REDE LABORATORIAL DE DENGUE

Transcrição

1 Capacitação em Eventos REDE LABORATORIAL Área de Produção Editorial e Gráfica Núcleo de Comunicação Secretaria de Vigilância em Saúde DE DENGUE 23 e 24 de junho de 2010 CGLAB/SVS/MS Vanessa.porto@saude.gov.br 27 de outubro de 2011

2 ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DA CGLAB Coordenação-Geral Coordenação-Geral Adjunta Coordenação de Administração e Planejamento Coordenação de Laboratórios de Vigilância em Saúde Ambiental, Ecologia e Saúde do Trabalhador Coordenação de Laboratórios de Vigilância Epidemiológica Coordenação de Desenvolvimento Institucional GT Administração GT Planejamento, Monitoramento e Avaliação GT Infraestrutura, Insumos e Tecnologia de Equipamentos GT Saúde Ambiental GT Saúde do Trabalhador GT Entomologia e Reservatórios de Interesse da Saúde GT Virologia GT Bacteriologia GT Parasitologia GT Micologia e Outras Etiologias GT Tecnologia da Informação GT Ações Estratégicas e Projetos Especiais GT Biossegurança e Gestão da Qualidade

3 COMPETÊNCIA DA CGLAB Coordenar, normalizar e supervisionar as sub-redes de laboratórios pertencentes ao Sistema Nacional de Laboratórios de Saúde Pública, nas atividades de Vigilância Epidemiológica e Vigilância Ambiental.

4 Portaria Ministerial nº 15, de 03 de janeiro de 2002 Republicada como Portaria nº 2031 em 2004 Dispõe sobre a organização do Sistema Nacional de Laboratórios de Saúde Pública - SISLAB agravos ou programas É composto de um conjunto de redes de laboratórios, organizadas em sub-redes, por : grau de complexidade das atividades, de forma hierarquizada; atividades relacionadas à vigilância epidemiológica, vigilância ambiental em saúde, vigilância sanitária e assistência médica.

5 SISLAB REDES NACIONAIS DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA DE VIGILÂNCIA AMBIENTAL EM SAÚDE DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA DE ASSISTÊNCIA Centros Colaboradores Laboratórios de Referência Nacional Laboratórios de Referência Regional Laboratórios de Referência Estadual Laboratórios de Referência Municipal Laboratórios de Fronteiras Laboratórios Locais

6 Participar de cooperações internacionais Controlar a qualidade das análises nas sub- redes de laboratórios Capacitar recursos humanos Realizar procedimentos diagnósticos de alta complexidade Laboratório de Referência Nacional Participar na elaboração de manuais e normas técnicas Desenvolver estudos diagnósticos e pesquisas Disponibilizar ao MS relatórios técnicos periódicos

7 Encaminhar ao LRN, amostras inconclusivas, e as de complementação de diagnósticos Controlar a qualidade das análises LACEN da sua região Capacitar recursos humanos Laboratório de Referência Regional Realizar procedimentos diagnósticos de maior complexidade Assessorar, acompanhar e avaliar as atividades dos LACEN da sua região Disponibilizar ao LRN relatórios técnicos periódicos

8 Rede de Laboratórios de Dengue no Brasil Laboratório de Referência Nacional INSTITUTO EVANDRO CHAGAS-IEC Região Norte + Piauí + Maranhão Laboratório de Referência Regional LACEN/PE- Região Nordeste Laboratório de Referência Regional LACEN/DF - Região Centro Oeste Laboratório de Referência Regional FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ -FIOCRUZ/RJ Região Sudeste + Bahia Laboratório de Referência Regional INSTITUTO ADOLFO LUTZ-IAL Região Sul + São Paulo Laboratórios Estaduais - LACEN

9 Coordenar a rede de laboratórios públicos e privados Controlar a qualidade das análises na rede de laboratórios Capacitar recursos humanos Complementar diagnóstico Laboratório Estadual de Saúde Pública Habilitar laboratórios para integrar a rede estadual Encaminhar amostras ao LRR Disponibilizar Informações ao MS por meio relatórios

10 Rede de Laboratórios Estaduais RR AP AC AM RO PA TO MA PI CE RN PB PE AL SE MT BA DF MS GO MG ES PR SP RJ SC Laboratório Central de Saúde Pública - LACEN RS

11 Definir, organizar e coordenar a rede de laboratórios Supervisionar e assessorar a rede de laboratórios Capacitar recursos humanos Realizar análises básicas Laboratórios de Referência Municipal Habilitar laboratórios para integrar a rede municipal Encaminhar amostras ao LACEN Disponibilizar Informações ao LACEN por meio relatórios

12 Desenvolver estudos, pesquisas e ensino de interesse do gestor nacional Colaborar no desenvolvimento científico e tecnológico das unidades da rede Centro Colaborador Capacitar recursos humanos Realizar procedimentos diagnósticos de alta complexidade Disponibilizar ao MS relatórios técnicos periódicos

13 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL LRN e CC: Exames de alta complexidade LRR: Confirmação das amostras, técnicas mais avançadas LACEN: Sorologia (27), Isolamento (19), RT-PCR (10) Laboratórios Municipais: Sorologia Obs: As metodologias desenvolvidas em cada estado podem variar, conforme a condição técnica instalada nos laboratórios. Em caso de surto, 10 % das amostras devem ser processadas no laboratório, e o fechamento das outras amostras será critério epidemiológico

14 SITUAÇÃO ATUAL DA REDE DE DENGUE 1 Laboratório de Referência (IEC/PA) e 5 Laboratórios de Referência Regional (IAL/SP, FIOCRUZ/RJ, LACEN/DF, LACEN/PE e IEC/PA) 27 LACEN e 117 Laboratórios Municipais realizam sorologia para dengue 17 LACEN e 2 Institutos realizam Isolamento Viral (GO, MS, DF, CE, PE, BA, AL, MG, RJ, SP, TO, PR, RR, RN, AP, ES, RO, IEC/PA e FIOCRUZ/RJ) 8 LACEN e 2 Institutos realizam RT-PCR (CE, GO, PE, RS, RJ, DF, MG IAL/SP, IEC/PA e FIOCRUZ/RJ)

15 PRINCIPAIS Capacitação em Eventos TÉCNICAS Área de Produção Editorial e Gráfica Núcleo de Comunicação Secretaria de Vigilância em Saúde LABORATORIAIS 23 e 24 de junho de 2010 PARA DENGUE

16 SOROTIPOS DE DENGUE ISOLADOS POR UF, 2011

17 VIGILÂNCIA LABORATORIAL Diagnóstico Sorológico Diagnóstico Virológico UF Examinados Positivos % positividade Inoculados Positivos % positividade DEN 1 DEN 2 DEN 3 DEN 4 GO , , DF , , MS , , MT , , RS , , PR , , SC , , SP , , RJ-FIOCRUZ , , RJ , , MG , , ES , , AC , , AP , , AM , , PA , , RO , , RR , , TO , , AL , , BA , , CE , , MA , , PB , , PE , , PI , , RN , , SE , , TOTAL , , * Dados atualizados até setembro 2011

18 Pesquisa de Vírus DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Isolamento: Cultura de células C6/36 ou Inoculação em camundongos recem-nascidos. Detecção de ácido nucléico: RT-PCR Pesquisa de Anticorpos Ensaio imunoenzimático: MAC-ELISA, Elisa IgG, Elisa IgM Inibição da hemaglutinação (IH) Kits Comerciais Exame Histopatológico e Detecção de Antígeno por Imunohistoquímica

19 ISOLAMENTO VIRAL É a técnica padrão ouro (gold standard) para diagnóstico virológico. Permite a identificação do sorotipo viral (DEN 1, DEN 2, DEN 3 e DEN 4). A replicação do vírus é evidenciada pela produção de efeito citopático, ou seja, alterações na morfologia celular. A técnica possui grande sensibilidade (capaz de detectar quantidades mínimas do vírus). A coleta do material deve ser feita na fase aguda da doença ou seja no período de viremia.

20 ISOLAMENTO VIRAL EM CULTURA DE CÉLULAS C6/36 A B A Sangue, soro (fase aguda) B suspensão de tecido (óbito) Imunofluorescência direta (A) células não inoculadas (B) células infectadas - VFA

21 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE TRANSCRIPTASE REVERSA (RT-PCR) É uma técnica de biologia molecular altamente específica e sensível. Permite a detecção e a amplificação gênica sequencial de fragmentos de DNA do vírus.. Identifica os sorotipos virais da dengue.

22 REVERSE TRANSCRIPTASE - POLIMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) 1 - Negativo 2 - Dengue Dengue Dengue Dengue Negativo 7 - Água 8 - Peso molecular IDENTIFICAÇÃO VISUALIZAÇÃO Fonte: Lanciotti et al., 1991

23 FATORES QUE INTERFEREM NO SUCESSO DAS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO VIRAL E RT-PCR Coleta do material feita fora do período de viremia. Manipulação inadequada da amostra (contaminação). Termolabilidade do vírus Armazenamento fora das condições ideais. Longo período de transporte da amostra até o LACEN Ausência de informações importantes para o direcionamento da técnica a ser executada: data de início dos sintomas; data da coleta

24 1. KIT ELISA IGM KITS COMERCIAIS - Ensaio imunoenzimático - Amostras de soro coletadas após o 5º dia de início dos sintomas 2. KIT ELISA NS1 - Ensaio imunoenzimático para detecção qualitativa do antígeno NS1 - Amostras de soro até o 3º dia de início dos sintomas - Triagem para o isolamento viral

25 MAC - ELISA Considerada técnica padrão-ouro para captura de Anticorpos IgM Anticorpos IgM são capturados do soro do paciente para a parede dos poços da placa por um anticorpo anti IgM humana O anticorpo IgM capturado é colocado para reagir com antígeno do VDEN. Se a IgM investigada estiver presente, o respectivo antígeno se liga à mesma. A presença do complexo antígeno-anticorpo é demonstrado pelo sistema revelador do teste (conjugado e substrato) Permite realizar o diagnóstico presuntivo de infecções recente ou ativa

26 MAC ELISA Microplaca para teste de ELISA Anti-IgM humana IgM humana (soro do paciente) Antígeno Conjugado ( peroxidase) Substrato (Sistema ABTS)

27 FATORES QUE INTERFEREM NO SUCESSO DA TÉCNICA DE MAC ELISA Coleta do material feita no período de viremia ocasionando resultados falso-negativos. Em caso de infecção secundária o sistema imune do paciente responde com uma quantidade de IgM muitas vezes indetectável. Manipulação inadequada da amostra(contaminação). Armazenamento fora das condições idéias (desnaturação de proteínas). Sensibilidade e Especificidade do kit.

28 SENSIBILIDADE DA TÉCNICA DE ISOLAMENTO/SOROLOGIA ELISA Isolamento Dias pós-infecção

29 INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO É utilizado em infecções secundárias, onde a produção do IgM ocorre em níveis baixos. É um teste simples e rápido e pode ser utlizado para qualquer vírus que cause hemaglutinação. A técnica é baseada na capacidade que as proteínas (hemaglutininas) existentes na superfície do DENV, tem de aglutinar hemácias de ganso e humanas do grupo O. A presença de anticorpos específicos na amostras de soro do paciente irá inibir a capacidade hemaglutinante do vírus. O teste deve ser realizado em amostras pareadas O soro teste é incubado em diferentes diluições contra uma quantidade fixa de vírus.

30 INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO Anticorpos anti-vden Anticorpo não específico Antígeno do VDEN Hemácias de Ganso HEMAGLUTINAÇÃO INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

31 IMUNOHISTOQUÍMICA O objetivo principal é o encontro e localização topográfica de antígenos nos tecidos ou células. Tem sua maior aplicação no estudo de doenças infecciosas e neoplásicas.

32 COLETA DE AMOSTRAS CONCEITO CONCEITO CONCEITO Paciente com Suspeita de Dengue Isolamento -Pesquisa do vírus Sangue Total/Soro 1º ao 5º dia de doença Coletar amostra Sangue Total/Soro Sorologia Pesquisa de Anticorpos A partir do 5º dia Conservar a 20ºC Conservar a 70ºC Positivo IgM Confirmado por Lab. Negativo IgM Descartado

33 COLETA, CONSERVAÇÃO CONCEITO E TRANSPORTE DE AMOSTRAS PARA PESQUISA DE VÍRUS Espécime/Coleta Sangue* (soro)/ até 5 dias após o início dos sintomas Tecidos (óbito)/ Ideal: 8 hs Máximo: 24 hs Conservação/ Transporte -70 C/ Gelo seco -70 C/ Gelo seco Tipo de Análise Isolamento viral PCR Isolamento viral PCR * Retração do coágulo: 2-6 horas a 4 C.

34 COLETA, CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE DE AMOSTRAS PARA PESQUISA DE ANTICORPOS Espécime/ Coleta Sangue* (soro)/ > 5 dias após o início dos sintomas Sangue* (soro)/ 1ª amostra: até 7 dias 2ª amostra: dias (após o início dos sintomas) Conservação / Transporte -20 C/ Gelo seco ou comum -20 C/ Gelo seco ou comum Tipo de Análise Detecção de anticorpos IgM (MAC-ELISA) Detecção de anticorpos IgG (IH, ELISA) * Retração do coagulo: 2-24 horas à temperatura ambiente.

35 EXAME HISTOPATOLÓGICO Espécime/ Coleta Tecidos (óbito) Ideal: 8 hs Máximo: 24 hs Conservação/ Transporte Temperatura ambiente/ Formalina tamponada Tipo de Análise Histopatologia Imunohistoquimica

36 FLUXO DE ENVIO DA AMOSTRA

37 FLUXO DE ENVIO DE INFORMAÇÕES CGLAB Programa Laboratórios de Referência Nacional Laboratório de Referência Regional Laboratório de Referência Estadual - LACEN Vig. Epidemiológica Estadual Laboratório de Referência Municipal Vig. Epidemiológica Municipal Unidade Básica/Laboratório Local/Unidades Hospitalares

38 Laboratório de Saúde Pública Vigilância em Saúde Assistência em Saúde Ações em Saúde

39 OBRIGADA!!!

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