DETERMINAÇÃO DE VITAMINA D3 POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) DETERMINATION OF VITAMIN D IN PLASMA BY HIGH EFFICIENCY LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Laila Cristina Grubert 1 Grace Jenske 2 RESUMO As vitaminas de forma geral são compostos orgânicos essenciais pois permitem o melhor funcionamento do corpo humano e a maioria desses compostos não são sintetizados pelo corpo, sendo normalmente consumidos na forma de alimentos e até suplementos vitamínicos. OBJETIVO: elaborar um método cromatográfico para a identificação e quantificação de vitamina D3 em plasma humano por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. MATERIAIS E MÉTODOS: As amostras foram preparadas na presença da mistura de metanol e isopropanol, juntamente com hexano e evaporada a fração orgânica com gás nitrogênio. Utilizou-se um cromatógrafo líquido de alta eficiência com uma coluna C18, comprimento de onda de 265nm e fase móvel de 0,20 de água e 0,80 de acetonitrila. RESULTADOS: Com o método cromatográfico utilizado conseguiu-se elaborar uma curva de calibração para a vitamina D3 com R 2 de 0,9961. CONCLUSÕES: A vitamina D3 tem papel fundamental na absorção do cálcio e também influencia no metabolismo e composição da matriz óssea, pois é sintetizada pela pele por meio de raios ultravioletas e também por alimentos ricos nesse composto vitamínico. A deficiência dessa vitamina pode causar sérias doenças dentre elas, pode-se citar o raquitismo e insuficiência renal crônica. Palavras-chave: Vitaminas; Vitamina D; HPLC. 1 Graduanda do Curso de Biomedicina da Fundação Universidade Regional de Blumenau- FURB - SC, laila_grubert@hotmail.com; 2 Graduada do Curso de Engenharia Química da Fundação Universidade Regional de Blumenau-FURB - SC, gjenske@gmail.com; Timbó SC, agosto de 2017.
2 INTRODUÇÃO As vitaminas são um grupo de compostos orgânicos, quimicamente não relacionados entre si, distribuídos nos reinos vegetal e animal. Embora necessárias em pequeníssimas quantidades na alimentação, as vitaminas são consideradas essenciais, ou seja, já que o organismo não as sintetiza, necessariamente devem ser obtidas através da alimentação. As vitaminas são classificadas quanto à solubilidade, em vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis (MANSUR, 2009). De acordo com Mansur (2009), alguns exemplos de vitaminas hidrossolúveis são: ácido fólico, cobalamina, ácido ascórbico, piridoxina, tiamina, niacina, riboflavina, biotina e ácido pantotênico. As vitaminas que são classificadas como lipossolúveis recebem o nome de vitaminas A, D, K e E. A vitamina D proveniente da síntese em animais é denominada de colecalciferol ou Vitamina D3 e a de origem vegetal é o ergosterol ou Vitamina D2. Ambas participam dos mesmos processos biológicos e das mesmas vias de metabolização, com potências biológicas equivalentes (PEDROSA e CASTRO, 2005). ATUAÇÃO DA VITAMINA D NO ORGANISMO HUMANO Segundo Lichtenstein (2013) a maior fonte de vitamina D está na epiderme. Essa vitamina é produzida na pele por meio da ação de raios ultravioletas do tipo B, em uma reação denominada de fotolítica, e converte o composto 7-dehldrocolesterol em pré-vitamina D3. Após essa conversão a vitamina D3 entra na circulação e vai para o fígado, onde sofre ação da enzima P450, se transformando em 25-hidroxivitamina-D3 ou 25(OH)D3 (calcidiol). A 25(OH)D3 sofre ação da enzima mitocondrial CYP27B1-hidroxilase das células epiteliais dos túbulos proximais renais, sendo convertida em 1,25-Dihidroxivitamina-D3. No intestino, a vitamina D estimula a absorção de cálcio e fósforo, sendo que quantidades suficientes dessa vitamina acarreta em um aumento de 30 a 40% a absorção do cálcio e 80% de fósforo. Em suma, a síntese da vitamina D3 é estimulada pelo paratormônio (PTH) e pode ser inibida pelo fator de crescimento de fibroblasto produzido nos osteócitos. Todo esse processo da síntese de vitamina D no corpo humano pode ser demonstrado na figura abaixo, retirada do estudo realizado sobre a vitamina D e suas ações extraósseas e uso racional realizada por Lichtenstein (2013).
3 DEFICIÊNCIA DE VITAMINA D Segundo Kich (2012), a deficiência de vitamina D é comum em variados grupos populacionais, especialmente entre idosos. As necessidades de vitamina D são de 600 µl/dia para pessoas de 1-70 anos e de 800 µl/dia para pessoas acima de 70 anos, o que resulta em níveis séricos acima de 20 ng/ml, desde que haja um nível mínimo de exposição ao sol. Os níveis séricos de vitamina D são influenciados por diversos fatores, como a
4 obesidade, exposição solar, atividade física, estado nutricional, pigmentação da pele e medicações (LICHTENSTEIN, 2013). Sugere-se que a vitamina D e seus análogos não só previnem o desenvolvimento de doenças autoimunes como também poderiam ser utilizados no seu tratamento. Baixos níveis séricos de vitamina D podem, ainda, estar relacionados com outros fatores como diminuição da capacidade física, menor exposição ao sol, maior frequência de polimorfismos nos genes do RVD, efeito colateral de medicamentos, além de fatores nutricionais. (MARQUES et al, 2010) DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE VITAMINA D Pode-se dizer que o interesse clínico na vitamina D tem aumentado substancialmente nos últimos anos, resultado de sua associação com uma grande variedade de doenças e condições. Dessa forma, existe uma demanda crescente por determinações de vitamina D. Os métodos utilizados nessas determinações devem ser capazes de diferenciar a 25(OH)D 3 e a 25(OH)D 2 de outras formas de vitamina D, sendo a cromatografia líquida de alta eficiência (CLEA) o método preferencial, como citado por KICH (2012) em seu estudo sobre a determinação de vitamina D em plasma humano. Considerando a disponibilidade limitada de serviços analíticos que empreguem CLAE para determinação de 25(OH)D3 e 25(OH)D2 em nosso meio, o desenvolvimento e a validação de uma metodologia simples e robusta pode representar uma contribuição significativa para a qualificação dos serviços de diagnóstico laboratoriais no Brasil (KICH et al, 2012) MATERIAL E MÉTODOS Preparo das amostras Para a realização do ensaio foi utilizado 700 µl de plasma sanguíneo como amostra, sendo adicionado em um tubo de ensaio, juntamente com 500 µl de solução da mistura de metanol:isopropanol (50:50) e agitou-se em vórtex por trinta segundos, e após permaneceu em repouso por dez minutos. Em um outro tubo de ensaio foi transferido 1 ml da mistura anterior juntamente com 4 ml de hexano e agitou-se novamente em vórtex por trinta segundo. Após esta etapa, a amostra foi agitada em centrífuga por dez minutos em 2500 RPM. Depois da centrifugação houve a separação das fases, com isso transferiu-se 3,5 ml da fração orgânica para um tubo de 200 ml com a finalidade de evaporação a 40ºC
5 em Nitrogênio. Esta etapa foi repedida novamente com a adição de mais 4 ml de hexano e evaporação. Equipamentos Foi empregado um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Hitachi LaChrom com detecção UV. Para a separação cromatográfica utilizou-se uma coluna C18 Condições cromatográficas As condições operacionais cromatográficas que resultaram na separação e na identificação da Vitamina D3 foram na fase móvel uma rampa isocrática de 20% de água e 80% de acetonitrila, com uma vazão de 1,0 ml/min durante 4 minutos. A coluna foi mantida na temperatura de 30 ⁰C, a detecção foi realizada no comprimento de onda de 265 nm e o volume injetado de amostra foi de 50 µl. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após definir as condições cromatográficas, preparou-se as seguintes concentrações a partir do padrão Accustandard VIT-013N: 250 ppb, 500 ppb, 750 ppb, 1000 ppb, 1500 ppb e 2000 ppb. Com as áreas dos picos correspondentes a estas concentrações foi possível elaborar a curva de calibração do analito de interesse em triplicata. O tempo de retenção da vitamina D neste método foi de 70 segundos. Na figura abaixo pode-se vizualizar a relação da área dos picos conforme a concentração do padrão de vitamina D. Figura 1 - Área x Concentração do Padrão de Vitamina D Com base nos valores obtidos nos cromatogramas foi possível elaborar a curva de calibração para a posterior quantificação das amostras de vitamina D. Obteve-se um bom resultado através do modelo linear, com um R 2 de 0,9961.
6 Figura 2 - Curva de Calibração da Vitamina D Após a elaboração da curva de calibração, foram preparadas três distintas amostras a partir do plasma com o objetivo de analisar a quantidade de vitamina D3 presente no sangue humano. Os resultados obtidos pode ser vistos na tabela abaixo. Tabela 1- Resultado de Vitamina D3 no Plasma Humano TR Amostra Area [C] ppb 0,7 AMOSTRA 01 92631 26,67 0,7 AMOSTRA 02 152904 141,17 0,7 AMOSTRA 03 113537 66,38 CONSIDERAÇÕES FINAIS Dentre muitas funções da vitamina D, pode-se citar principalmente a absorção do cálcio e influência no metabolismo e composição da matriz óssea. Esse tipo de vitamina é sintetizada em maior quantidade pelo tecido epitelial por meio de raios ultravioletas B, e também por meio de alimentos ricos neste composto vitamínico, porém em menor quantidade. A deficiência de vitamina D pode causar sérias doenças, as quais pode-se citar o raquitismo, que é uma doença a qual ocorre devido à diminuição da mineralização óssea da placa epifisária do crescimento; e a insuficiência renal crônica. O método cromatográfico mostrou-se eficiente para a detecção da vitamina D3 presente nas amostras. Porém, a concentração encontrada nas mesmas está fora da curva
7 de calibração, sendo assim são necessários mais testes com o intuito de conseguir reduzir o limite de quantificação do método utilizado. REFERÊNCIAS COCCIA, Paula et al. Alta prevalencia de deficiencia de vitamina D en niños con enfermedad renal crónica y trasplante renal. Arch Argent Pediatr 2017. Argentina, 2016. Disponível em: <http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0325-00752017000300003> Acesso em: 02 agosto 2017. CASTRO, Luiz Cláudio G. O sistema endocrinológico vitamina D. Arq Bras Endocrinol Metab. São Paulo. Disponível em:< http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0004-27302011000800010>. Acesso em: 07 agosto 2017. JUNIOR, Edson P.S. et al. Epidemiologia da Deficiência de Vitamina D. Revista Científica do ITPAC, Araguaína, v.4, n.3, Pub.2, Julho 2011. Disponível em:< http://www.itpac.br/arquivos/revista/43/2.pdf>. Acesso em: 02 agosto 2017. KICH, Daiana et al. Determinação de 25-hidroxivitamina D2 e D3 em plasma por CLAE- DAD. J Bras Patol Med Lab, v.48, n.5, p.329-336, outubro 2012. Rio de Janeiro. Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s1676-24442012000500005>. Acesso em: 02 agosto 2017. LICHTENSTEIN, Arnaldo et al. Vitamina D: ações extraósseas e uso racional. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s0104-42302013000500015&script=sci_abstract&tlng=pt>. Acesso em: 02 agosto 2017. MANSUR, Luciana M. Vitaminas Hidrossolúveis no Metabolismo. Rio Grande do Sul: UFRGS, 2009. Disponível em: <https://www.ufrgs.br/lacvet/restrito/pdf/vitaminas_hidro.pdf>. Acesso em: 02 agosto 2017. MARQUES, Cláudia D.L. et al. A importância dos níveis de vitamina D nas doenças autoimunes. Disponível em:< http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0482-50042010000100007>. Acesso em: 02 agosto 2017.
8 PARREIRA, Diana I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina D em géneros alimentícios: Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. Instituto Superior de Engenharia de Lisboa. Lisboa. Dezembro, 2013. Disponível em: <http://repositorio.ipl.pt/handle/10400.21/3309>. Acesso em: 07 agosto 2017 PEDROSA, Márcia A.C. CASTRO, Marise L. Papel da Vitamina D na Função Neuro- Muscular. Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0004-27302005000400005>. Acesso em: 02 agosto 2017.