOS-VIGYÁZÓ, 1981). Robinson (1991) revisou as funções fisiológicas da POD na pós-colheita em frutas e vegetais e atribuiu muitas delas a oxidação fenólica, incluindo biossíntese da lignina. De fato, a oxidação fenólica, mediada
8 pela POD pode estar associada com deterioração de flavour, cor e textura e qualidade nutricional de alimentos processados. Clemente & Pastore (1998) relataram que peroxidase e polifenoloxidase nos alimentos vegetais são responsáveis pela alteração de cor e flavour em enlatados ou congelados, cujo controle dessas enzimas mantém a qualidade desses alimentos. Tais enzimas desempenham papel fisiológico, como degradação da clorofila e amadurecimento de frutos (YAMAUCHI & HASHINAGA, 1992). Kahn (1977) mostrou que o sabor amargo e adstringente de algumas bebidas de origem vegetal está relacionado com ação dessas enzimas. A oxidação altera a cor do vinho, conferindo aparência escurecida e turva causada pela deterioração e é responsável pela perda de qualidade e aspecto indesejável (ODEBODE & OSO, 1995). Todos estes processos são de vital importância para produção de alimentos, tanto para o fabricante como para o vendedor e consumidor do produto, principalmente pela perda do valor nutricional. Por isso as peroxidases são de grande importância na qualidade e processamento dos alimentos, podendo ser responsáveis pelo sabor de alimentos crus ou produtos processados (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981) o que ocorre de forma complexa e não bem conhecida. O Brasil é um grande produtor de frutas tropicais, a maioria delas não é comercializada e estudos destas enzimas nestes frutos tropicais são de grande importância para indústria alimentícia.
9 3.1.4. Aplicação das peroxidases Atualmente tem aumentado o interesse em pesquisas bioquímicas relacionadas à aplicação e função de biomoléculas, em novas fontes de enzimas, bem como métodos de menor custo, como as peroxidases, que têm aplicações em análise de qualidade de alimentos, em diagnósticos clínicos, na medicina (SERGEYEVA et al., 1999), no estudo de processos patológicos e preservação do meio ambiente (PODGORNIK et al., 1999), em análises de formulações farmacêuticas e outros estudos que envolvem a presença ou formação de peróxidos (VIEIRA et al., 1999). Muitas pesquisas relacionadas ao uso da POD na medicina têm sido feitas, no auxílio de diagnósticos indiretos ou em análises diretas do nível de peróxidos formados em processos patológicos inflamatórios e análise em medicina ortomolecular para detectar a atividade de radicais livres (BURTON & INGOLD, 1984; McDOWELL, 1989). Nos alimentos o peróxido é agente determinante de contaminação e largamente utilizado na análise de processo esterilizante, cuja presença pode levar a perda do valor nutricional, aparência indesejável e formação de compostos tóxicos como hidroperóxidos, lipoperóxidos, epóxidos e aldeídos (SIMIC & KAREL, 1979). Fatibello-Filho & Vieira (2000) utilizaram eletrodos com POD como biossensores através de métodos eletroquímicos de análise em formulações farmacêuticas, cosméticos e dosagem de hidroquinona em revelação fotográfica. A aplicação das peroxidases em formulações farmacêuticas é de
10 grande importância para controle de qualidade, utilizando o princípio dessas enzimas em oxidar doadores de H + na presença de H 2 O 2. Sergeyeva et al. (1999) mostraram aplicações de peroxidases e dentre elas a capacidade dessas enzimas em determinar peróxidos liberados no meio ambiente, originados de processos industriais. Em análises clínicas as peroxidases podem se ligar a anticorpos ou proteínas específicas (AIDS, câncer), sendo por isso utilizadas em kits de diagnóstico laboratorial com atividade de biossensor ou detector químico para testes de alta sensibilidade como ELISA e Western-blot (McCLEAR & GLENNIE-HOLMES, 1985; CASELLA et al., 1989). 3.1.5. Termo-estabilidade e inativação térmica de peroxidase de vegetais Peroxidase é considerada uma enzima estável quando submetida a tratamento térmico. Por isso a redução da sua atividade tem sido usada como medida de avaliação do processo térmico de branqueamento. Contudo, a resistência para o tratamento depende da fonte da enzima. Além disso, em uma dada fonte, esses parâmetros podem variar de uma isoenzima para outra (LEE et al., 1984). Os tratamentos térmicos comercialmente usados para o processamento de extratos de frutas e vegetais, por exemplo: temperatura elevada por curto tempo (HTST), é pouco efetiva para uma inativação irreversível da peroxidase (KHAN & ROBINSON, 1993). Farkas et al. (1956), anunciaram que para inativar peroxidase em ervilhas verdes é preciso 6 minutos a 121 C.
11 Segundo Baardseth & Slinde (1980), a inativação térmica da peroxidase de cenoura (Daucus carota), broto sueco (Brassica napus) e couve-de-bruxelas (Brassica oleracea) a 70 C durante 1,5 minuto apresenta uma atividade residual de 45%. A peroxidase do broto sueco mostra ser mais estável termicamente que a peroxidase da couve-de-bruxelas e da cenoura. O tratamento térmico aplicado a um produto alimentício particular por uma duração maior que a usual é preciso para evitar a regeneração da atividade da peroxidase em alimentos (REED, 1975). Alguma regeneração que possa ocorrer é provavelmente devido à enzima não ter sido completamente ou irreversivelmente inativada pelo calor. Alguns fatores contribuem para regeneração da atividade da peroxidase como o rigor do tratamento térmico combinado com o tempo de tratamento e as condições de armazenamento da enzima inativada antes da regeneração. A termo-estabilidade da atividade da peroxidase tem sido investigada em nabos, repolhos, maçãs, pêras, uvas e produtos cítricos. Lourenço et al. (1995) narraram que a inativação térmica das peroxidases purificadas solúvel e ionicamente ligada de mamão (Carica papaia) mostraram comportamento bifásico entre 50 e 80 C. A peroxidase solúvel foi termolábil; o aquecimento a 70 C durante 1 minuto inativou a enzima em 94%. A peroxidase ionicamente ligada reteve 45% de sua atividade inicial após tratamento idêntico. Robinson et al. (1989) examinaram a estabilidade térmica de peroxidase de uva Ohane. A inativação da enzima seguiu padrão não-linear com 90% de inativação de peroxidase após 10 minutos a 80 C.
12 As peroxidases da casca de pêra, tanto as solúveis, quanto as ionicamente ligadas, mostraram-se termorresistentes. A recuperação da atividade, após inativação térmica, foi observada para peroxidase da casca e para peroxidase solúvel da polpa. A inativação térmica seguiu padrão nãolinear (MOULDING et al., 1989). Segundo Lourenço & Neves (1997), a inativação térmica da POD de pêssego seguiu padrão não-linear e foi rápida em temperaturas acima dos 70 C, com perda praticamente total da atividade com tratamento a 80 C durante 30 segundos. 3.1.6. Peroxidase em folhas Sakharov et al. (2001) pesquisaram peroxidase em folhas de palmeira real (Roystonea regia). A nova peroxidase foi caracterizada tendo como atividade específica 6170 U / mg de proteína, peso molecular de 51 kda e ponto isoelétrico (PI) 3,5. A especificidade ao substrato da peroxidase da palmeira real é distinta de outras peroxidases de plantas, tendo como melhores substratos o ácido-ferrúlico e 2,2 -azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6- ácido-sulfônico). Takahama & Egashira (1991) localizaram uma peroxidase básica em vacúolos de células mesófilas de folhas de Vicia faba, a qual foi isolada por precipitação em sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e filtração em gel. A peroxidase obteve ph ótimo 5 e absorção máxima em comprimentos de onda 404, 510 e 635 nm na forma oxidada.
13 Uma peroxidase catiônica em folhas de Vitis pseudoreticulata foi purificada usando cromatografia de troca iônica e em coluna zeólita. Características da peroxidase catiônica purificada foram parcialmente analisadas. Os resultados mostraram que a peroxidase tem absorção máxima em 450nm de comprimento de onda e um PI maior que 8. O valor do ph ótimo foi 5,76, quando guaiacol foi utilizado como substrato (LIAO et al., 1999). Lin et al. (1996) pesquisaram POD em folhas de Ipomoea cairica e a purificaram usando precipitação em sulfato de amônio, fracionamento em acetona e filtração em gel. A enzima foi purificada 51 vezes com 84% de recuperação e estável em 60 C e na faixa de ph 5-11. Pode ser usada como reagente diagnóstico em testes de glicose em lugar de POD de raiz forte disponível comercialmente. Maciel (2002) investigou POD em folhas de Copaifera lansdorffii e verificou que a mesma tem alta atividade, fácil extração, boa estabilidade e alta concentração na forma bruta. As condições ótimas da enzima bruta foram encontradas na faixa de ph 5-7 e temperatura ótima de 30-40 C e de acordo com a sua estabilidade em relação a ph e temperatura, revelou ser uma enzima muito estável com possível utilização em aplicações diversas para as quais têm sido usadas outras peroxidases. Srinivas et al. (1999) extraíram a peroxidase das folhas de Ipomoea palmetta e verificaram que a mesma apresentou atividade ótima em ph 6,0 e 50 C. A peroxidase foi parcialmente purificada por extração usando sistema aquoso de dupla fase polietilenoglicol / sulfato de amônio, seguido por filtração em gel em coluna Sephadex G-100.
14 Trevisan et al. (2003) estudaram a atividade da peroxidase em folhas de Humulus lupulus L., usando como substrato o guaiacol. Infestação das folhas pelas aranhas vermelhas (Tetranychus urticae) mostrou ocasionar um aumento da atividade da POD nas folhas mais altas e mais baixas. Peroxidases foram extraídas de folhas frescas de tamareira (Phoenix dactylifera L.) colhidas de 90 árvores masculinas não-produtoras de frutos e 75 plantas adultas femininas todas crescidas em Marrakech (Marrocos). Duas frações enzimáticas foram obtidas por um método de solubilidade progressivo conduzindo à peroxidases solúveis e peroxidases ionicamente ligadas (MAJOURHAT et al., 2002). 3.1.7. Peroxidases em frutas 3.1.7.1. Peroxidase de carambola (Averrhoa carambola) Baldini et al. (1982), pesquisando a carambola, extraíram atividade peroxidásica da fruta usando tampão fosfato de potássio 0,05 M ph 6,2 na proporção de uma parte de polpa para 1,5 partes de tampão, contendo 1 M de cloreto de potássio e 5% de PVP (polivinilpirrolidona). Os autores relataram 34,8 unidades de peroxidase por mg de proteína. A eletroforese nativa do extrato revelou apenas uma banda com atividade de POD. Holschuh (2000), avaliando carambola, concluiu que o melhor tampão para extração da POD e o melhor meio de reação foram respectivamente, tampão fosfato de potássio 0,2 M, ph 8,0 e tampão citrato-fosfato 0,1 M, ph 5,5 e temperatura ótima de 50 C. A localização histoquímica mostrou que a
15 peroxidase da carambola está mais concentrada junto aos feixes vasculares, ao talo central e ao gineceu, portanto ligada a tecidos mais fibrosos. Em carambolas sobremaduras houve extravasamento do tetraguaiacol, produto da reação da peroxidase com guaiacol e peróxido de hidrogênio, para o meio reativo, indicando a presença de maior quantidade de peroxidase solúvel. 3.1.7.2. Peroxidase de coco (Cocos nucifera) Mujer et al. (1983) extraíram peroxidase do endosperma congelado de coco normal e coco mutante. A peroxidase de coco normal foi purificada 14,6 vezes com 44% de recuperação e a de coco mutante 12,8 vezes com 40% de recuperação após filtração em Sephadex G-200. A atividade da peroxidase foi determinada com o-dianisidina como doador de H + e a absorvância acompanhada a 420 nm. A eletroforese em gel de poliacrilamida dessa proteína resultou em uma única banda com peso molecular (PM) de 55 kda e foi identificada como subunidade do tetrâmero que constitui a enzima nativa com PM de 196 kda. 3.1.7.3. Peroxidase de kiwi (Actinidia chinensis) Soda et al. (1991) purificaram peroxidase da polpa de kiwi. A precipitação fracionada foi realizada com sulfato de amônio entre 50 e 85% da saturação. A peroxidase de kiwi foi cerca de 15.000 vezes purificada com 5,3% da enzima recuperada, apresentando atividade ótima em ph 5,5 e 50 C e tendo alta afinidade com os substratos guaiacol, pirogalol e o-dianisidina, mas
16 não com ácido ascórbico, NADH, NADPH e glutationa. A atividade da enzima foi totalmente inibida por KCN 1mM e os autores sugeriram que peroxidase de kiwi tem um grupo proto-heme em seu sítio ativo. 3.1.7.4. Peroxidase de manga (Mangifera indica) A peroxidase de manga foi extraída por precipitação com acetona e re - dissolução em tampão fosfato seguida de centrifugação e o sobrenadante foi usado na determinação da atividade peroxidásica. A irradiação de mangas com raios γ resultou em ativação da atividade da peroxidase, a qual aumentou progressivamente durante o amadurecimento. Os autores consideraram o aumento da atividade da peroxidase à produção de peróxidos pela irradiação (FRYLINCK et al., 1987) 3.1.7.5. Peroxidase de morango (Fragaria ananassa) Civello et al. (1995) purificaram parcialmente a peroxidase de morango e determinaram algumas de suas propriedades. A precipitação da enzima foi feita com sulfato de amônio a 85% de saturação. A atividade da peroxidase diminuiu consideravelmente durante o amadurecimento do fruto e foi encontrada principalmente na forma ligada à membrana. Os frutos verdes apresentaram maior atividade de peroxidase. A atividade máxima alcançada pela enzima foi em ph 6,0 e 30 C. A enzima demonstrou baixa estabilidade térmica, mas manteve atividades acima de 50% na faixa de ph 4 a 11. Duas isoenzimas
17 foram detectadas, ambas básicas, com PI 9,5 e 10,0 e com peso molecular de 58,1 e 65,5 kda. 3.1.7.6. Peroxidase de pêssego (Prunus persica) Abeles & Biles (1991) relataram que peroxidases ácidas de endocarpo de pêssegos em lignificação foram similares àquelas do mesocarpo carnudo. O endocarpo teve alta quantidade e número de peroxidases básicas que o mesocarpo. O ph ótimo situou-se entre 4 e 5. Lourenço & Neves (1997) verificaram em eletroforese em gel de poliacrilamida da enzima 28,9 vezes purificada revelou duas isoenzimas: uma termo-resistente e outra termo-sensível, mas que não foram separadas pela metodologia empregada. A atividade ótima da enzima foi a ph 5,0 e 40 C. 3.2. Juazeiro (Zizyphus joazeiro) 3.2.1. Considerações gerais O juazeiro é uma árvore de médio porte (5-14 m de altura por 40-50 de diâmetro), dotada de tronco curto, geralmente tortuoso e canelado, armado de fortes espinhos, com ramos flexuosos, subdivididos, que freqüentemente se esgalham a partir da base do caule e revestido por casca um tanto áspera de cor cinza-clara (Figura 1). Possui copa baixa, arredondada e densa, muito ramificada, que jamais perde suas folhas. Estas folhas são pecioladas, largo ovais, cordiformes na base, agudas ou meio acuminadas, levemente coriáceas,
18 lisas, meio reluzentes, serrilhadas, glabras, mas pubescentes nas nervuras da face dorsal, com cor verde forte, largura de 3 a 5 centímetros e de 5 a 10 centímetros de comprimento (Figura 2). Seus ramos mais finos são dotados de espinhos agudos de até 4 cm de comprimento. As flores são pequenas, de cor amarelada, reunidas em inflorescências cimosas axilares. Os frutos são globosos de cor amarelada de até 2 cm de diâmetro, constituídos de uma massa carnosa adocicada externa contendo em seu interior uma única semente muito dura (Figura 3) (CORRÊA, 1984). É uma árvore originária das caatingas do nordeste brasileiro, desde o Piauí até o norte de Minas Gerais. É particularmente freqüente no Vale do Rio São Francisco, onde se encontram os maiores exemplares. Têm como nomes populares: joá, juá, juá-espinho, juá-fruta e laranjeira-de-vaqueiro. É uma das plantas arbóreas típicas dos sertões nordestinos, prefere os solos aluviais argilosos, mas cresce por toda parte, inclusive nos tabuleiros mais áridos e pedregosos. Conserva-se sempre verde, nunca se despe de toda folhagem, que se renova durante o mês de outubro, mesmo nas mais rigorosas secas, graças ao amplo e profundo sistema radicular. Frutifica a partir de junho, podendo estender-se até agosto. O juazeiro fornece madeira moderadamente pesada, de boa resistência mecânica e moderadamente durável quando exposta ao tempo. É empregado em construções rurais para moirões, estruturas de pontes, confecções de móveis rústicos e como lenha. A sua cinza contém muito potássio, outrora muito usada como lixívia e na produção de sabão. Sua entrecasca é rica em saponina e contém um princípio anticárie, aproveitada atualmente na formulação de dentrifícios. Os frutos, ricos em vitamina C, são comestíveis e muito apreciados pelas populações locais, além
19 de muito procurados por animais em geral. É uma planta perenifólia, ou seja, não perde totalmente as folhas durante o ano, adaptada ao crescimento a pleno sol, com nítida preferência por solos férteis de várzeas e beira de rios. O fato de não perder as folhas durante o período de seca não significa que seja tão resistente a falta de água, mas geralmente onde cresce pode-se encontrar água a pequena profundidade (FERREIRA, 2003). Figura 1: Juazeiro (Zizyphus joazeiro) na caatinga nordestina.
20 3.2.2. Uso farmacológico e medicinal Infusões da casca de Zizyphus joazeiro Martius têm sido empregadas no nordeste brasileiro como remédio contra a febre. Um estudo investigou a atividade antipirética de um extrato aquoso da planta em coelhos febris pela injeção intravenosa de endotoxina de Escherichia coli. A febre foi significativamente diminuída pela administração da infusão da casca de Zizyphus joazeiro (NUNES et al., 1987). No estudo químico das cascas do caule de Zizyphus joazeiro foram identificados o lupeol, ácido betulínico, cafeína e estearato de glicerila através de técnicas espectroscópicas usuais (KATO & ALVARENGA, 1997). Em pesquisa brasileira, cientistas validaram o uso do Zizyphus joazeiro para o combate às cáries. Um decocto da casca demonstrou atividade forte contra bactérias comuns que formam placa dentária e cárie. Além disso, o juazeiro conduz a diminuição da inflamação provocada pela cárie. Proporciona o alívio da dor, promove cura e reduz infecções bacterianas secundárias causadas por filárias (maior parasita tecidual que afeta humanos) (FABIYI et al., 1993). Juazeiro é uma boa fonte de ácido betulínico, assim como três novos ésteres derivados deste ácido, os quais têm sido encontrados apenas nesta espécie. Ácido betulínico tem sido longamente documentado com atividade antibiótica moderada, contudo, cientistas descobriram que os três derivados demonstraram extraordinária atividade contra bactérias Gram positivas (SCHÜHLY et al., 1999).
21 Figura 2: Folhas e flores de juazeiro (Zyziphus joazeiro). Figura 3: Frutos do juazeiro (Zizyphus joazeiro).
22 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Material Folhas e frutos do juazeiro (Zizyphus joazeiro) foram utilizados nesta pesquisa como fonte de oxidoredutases (Figuras 2 e 3, respectivamente). As amostras foram colhidas no mês de junho (época da frutificação), à tarde na Fazenda Lagoa do Canto, município de Mulungú, Estado da Paraíba, acondicionadas em sacos plásticos e transportadas ao Laboratório de Análises de Alimentos da UFPB. 4.1.1. Preparo do material biológico Chegando ao Laboratório de Análises de Alimentos da UFPB, em João Pessoa, as folhas e os frutos foram higienizados por imersão em água destilada, secas ao ar livre em local sem raios solares incidindo diretamente sobre eles e em seguida submetidas à extração, para se obter o extrato bruto enzimático.
23 4.2. Métodos 4.2.1. Extração de peroxidase A extração de peroxidase de folhas do juazeiro foi realizada em ph 7,2 (MACIEL, 2002) e ph 8,0 (HOLSCHUH, 2000). As folhas do juazeiro foram triturados (separadamente) na presença de tampão fosfato de potássio 0,1 M, nos phs acima, previamente resfriado a 4 C na proporção de 1 g de amostra para 5 ml (p/v), em liquidificador doméstico durante 3 minutos a velocidade máxima. O material triturado foi filtrado em gaze com cinco dobras, sendo recolhido em banho de gelo e centrifugado a 5000 rpm em três períodos de 10 minutos e intervalos de banho de gelo para manter a temperatura baixa (Figura 4). O sobrenadante, denominado extrato bruto, foi submetido à determinação de atividade enzimática e teor de proteína. O ph que resultou em maior atividade foi adotado no restante do trabalho. 4.2.2. Determinação da atividade da peroxidase (POD) A atividade da POD foi determinada segundo Khan & Robinson (1994) com modificações. A solução reativa foi constituída de 0,1 ml de extrato bruto enzimático, 1,5 ml de solução de guaiacol a 1% em solução alcoólica a 50%, 0,4 ml de solução de H 2 O 2 0,1 M em tampão fosfato de potássio 0,05 M, ph 6,0 e 1 ml do mesmo tampão (total de 3 ml). O aumento da absorvância a 480 nm foi monitorado durante 5 minutos à temperatura ambiente. A atividade da
24 peroxidase foi calculada usando os dados relativos à porção linear da curva. Todas as leituras foram feitas em triplicata. Uma unidade (U) de enzima foi definida como a quantidade que provoca aumento de absorvância em 0,001 unidade por minuto e por ml da solução enzimática a 480 nm, tendo guaiacol como doador de H +. A atividade específica da peroxidase foi expressa em unidades de enzima por mg de proteína. 100g de amostra + 500 ml de tampão fosfato de potássio 0,1 M, ph 7,2 Trituração com liquidificador doméstico por 3 minutos Filtração com gaze (5 dobras) Centrifugação (5000 rpm) Sobrenadante (extrato enzimático bruto) Precipitado (descartado) Figura 4: Fluxograma de extração da peroxidase de folha ou fruto de juazeiro.
25 4.2.3. Determinação da atividade da polifenoloxidase (PPO) A atividade da polifenoloxidase (PPO) foi determinada usando mistura de reação constituída de: 0,1 ml de extrato bruto, 1,2 ml de solução de catecol 0,015 M em tampão fosfato de potássio 0,05 M (ph 7,0) e 1,7 ml do mesmo tampão fosfato de potássio 0,05 M (ph 7,0), perfazendo um total de 3,0 ml. A atividade da enzima foi calculada pela inclinação da curva no intervalo de pelo menos dois minutos na parte mais linear. Uma unidade de polifenoloxidase foi definida como a quantidade da enzima que ocasiona um aumento na absorvância a 420 nm de 0,001 unidade por minuto e por ml de solução enzimática, usando catecol como substrato (OKTAY et al., 1995). 4.2.4. Determinação de proteínas dos extratos enzimáticos Para cada procedimento da extração e da purificação parcial, o teor de proteína de cada fração foi determinado de acordo com o método descrito por Lowry et al. (1951), usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. 4.2.5. Precipitação fracionada Ao sobrenadante obtido da centrifugação do extrato (item 4.2.1.) foram adicionadas subseqüentemente quantidades tabeladas por Collowick & Kaplan (1951), de sulfato de amônio - (NH 4 ) 2 SO 4 - sólido (previamente macerado em gral com pistilo), perfazendo 20, 40, 60, 80 e 90% da saturação daquele sal em