EFEITO DA FONTE PROTEICA E PROBIÓTICO NO TRATO INTESTINAL DO LITOPENAEUS VANNAMEI Klayton Natan MORAES 1, Jorge Pedro RODRIGUES-SOARES 2, Felipe do Nascimento VIEIRA 2, Adolfo JATOBÁ³. 1 Bolsista 168/2014 PIBIC/CNPq, 2 Pesquisador UFSC, 3 Orientador IFC-Campus Araquari. Introdução A utilização de aditivios alimentares suplementados as dietas com capacidade de aumentar a imunocompetência dos organismos aquáticos tornam se novas medidas a serem tomadas, entre eles podemos destacar a suplementação probiótica (Jatobá et al., 2008; 2011). A farinha de peixe é a principal fonte proteica utilizada nas dietas comerciais de camarões marinhos, por apresentar um bom perfil nutricional (Sookying et al., 2013). Atualmente, estudos nutricionais visam encontrar um ingrediente renovável, com caracteristicas semelhantes aos da farinha de peixes e menor/semelhante custo (Hardy, 2010; Sookyinget al., 2013). O uso de fontes proteicas de origem vegetal como o concentrado proteico de soja tornou-se o foco dos estudos de substituição de proteína marinha na alimentação de camarão em todo o mundo por causa de seu nível de proteína aceitável, conteúdo de aminoácidos essenciais adequados, oportunidades econômicas, qualidade e ser considerado um ingrediente renovável (Sookying etal.,2013). O trabalho teve como objetivo de avaliar o uso do probiótico (Lactobacillusplantarum)em dietas com diferentes fontes proteicas,farinha de peixe (FP) e concentrado proteico de soja (CPS),e seus efeitos na microbiota do camarão marinho (Litopenaeus vannamei). Material e Métodos O trabalho foi realizado no Laboratório de Aquicultura (LAQ) do IFCatarinensecâmpus Araquari, em conjunto com o Laboratório de Camarões Marinhos (LCM) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Foram formuladas duas dietas, isoenergéticas e isoproteicas, com diferentes fontes proteicas, farinha de peixe e concentrado proteico de soja (Tabela 1). As dietas foram formuladas com 271 a 274 g.kg -1 de proteína digestível estimada, com base nas exigências nutricionais para camarões marinhos (NRC, 2011) e isoenergéticas com quantidades semelhantes de gordura de origem marinha (óleo de peixe + gordura contida na farinha de
peixe) garantindo um perfil semelhante de ácidos graxos. A utilização destes valores de proteína bruta para cultivo de L. vannamei(jatobá et al., 2012). Tabela 1. Formulação de dietas experimentais para de camarões marinhos (L.vannamei), com diferentes fontes proteicas. Ingrediente Fonte Proteica Farinha de peixe Concentrado Proteico de Soja Farinha Peixe (590 g.kg -1 PB) 208,7 0,0 ¹Concentrado Proteico de Soja 0,0 171,6 Farelo de Soja (450 g.kg -1 PB) 350,0 350,0 Quirera de Arroz 80,0 80,0 Farinha de Trigo 250,0 250,0 Lectina de soja 15,0 15,0 Óleo Peixe 6,2 25,1 Óleo de Soja 20,0 20,4 Cloreto de Potássio 15,0 9,1 Cloreto de Sódio 15,0 15,0 Sulfato de Magnésio 8,0 8,0 Vitamina-C 0,3 0,3 Caulim 8,8 26,6 Fosfato Monocálcico 20,0 0,0 ²Premix vitamínico-mineral 15,0 15,0 Gordura de origem marinha 25,1 24,8 ¹Composição centesimal, 63,07% proteína bruta, 1,38% de extrato etéreo, 4,66% fibra bruta, 6,79% umidade e voláteis, 6,32% material mineral, 17,78% extrato não nitrogenado, 1,38% extrato por hidrólise ácida, 4.426,0 cal.g -1 ; ¹Aminograma Ácido Aspártico 6,67%; Ác. Glutâmico 10,03%; Serina 2,65%; Glicina 1,90%; Histidina 1,68%; Arginina 3,69%; Treonina 1,74%; Prolina 2,73%; Tirosina 1,69%; Valina 2,73%; Metionina 0,71%; Metionina + Cistina 1,37%; Isoleucina 2,82%; Leucina 4,99%; Fenilalanina 3,04%; e Lisina. 3,92%.²Níveis de garantia por quilo do produto: vit. A 10.000.000 UI; vit. D3 2.000.000 UI; vit. E 30.000 UI; vit. B1 2,0 g; vit. B6 4,0 g; ácido pantotênico 12,0 g; biotina 0,10 g; vit. K3 3,0 g; ácido fólico 1,0 g; ácido nicotínico 50,0 g; vit. B12 15.000 mcg; Se 0, 25 g; e Veículo q.s.p 1.000 g; PB (Proteína Bruta) Foi utilizada uma cepa de bactéria acido-láctica isolada de camarões sadios, selecionada e aprovada por testes in vitro contra patógenos, identificada como Lactobacillusplantarum, CPQBA 007 07 DRM01 (Vieira et al, 2013). As dietas probióticas receberam inóculo de 10% meio de cultura mais bactéria, enquanto as dietas controles receberam apenas o meio estéril, assim como descrito por Jatobá et al. (2008; 2011). Depois de produzidas as dietas com diferentes fontes próteicas e incorporação do probiotico, foi estabelecido um delineamento experimentalbifatorial (2x2), fator 1, fonte próteica, farinha de peixe ou concentrado proteico de soja; e fator 2, dieta suplementada ou não com próbiotico, totalizando quatro diferentes tratamentos. Para avaliação da microbiota, 36 camarões marinhos (L. vannamei) com peso médio 6,85 ±0,04 g foram distribuídos igualmente em doze caixas de polietileno (22 L uteis), equipadas com sistema de recirculação, temperatura constante (28-29 C) e filtro canister. As caixas divididas nos quatro tratamentos, em triplicata.
Os camarões foram alimentados três vezes ao dia (8:30; 13:30; 17:00), oferecendo 3,5% da biomassa. E o oxigênio dissolvido e temperatura foram mensurados, duas vezes ao dia, enquanto o ph no início e final do experimento. Após 17 dias de alimentação, os camarões permaneceram 12 horas em jejum e foram anestesiados em Eugenol (1%) e coletado um pool do trato intestinal de três camarões, por unidade experimental. Os tratos foram macerados e diluídos serialmente (fator 1:10) em solução salina estéril (SSE) 0,65% de NaCl. As amostras de cada diluição foram semeadas em Agar MannRogosa Sharpe (MRS), Plate Count Agar (PCA) e Agar tiossulfato citrato bile sacarose (TCBS), e incubados por 48h a 30 C, para contagem deácido-láticas, bactérias heterotróficas totais evibrionaceas, respectivamente. Os dados foram previamente submetidos a analise de Bartlett para verificar a homogeneidade de variância, após este teste os valores das contagens microbiológicas foram transformados para log(x + 1). Posteriormente todos os dados, foram submetidos à análise de variância bifatorial. Quando detectada diferença significativa, foi utilizado o teste Student Newman Keuls (SNK) de separação de médias. Todos os testes utilizaram um nível de significância de 5%(Zar, 2010). Resultados e discussão Durante o período experimental o oxigênio dissolvido permaneceu acima de 4,5 mg.l - 1, temperatura entre 28,1-29,2 C e ph em 7,9. Todas as variáveis de qualidade de água foram adequadas para o cultivo da espécie (Boyd e Gautier, 2000). Uma das principais características de um probiótico é sua capacidade de colonizar e alterar a microbiota dos hospedeiros (Gasoupe, 1999). Neste trabalho, independente do ingrediente utilizado, o Lactobacillusplantarum permaneceu no trato intestinal dos camarões alimentados com as dietas suplementas, enquanto nos tratamentos sem suplementação não foi detectada a presença de bactérias ácido-láticas (Tabela 2). Vieira et al. (2008) observaram que o L. plantarum atua por um período máximo de seis dias, sendo necessário uso contínuo, porém os autores não avaliaram a possibilidade do uso de prebióticos ou quaisquer outros ingredientes que favoreçam a permanecia destas bactérias probióticas, aumentando a duração dos seus efeitos benéficos ao saúde animal.
Tabela 2. Contagem bacteriológica (média ± desvio padrão)do trato intestinal dos camarões marinhos(l. vannamei), alimentados com dieta utilizando farinha de peixe ou concetrado proteico de soja, e suplementado ou não com probiótico. Tratamentos Contagem bacteriana (Log (x+1).g de trato -1 ) F1(Ingrediente) F2(Suplementação) Ácido-lácticas Heterotróficas Totais Vibrionaceas Farinha de Peixe Não suplementada ND 8,8 ± 0,1ª 5,9 ± 0,5ª Suplementada 5,5 ± 0,4 7,6 ± 0,5 b 5,9 ± 0,1ª Concentrado Não suplementada ND 8,4 ± 0,4ª 6,8 ± 0,6 b proteico de soja Suplementada 5,4 ± 0,8 7,5 ± 0,3 b 6,5 ± 0,3 b Fator Significância F1 0,488392 0,365845 0,033786 F2-0,001203 0,431303 F1xF2-0,474898 0,449976 *Não detectável (ND); Letras diferentes indicam diferenças significativas noteste SNK de separação de médias.. Assim como as bactérias ácido-láticas, as heterotróficas totais, independente da fonte proteica utilizada, apresentou uma menor contagem no trato intestinal dos camarões alimentados com dietas suplementadasem relação ao trato dos camarões não suplementados (Tabela 1). A redução de bactérias heterotróficas totais é comumente observada em organismos aquáticos alimentados com dietas suplementadas com bactérias ácido-láticas (Vieira et al., 2008; Jatobá et al. 2008, 2011), isto ocorre devido a produção de compostos extracelulares como os ácidos láticos (Fuller, 1989). Na contagem das bactérias do gênero Vibriosp., diferentemente do observado para as heterotróficas totais e acido-láticas, a suplementação não interferiu a contagem, este resultado diverge dos estudos anteriores realizados com a mesma cepa probiótica na qual reduziu a quantidade de Vibrios em L. vannamei (Vieiraet al., 2008). É comum se esperar o efeito oposto, uma redução na carga de vibrionaceas em animais tratados com probiótico, em especial, bactérias ácido-láticas (Jatobá et al., 2008, 2001; Vieira et al, 2008, de Zhang et al., 2011). Porém ao avaliar os ingredientes, os camarões alimentados com concentrado proteico de soja apresentaram um maior contagem de vibrionaceas, isto pode está relacionado com os diferentes nutrientes disponíveis em cada ingrediente. Conclusão O Lactobacillusplantarum combinado com diferentes fontes proteicas, farinha de peixe ou concentrado proteico de soja, produz diferentes efeitos no trato digestório do camarão marinho (Litopenaeus vannamei).
Referências BOYD, C. E.; GAUTIER, D. Effluent composition and water quality standards. Global Aquaculture Advocate, v. 3, n. 5, p. 61-66, 2000. FULLER, Ray. A review. Journal of applied bacteriology, v. 66, p. 365-378, 1989. GATESOUPE, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture, v. 180, n. 1, p. 147-165, 1999. HARDY, Ronald W. Utilization of plant proteins in fish diets: effects of global demand and supplies of fishmeal. Aquaculture Research, v. 41, n. 5, p. 770-776, 2010. JATOBÁ, Adolfo et al. Diet supplemented with probiotic for Nile tilapia in polyculture system with marine shrimp. Fish physiology and biochemistry, v. 37, n. 4, p. 725-732, 2011. JATOBÁ, Adolfo et al. Lactic-acid bacteria isolated from the intestinal tract of Nile tilapia utilized as probiotic. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, n. 9, p. 1201-1207, 2008. SOOKYING, D.; DAVIS, D. A.; SOLLER DIAS DA SILVA, F. A review of the development and application of soybean based diets for Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture Nutrition, v. 19, n. 4, p. 441-448, 2013. VIEIRA, Felipe do Nascimento et al. In vitro selection of bacteria with potential for use as probiotics in marine shrimp culture. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 48, n. 8, p. 998-1004, 2013. VIEIRA, Felipe do Nascimento et al. Time-related action of Lactobacillus plantarum in the bacterial microbiota of shrimp digestive tract and its action as immunostimulant. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, n. 6, p. 763-769, 2008. ZAR, J.H. Biostatisticalanalysis. 5th ed. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River.NJ, 2010, 994p. ZHANG, Qin et al. Dietary administration of Bacillus (B. licheniformis and B. subtilis) and isomaltooligosaccharide influences the intestinal microflora, immunological parameters and resistance against Vibrio alginolyticus in shrimp, Penaeusjaponicus (Decapoda: Penaeidae). AquacultureResearch, v. 42, n. 7, p. 943-952, 2011.