Aminoácidos: Glicina A glicina é o mais simples dos aminoácidos. Devido à simplicidade da sua cadeia lateral este resíduo é facil de acomodar em estruturas proteícas, podendo surgir em qualquer local e em qualquer conformação. H NH 2 COOH C α H O carbono α da glicina não é um centro assimétrico, não existindo assim isómeros ópticos da glicina. Diagrama deramachandran ilustrando as zona de conformacionais accessíveis aos vários aminoácidos. A glicina apresenta uma zona muito superior a qualquer outro resíduo, devido ao reduzido volume do seu grupo R.
Aminoácidos alifáticos: Ala, Val, Leu, Ile Ácidoα-amino butírico O aminoácido de dois carbonos alifáticos na cadeia, ácido α- amino butírico, não é um dos 20 aminoácidos constituintes das proteinas biológicas. Os resíduos alifáticos são bastante inertes quimicamente, visto só conterem grupos metilo (-CH 3 ) e etileno (-CH 2 -). No entanto, a sua hidrofobicidade confere-lhes importantes características estruturais (ocorrem normalmente na região interior das proteínas globulares). A tendência destes resíduos para evitar o meio aquoso contribui de modo fundamental para a estabilização da estrutura nativa. 95% de Ocultação 1 0,5 Fracção 0 Ile Val Phe Leu Met Ala Trp Ser Thr His Tyr Glu Asp Asn Gln Lys Arg Fracção de cada um dos resíduos de aminoácido que se encontra ocultada a pelo menos 95% num conjunto representativo de proteinas globulares. Note-se os valore elevados dos resíduos alifáticos (a vermelho).
Aminoácidos: acessibilidade ao solvente Área superficial (nm 2 ) 100% de ocultação 95% de ocultação Fracção média ocultada Ile 1,8 0,18 0,60 0,90 Val 1,6 0,18 0,54 0,88 Phe 2,2 0,14 0,50 0,89 Leu 1,8 0,16 0,45 0,87 Met 2,05 0,11 0,40 0,83 Ala 1,15 0,20 0,38 0,78 Trp 2,6 0,04 0,27 0,88 Ser 1,2 0,08 0,22 0,62 Thr 1,45 0,08 0,23 0,60 His 1,95 0,02 0,17 0,78 Tyr 2,3 0,03 0,15 0,74 Glu 1,85 0,03 0,18 0,74 Asp 1,5 0,04 0,15 0,67 Asn 1,6 0,03 0,12 0,61 Gln 1,9 0,01 0,07 0,61 Lys 2,1 0,00 0,03 0,60 Arg 2,4 0,00 0,01 0,51 A área superficial indicada na tabela refere-se a cada resíduo no tripéptido Gly-X-Gly (valor máximo) A percentagem de ocultação denota a fracção da área de cada resíduo que não está em contacto com o solventa na estrutura nativa As fracções foram calculadas para um conjunto de estruturas de proteínas não-aparentadas Mesmo os resíduos mais hidrofílicos ocultam, em média, uma fracção importante da sua área
Aminoácidos: Pro cis-prolina A cadeia lateral da prolina tem como característica mais importante o estar ligada ao azoto da ligação peptídica precedendo o carbonoα, com as seguintes consequências: O azoto da ligação peptídica nao tem o átomo de hidrogénio capaz de formar ligações ligacações de hidrogénio estabilizadoras da estrutura secundária O angulo de torsão φ do resíduo de prolina encontra-se preso, nao podendo adoptar a gama de valores normalmente acessíveis a um resíduo A ligação peptídica não é estabilizada por ressonância A diferença entre a estabilidade das formas cis e trans da ligação peptídica precedendo o resíduo de prolina é muito pequena, sendo estas ligações cis observadas em algumas proteínas
Os resíduos aromáticos: Phe, Tyr, Trp Phe Tyr Trp Phe A fenilalanina é um único dos resíduos aromáticos que é completamente hidrofóbico, com uma preferência clara para o interior das proteínas e para as estruturas secundárias regulares. Químicamente semelhante ao benzeno, é apolar e muito pouco reactivo em condições de interesse para proteínas
Os resíduos aromáticos: Phe, Tyr, Trp Tyr A tirosina possui um grupo hidroxilo de pk a ~10, estando portanto ionizado em muito pequeno grau em condições fisilógicas. O grupo hidróxilo é, no entanto, um formador de ligações de hidrogénio e pode participar em reacções tais como a acetilação:
Os resíduos aromáticos: Phe, Tyr,Trp Tyr(cont.) A presença do grupo -OH confere uma certa electrofilicidade ao anel de tirosina, tornando-o reactivo em reacções de substituição electrófila, originando diversos derivados:
Os resíduos aromáticos: Phe, Tyr,Trp Trp A cadeia de triptofano é a maior e a que ocorre menos frequentemente nas sequências proteícas. Tem um hidrogénio disponível para formar uma ponte, mas mesmo assim é extremamente hidrofóbico. Juntamente com Phe e Tyr constitui um elemento frequente do core das proteínas globulares, seja empacotado ao longo de uma sequência de ligações péptídicas, seja de grupos metilo de resíduos alifáticos. A cadeia de Trp pode sofrer oxidação irreversível por parte do ozono ou outros agentes oxidantes, ou ser alquilado de modo a introduzir uma variedade de grupos que alteram as suas propriedades de fluorescência e/ou absorvência.
Propriedades espectroscópicas dos resíduos aromáticos Os resíduos aromáticos são responsáveis pela principal parte da absorvência e fluorescência das proteínas na gama dos ultravioleta. Estas propriedades são extremamente sensíveis ao ambiente dos resíduos, tornando-os excelentes pontas de prova para analisar as propriedades estruturais do micro-ambiente circundante. O triptofano absorve mais fortemente e no comprimento de onda mais longo (λ max =280 nm). A fluorescência do triptofano tem um máximo entre 300 e 350 nm. O máximo de emissão varia inversamente com o grau de ocultação do resíduo na proteína, permitindo por exemplo analisar alterações conformacionais.
Propriedades espectroscópicas dos resíduos aromáticos A tirosina tem um máximo de absorção próximo do do triptofano, mas dependendo do estado de ionização do resíduo (a desprotonação da tirosina desloca o máximo de 274 para 293 nm). A modificação da tirosina, por exemplo para nitrotirosina, pode deslocar o pk a do grupo para valores mais úteis, aumenta ainda mais o deslocamento de absorção observado. O estudo do espectro da nitrotirosina permite avaliar a carga do meio circundante. Por outro lado, a titulação com tetranitrometano permite avaliar o grau de exposição dos resíduos de tirosina ao solvente. ε-nitrotirosina
Aminoácidos hidroxílicos: Ser, Thr CH 2 O H CH 3 CH 2 O H Ser Thr As cadeias da serina e da treonina são alifáticas, mas possuem um grupo hidroxilo polar que lhes confere propriedades características. São dadores ou aceitadores na formação de ligações de hidrogénio. A reactividade destes resíduos é comparável à do etanol, pelo que não participam em muitas reacções de interesse para as proteínas. A treonina tem um carbono β assimétrico, ocorrendo apenas um dos isómeros nos organismos vivos. A treonina tem um carácter um pouco mais hidrófobo que a serina, ocorrendo mais frequente no interior das proteínas globulares que esta última. O resíduo de serina surge mais frequentemente em regiões desordenadas em loops, devido às suas pequenas dimensões.
Aminoácidos ácidos: Asp, Glu ponte salina As cadeias laterais de Asp e Glu diferem apenas num grupo metileno, todavia a diferença é suficiente para provocar importantes diferenças de reactividade e de função estrutural. Estes resíduos estão normalmente ionizados a ph fisiológico, sendo uma fonte de carga negativa na proteína. Por esta razão, ocorrem muito mais frequentemente na superfície exterior das proteínas. Os oxigénios destes resíduos podemactuar como aceitadores em ligações de hidrogénio, ou formar pontes salinas com resíduos positivamente carregados.
Aminoácidos ácidos: Asp, Glu Asp e Glu podem ser quelantes eficazes de ião metálicos numa proteína.na figura, dois resíduos Asp e dois Glu complexam um ião Ca 2+ na parvalbumina
Aminoácidos ácidos: Asp, Glu A reactividade química dos resíduos Asp e Glu é semelhante à dos ácidos orgânicos correspondentes - esterificação, acoplamente a aminas ou redução a álcoois são as reacções mais comuns O estado de ionização de um grupo carboxilo pode, por vezes, ser determinado pela sua susceptibilidade a diferentes reagentes orgânicos. Compostos como os ésteres de diazoacetato e as amidas reagem com forma não-ionizada: Por outro lado, os epóxidos reagem com a forma ionizada:
As amidas: Asn, Gln Ocorrem naturalmente, e não por amidação de Asp e Glu, sendo incorporadas directamente nas proteínas. Não são muito reactivos, mas são polares e simultaneamente dadores e aceitadores de ligações de hidrogénio. Os grupos amida são lábeis para extremos de ph e temperatura, podendo desamidar em Asp e Glu. A ph alcalino, Asn é muito mais lábil que Gln pois a sua cadeia lateral pode interagir com o -NH do resíduo seguinte para formar um derivado succinimidílico: t ½ = 1.4 dias 37 o C,pH=7.4 Esta reacção é 30 a 50 vezes mais lenta se o resíduo seguinte não for um glicina, devidos aos impedimentos estéricos da cadeia lateral.
As amidas: Asn, Gln Os resíduos de Gln na primeira posição de uma cadeia polipéptídica ciclizam espontâneamente de acordo com a reacção:
Os resíduos básicos: Lys, Arg Lys Os resíduos de Lys encontram-se quase sempre à superfície das proteínas, devido à carga positiva do grupo amina terminal que, tendo um pka de 11.1, se encontra ionizado na maioria das condições fisiológicas. O N terminal é um nucleófilo muito potente na sua forma neutra, podendo participar em diversas reacções orgâncias tais como alquilação, arilação e acilação. A velocidade com que estas reacções se dão tende a aumentar com o ph, pois aumenta o número de grupos não ionizados. O número de grupos amina pode ser determinado através da reacção com o sulfonato de 2,4,6-trinitrobenzeno (TNBS):
Os resíduos básicos: Lys, Arg O número de grupos amina pode ser determinado através da reacção com o sulfonato de 2,4,6-trinitrobenzeno (TNBS): O grupo modificado absorve fortemente na região dos 367 nm, podendo a reacção ser seguida espectrofotométricamente.
Os resíduos básicos: Lys, Arg Arg A cadeia lateral de Arg consiste em 3 grupos metileno apolares e um grupo guanidina fortemente básico (pka~12). A forma protonada deste grupo é estabilizada por ressonância, sendo o grupo guanidina planar e simétrico em torno do carbonoζ (3 ligações de carácter híbrido)
Os resíduos básicos: Lys, Arg Arg (cont.) A forma protonada do grupo guanidínico é muito pouco reactiva, e a ph fisiológico a fracção de grupos não protonados é extremamente pequena. No entanto, observamse algumas reacções, como seja a condensação heterocíclica com compostos dicarbonilo. Exemplo:
Os resíduos básicos: Lys, Arg Arg (cont.) O grupo guanidínico pode ser também clivado pela hidrazina, dando origem à cadeia lateral da ornitina: Esta reacção é geralmente acompanhada pela cisão da cadeia polipeptídica.
Os resíduos básicos: Lys, Arg Lys - o resíduo de maior mobilidade nas proteínas, a sua cadeia longa e flexível extende-se para o solvente e pode assumir uma enorme variedade de conformações. Por este motivo, os átomos a partir do carbonoβsão muitas vezes invisíveis nas densidades electrónicas obtidas por difracção de raios X. Apesar da natureza consideravelmetne hidrofóbica da sua cadeia lateral, é o resíduo que oculta a menor fracção de área ao solvente Arg - as cadeias de arginina são mais ordenadas que as de lisina e ocultam uma maior área fraccional. Embora seja extremamente raro encontrar uma Arg totalmente oculta, a sua cadeia lateral forma muitas vezes uma superfície hidrofóbico com extensos contactos de vdw que pode fazer o papel de um resíduo hidrofóbico. Conformações da Lisina Ligações de hidrogénio entre a Arginina e H 2 O
A histidina A cadeia de imadazol da histidina tem características um pouco à parte das dos outros resíduos. O imidazol tem um pka próximo de 7, sendo portanto uma base extremamente forte a ph neutro. O azoto não-protonado da histidina é um nucleófilo extremamente potente a ph 7 e um aceitador de ligações de hidrogénio, enquanto o azoto protonado é electrófilo e dador de hidrogénio. O resíduo de histidina apresenta assim uma extrema versatilidade química, ocorrendo frequentemente nos centros activos enzimáticos. Uma das reacções mais específicas para os resíduos de His é a com o dietilpirocarbonato (revertida pela hidroxilamina):
A histidina Os resíduos de histidina são extremamente úteis na análise da estrutura das proteínas por 1 H-NMR, porque a ressonância do carbonoε 1 se destaca perfeitamente das ressonâncias dos outros hidrogénios polipeptídicos. Ressonância característca
A histidina: equilíbrio ácido-base
Resíduos com enxofre: Cys, Met Met A metionina é um resíduo bastante hidrofóbico, e o único resíduo não-polar que nao possui cadeia ramificada. O átomo de enxofre tem um caracter nucleofílico, e dado que não pode ser protonado, é o nucleofilo mais potente nas proteínas a ph ácido. Nessas condições apresenta especificidade para várias reacções, tais coma formação de sulfonatos a partir da reacção com agentes alquilantes como o iodeto de metilo:
Resíduos com enxofre: Cys, Met O átomo de enxofre de Met associar-se ao PtCl -2 4 formando um complexo nãocovalente (utilizado no método de substituição de átomos pesados para elucidação de estruturas por difracção de raios X). Outra reacção possível é a oxidação pelo ar ou por outros reagentes oxidantes como o peróxido:
Resíduos com enxofre: Cys, Met Cys O resíduo de cisteína é o mais reactivo de todos os resíduos, apresentando uma extraodinária versatilidade química e estructural. Podem ocorrer 3 tipos de resíduos Cys em proteínas: cys livres - são resíduos de cisteína que nao se encontram químicamente ligados, e que desempenham um papel puramente estrutural. Apesar da semelhança aparente com a Ser, o resíduo Cys tem propriedades bem distintas, sendo um muito pior formador de ligações de hidrogénio e aparecendo como um dos resíduos com maior percentagem de ocultação no interior da proteína. cys ligadas - as cisteínas podem ser ligandos para uma grande variedade de metais e grupos prostéticos, incluindo Fe, Zn, Cu, centros de Fe-S e hemos. Geralmente duas ou quatro cisteínas com um espaçamento pequeno na sequência aparecem como ligandos do grupo prostético cistinas - pares de resíduos de cisteína ligados em pontes de persulfureto -S-S-, têm um papel muito importante na estabilização da estrutura nativa das proteínas extracelulares (o meio intracelular é redutor, pelo que a maioria das proteínas intracelulares não apresenta pontes de persulfureto).
Resíduos com enxofre: Cys, Met Sendo Cys o mais reactivo de todos os resíduos, existe uma lista extensa de reacções características. Apontam-se aqui algumas das mais conhecidas. A forma carregada da cisteína (pk a ~9) pode reagir com aletos de alquilo, como o iodoacetato, orginando os correspondentes derivados de alquilo. Ex: A reacção com a etilenoimina: forma um resíduo positivamente carregado que é local de clivagem para tripsina, para alem dos habituais Lys e Arg, o que tem utilidade para a sequenciação de péptidos.
Resíduos com enxofre: Cys, Met Os grupos tiol formam complexos com uma variedade de compostos contendo metais pesados. A reacção com o ácido p-mercuribenzóico: (cont.) tem uma estequiometria precisa de 1:1 e pode ser usada para titular os grupos tiol através medidas espectroscópicas. As reacções com compostos de mercúrio são, também, um dos métodos mais usados para produzir proteínas com substituintes metálicos para cristalografia de raios X. Os grupos tiol podem formar complexos com uma variedade de iões de elementos metálicos incluindo prata, cobre, ferro, zinco, cobalto, molibdénio, manganésio e cádmio.
Resíduos com enxofre: Cys, Met Para além da forma tiólica, existem apenas dois estados de oxidação do enxofre de Cys geralmente observados, o persulfureto (-S-S-), produzido pela oxidação atmosférica: Cistina e os ácidos sulfónicos, produzidos por agentes oxidantes mais potentes:
Resíduos com enxofre: Cys, Met O equílibrio entre tióis e persulfuretos: é próximo da unidade para tios alifáticos simples e persufuretos. Uma vez que a espécie reactiva é o aniáo tiolato, a extensão da reacção aumenta com o ph. O equílibrio entre tióis e persulfuretos aromáticos está na base de um dos métodos mais convenientes para determinação do número de grupos tiol numa proteína - o ácido ditiobisnitrobenzóico (reagente de Ellman, DTNB) é adicionado em excesso a uma solução de proteína:
Resíduos com enxofre: Cys, Met (cont.) produz quantidades estequiométricas do composto NTB de cor amarela viva, que pode ser doseado espectrofotometricamente. As pontes persufulfureto das proteínas podem ser reduzidas eficazmente por reagente tiólicos como o mercaptoetanol: O reagente de Cleland, ditiotreitol, é tambem muito usado para quebrar pontes -S-Sem proteínas e moléculas pequenas: A grande estabilidade do anel intermolecular do produto faz com que o equilíbrio esteja largamente deslocado para a direita.