Monitoria Sorológica em Matrizes de Corte e Postura Comercial Obiratã Rodrigues Méd Vét. MSc MercoLab Garibaldi bira@mercolab.com.br Porto Alegre, 22 de novembro de 2016.
Conhecer para Diagnosticar Etiologia Distribuição Patogênese Epidemiologia Sinais clínicos Lesões Diagnóstico Controle Tratamento Prevenção
Diagnóstico - Introdução A expressão de qualquer doença depende: Virulência do organismo envolvido; Nível de exposição ao agente; Susceptibilidade do hospedeiro;
Diagnóstico - Introdução Tempo/Rapidez; Segurança/confiabilidade; Representabilidade e Reprodutibilidade
Diagnóstico - Introdução
Conhecer para Diagnosticar Início dos sinais: Buscar o agente: Isolamento PCR Duas semanas após: Buscar Anticorpos ELISA
Coleta de amostras: Conhecimento teórico das enfermidades Histórico do lote Achados de necropsia Conhecimento epidemiológico/região Monitorias Vacinações Disponibilidade de diagnóstico Capacidade de interpretação
Objetivo das provas sorológicas Detectar infecção no plantel Avaliar imunidade maternal Desenhar e comparar programas vacinais Comparar dif.vacinas no mesmo programa Avaliar imunocompetência da ave Avaliar biosseguridade, desinfecção (desafios) Satisfazer requisitos para venda/exportação Identificar formas subclínicas Estabelecer perfil sorológico
Exames sorológicos As amostras destinadas ao diagnóstico sorológico deverão estar resfriadas a 4 º C Não serão aceitas amostras de sangue total, com presença de coágulo ou evidências de contaminação As amostras deverão ser, obrigatoriamente, divididas em duas alíquotas e identificadas, uma como prova e outra como contra-prova. PORTARIA 126, DE 03 DE NOVEMBRO DE 1995, DOU 06/11/1995
Exames sorológicos amostras destinadas ao exame sorológico deverão ser mantidas a temperatura de 4 C por não mais que 48 horas, até serem processadas. a contra-prova do diagnóstico sorológico deverão ser mantidas em temperatura de 20º C, por um período de 30 (trinta) dias. PORTARIA 126, DE 03 DE NOVEMBRO DE 1995, DOU 06/11/1995
Provas Sorológicas Soros armazenagem: Refrigeração: até 3 dias Congelamento: maior que 4 dias ; Turbidez = gordura ou contaminação bacteriana
Determinação do número de amostras sorológicas a serem coletadas confiabilidade 95% Tamanho da população ou lote Níveis de prevalência da enfermidade na população/lote 50% 25% 15% 10% 5% 1% 50 5 10 16 22 35 50 100 5 10 17 25 45 96 500 5 11 19 28 56 225 1000 5 11 19 29 57 258 5.000 5 11 19 29 59 290 10.000 5 11 19 29 59 294 INDICAÇÃO MÍNIMO 15-20, IDEAL 23 Oficial 300/150
Colab. Dr. Luciano Doreto
Diagnóstico Sorológico - Vigilância epidemiológica de doenças com importância sanitária estratégica (PNSA); - Monitoria de programas (Status) sanitários; - Certificação de propriedades ou áreas livres; - Comercialização de animais reprodutores; - Identificação e caracterização de surtos.
Principais Análises Sorológicas SAR IgM e altos níveis de IgG Reações inespecíficas ELISA Equipamento Kits importados HI Trabalhoso Antígeno-produção própria Análises complementares
INDIRETOS Anticorpos Inibição da hemaglutinação (HI) Soro Aglutinação Rápida Soro-neutralização (SN), ELISA
Sorologia: sensibilidade
SAR: soroaglutinação rápida em placas Detecta anticorpos no início da infecção SAR IgM e altos níveis de IgG Comum falsos positivos Inespecificidade (inativação) Teste rápido, simples e barato Teste de Triagem Pode ser utilizado no campo (pulorose)
Limitações Quantidade de anticorpos Qualidade do antígeno Dificuldade aquisição antígenos Reações inespecífica Inativação e diluição
SAR: MG, MS e Pulorose +++ ++ +
SAR: resultados Soro bruto/diluições: 1:10 (1:4) MAPA Pulorose reação cruzada com SE Resultado qualitativo (+/-) Positivo/Negativo (5/20, 0/20)
HI: inibição da hemaglutinação Detecta IgG- não detecta baixos níveis de IgG Técnica trabalhosa Sangue de aves SPF Alta especificidade Custo relativamente barato Dificuldade na obtenção de antígeno Teste confirmatório
HI: inibição da hemaglutinação Vírus hemaglutinantes: DNC IA EDS Bactérias hemaglutinantes: MG MS MM Coriza
Positivo Negativo Fonte: Abase
Controle Negativo Controle Positivo (1:80) Amostra 1 (1:320) Amostra 2 (1:20) Amostra 3 (Neg) Amostra 4 (1:40) Controle Antígeno Controle Hemácias 2012
HI GMT Resultado MG/MS DNC EDS Negativo < 1:40 < 1:8 < 1:8 Suspeito 1:40 1:8 1:8 Positivo >1:80 > 1:16 > 1:16
ELISA ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY - Sorologia - Detecção de anticorpos : IgG - Infecção
Principais enfermidades aviarias monitoradas por - IBD/ IBDxr - IBV - NDV - Reo - AE - Mg - Ms - PM - ORT - AI - Rev - ALV-J - LLAb Elisa Indireto Elisa CAV Elisa Competitivo
Elisa Indireto ou Leitora ELISA Densidade Óptica ( OD ) Razão S/P = OD amostra - CNx CPx - CNx Título
Cut-off Nota de corte : Ponto a partir do qual se distingue o positivo do negativo
Grupos de títulos G Título G Título G Título 0 0-396 8 7000-7999 16 24000-27999 1 397-999 9 10000-11999 17 28000-31999 2 1000-1999 10 12000-13999 18 >32000 3 2000-2999 11 14000-15999 4 3000-3999 12 16000-17999 5 4000-4999 13 18000-19999 6 5000-5999 14 20000-21999 7 6000-6999 15 22000-23999
Regras para obtenção de resultados consistentes Escolha do laboratório Escolha do método Boas práticas de laboratório Colheita de amostras
Colheita de amostras Idade 2-3 sem após vac.viva 4-6 sem após vac. inativada amostragem : 18-23 amostras frango de corte 23-30 amostras de reprodutoras manejo do sangue/soro
Amostragem randômica Sistemático Galpão : 30 aves Colher 15 aves por diagonal. x x Se a diagonal tiver 15 m, colher 1 ave a cada m. x x x x x x Bateria ou box: numere cada box e sorteie as baterias ou box que serão amostrados. X- Tome amostra aqui
Amostras e amostragem Qualidade da amostra: impacto no resultado Evitar amostras: muito hemolizadas muito lipêmicas contaminadas (turvo, mal cheiro) Recomendação: 1 - Colher o sangue e separar o soro dentro de 24 horas 2- Evitar que o soro fique por mais de 3 dias na geladeira 3- Congelar o soro a -20C 4- Evitar congelamento-descongelamento (máximo 3-5 ciclos) 5- Pintinhos saudáveis e com mais de 40-45 g
Estabelecer Objetivo Análise Comparativa Interpretação Estratégia
No. de animais Coeficiente de variação considerando-se o mesmo GMT Título de Elisa Fonte: Dra. Beatriz Cardoso, Amevea 2000 Amarelo (alto CV%): pintinho proveniente de matriz jovem ou de vários lotes Azul (alto CV%): Pintinho proveniente de vários lotes. No abate, pode ser desafio ou má vacinação. Vermelho (baixo CV%): boa uniformidade para anticorpos maternais
Anticorpo materno: IBD, IBV, NDV, REO e AE GMT>2000; CV40% Idade Resultado Obs 1-3 dia T CV Matriz baixa resposta T CV Matriz joven Origem? Matriz problema T CV idem T CV Matriz excelente resposta
Baseline esperado no abate quando se utiliza somente vacina viva Doença Titulo (GMT) IBD 2500-3500 NDV 500 IBV 500 Dados Dr. J. Witt, Instituto Deventer, Holanda
Análise do coeficiente de variação Resultado Obs T CV Nao desafiado T CV Infecção recente T CV Infecção precoce
Cuidado com interpretação de CV% em lotes com GMT baixo
Cuidado com interpretação de CV% em lotes com GMT baixo GMT baixo, CV% alto não indica infecção Count : 15 Mean : 640 Gmean: 408 %CV : 80%
Infecção recente (aguda) Count : 15 Mean : 2780 Gmean: 1255 CV : 115% Count : 15 Mean : 4625 Gmean: 2544 CV% : 95.5%
Infecção Crônica Count : 15 Mean : 5428 Gmean: 4575 CV : 41% Count : 15 Mean : 7137 Gmean: 6525 CV : 25%
Count 6 5 4 3 2 1 0 ANEMIA-CAV 0 1 2 3 4 Titer Groups Count: 10 Mean: 7096 GMean: 6769 SD: 1983 %CV: 27,9 Min: 3561 Max: 8661 Tech:DANI Date:3/11/09 Dil:1:100
Anemia - CAV100 Count 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 Titer Groups Count: 20 Mean: 2965 GMean: 2010 SD: 2754 %CV: 92,9 Min: 999 Max: 8661 Tech:HUGO Date:12/11/09 Dil:1:100
Sorologia Matrizes
Programa de monitoria : Objetivo e frequência de colheita Anticorpos maternais: - Avaliação da imunidade passiva - Estimar de data de vacinação (Deventer) Monitoria de vacinação : - Avaliação da eficiência da equipe de vacinadores - Avaliação da manutenção imunidade ativa - Avaliação do programa de vacinação Detecção de desafio (análise comparativa / pareada)
1 3 5 7 9 12 16 20 30 40 50 60 Título de anticorpos Baseline em reprodutoras pesadas vacinadas com vacinas vivas e inativadas - Pontos críticos Idade em semanas
0-1 8-0 13-0 18-0 28-0 33-0 43-0 58-0 63-0
O que é aumento de título? Considera-se que há um aumento significativo estatisticamente quando o título sobe em 2-3 Log.. 2 7 = 128 2 12 = 4096 2 8 = 256 2 13 = 8192 2 9 = 512 2 14 = 16384 2 10 = 1024 2 15 = 32768 2 11 = 2048
Recria - resposta de vacina viva desafio
25 semanas de idade- resposta da oleosa 21s 26s 28s
Controle em granjas com títulos acima de do esperado. Objetivo : 1. Diminuir a carga viral no galpão 2. Aumentar a imunidade das aves Estratégia 1. Higiene 2. Imunidade passiva: Anticorpos maternos 3. Imunidade ativa : Vacina adequada Número de doses adequadas Data de vacinação
Interpretação e estratégia de controle Lote Vacinado Título Alto Título Baixo Produção dentro do esperado Produção abaixo do esperado Produção dentro do esperado Infecção e Proteção Infecção, Desafio, Doença Lote saudável Biosseguranca! Isolar agente controle / biosseguranca
CONCLUSÕES Não existe um título padrão esperado universal. Cada empresa deve ter o seu baseline. Nem sempre é possível correlacionar título com proteção. Existem inúmeras variáveis envolvidas na resposta imune. A resposta humoral é uma delas.
O B R I G A D O! bira@mercolab.com.br