Vitaminas, métodos analíticos

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1 Vitaminas, métodos analíticos Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Disciplina Bromatologia Nutrição Diurno Grupo 8 Camilla Catto Gabriel Xibuta João Luis Dias Mariana Guatimosim

2 Agenda 1. Introdução 2. Propriedades físico-químicas das vitaminas lipossolúveis 3. Principais métodos analíticos das vitaminas lipossolúveis 4. Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis 5. Principais métodos analíticos das vitaminas hidrossolúveis 6. Conclusão 7. Referências

3 Introdução O que são e para que servem? Micronutrientes essenciais encontrados em pequenas quantidades na maioria dos alimentos Em sua maioria não são sintetizadas pelo corpo Indispensáveis para o funcionamento fisiológico normal do organismo - síntese de ATP, manutenção, crescimento, desenvolvimento e reprodução. Atuam como doadores e receptores de hidrogênio e elétrons, hormônios ou coenzimas.

4 Vitaminas Lipossolúveis São solúveis em meios lipídicos e em alimentos que contém gorduas, vitaminas A, D, E e K. São relativamente termoestáveis. Sua digestão ocorre por intermédio dos sais biliares, e são transportadas pelo sistema linfático, até os locais de armazenamento (fígado, tec. adiposo.). Hidrossolúveis São aquelas que são solúveis em água, como a vitamina C e as vitaminas do complexo B. Estão presentes tanto em fontes animais quanto vegetais. Possuem absorção facilitada, sendo conduzidas via circulação sistêmica e utilizadas quase em sua totalidade no metabolismo energético. Essas vitaminas não são, em indivíduos sadios, armazenadas no organismo, sendo, todo excesso consumido excretado pela urina.

5 Propriedades físico-químicas das vitaminas lipossolúveis Vitamina A Encontrada sob duas formas: 1) a vitamina A ativa pré formada ou a vitamina A propriamentes dita, encontradas nos alimentos de origem animal - ésteres de retinil, retinol e ácido retinóico; 2) a pró-vitamina A (inativa) ou os carotenos, presente em frutas e vegetais, que conferem ao óleo uma coloração amarela, e que se transformam em vitamina A no interior do intestino.

6 Propriedades físico-químicas das vitaminas lipossolúveis Vitamina E Representada por um grupo de compostos estruturalmente relacionados: os tocoferóis e tocotrienóis. α -tocoferol apresenta maior atividade biológica é o mais abundante antioxidante lipossolúvel. Facilmente dissolvida em solventes orgânicos.

7 Propriedades físico-químicas das vitaminas lipossolúveis Vitamina K

8 Propriedades físico-químicas das vitaminas lipossolúveis Vitamina D Substância cristalina solúvel em gorduras Hormônio esteróide em duas fórmulas moleculares - biológicamente inativas colecalciferol D3 - produzida na pele ergocalciferol D2 - derivada de fontes vegetais Essas fórmulas são transformadas nos rins em calcitriol, fórmula ativa

9 Principais métodos analíticos das vitaminas lipossolúveis Cromatografia Líquida de Alta Eficiênia - CLAE Cromatografia Gasosa - CG Bioensaio

10 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Método físico-químico de separação por migração diferencial dos componentes da amostra, que interagem de formas diferentes com as duas fases imiscíveis: a fase móvel e a fase estacionária. A preparação da mostra inclui procedimentos como saponificação, extração com solvente orgânico e purificação Detectores utilizados: UV, fluorescência, índice de refração, eletroquímicos, entre outros.

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12 Fase Normal e Fase Reversa

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14 Cromatografia Gasosa (CG) Método de análise química por separação de compostos que podem ser vaporizados sem decomposição, em que as substâncias são quantificadas pela ordem que saem da coluna e pelo tempo de retenção na mesma. Utiliza fase móvel gasosa e fase estacionária líquida.

15 Bioensaio Método de análise que avalia a resposta de um organismo à uma determinada dieta. Os animais são tratados com soluções específicas para cada tecido e para cada composto analisado, o que permite a vizualização do que ocorreu com o organismo. Vitamina A - fígado Vitamina D - ossos Vitamina K - sangue

16 Vitaminas e os métodos Vitamina A Cromatografia clássica, não discrimina compostos com moléculas conformacional e isomericamente diferentes que possuem atividades características da vitamina A, subesmtimando os carotenóides. A CLAE com medição espectrofotométrica é o método preferencial. Pode ser feita pela: fase normal - detecção por fluorescência fase reversa - detecção por UV

17 Vitaminas e os métodos Vitamina D Encontrada em baixas concentrações nos alimentos, o que dificulta sua análise. Bioensaio - amplamente utilizado com ratos, de 1922 a 1958; Colorimetria - baseia-se na absorbância da solução contendo vitamina D com um reagente que confere cor; a absorbância é proporcional à concentração da vitamina. Radioimunoensaio - para a determinação de 25- hidroxicolecalciferol, quando há disponibilidade de equipamentos e recursos. CG - altas temperaturas degradam a vitamina. CLAE - fase normal ou reversa com detecção por UV.

18 Vitaminas e os métodos Vitamina E CLAE 1. Preparo da amostra - diluições em solvente orgânico, saponificação com adição prévia de antioxidantes, ou precipitação de proteínas com etanol (no caso de ovos e leite); 2. Extração com solvente orgânico; 3. Filtração. Fase normal ou reversa - fase normal é mais adequado, por permitir a separação de todos os vitâmeros, fator importante, já que apresentam atividades diferentes. Detecção - ultravioleta ou fluorescência, sendo a última mais sensível e seletiva

19 Vitaminas e os métodos Vitamina K Colorimetria - não muito empregado devido à falta de especificidade CLAE 1. remoção dos lipídeos, por digestão com lipases; 2. extração com hexano; 3. evaporação do solvente; 4. aplicação na coluna de CLAE de fase reversa, com detecção de fluorescência.

20 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Ácido ascórbico (Vitamina C) Poderoso redutor Sofre oxidação irreversível rapidamente Amostra delicada, requer cuidado Ácido L- ascórbico Ácido L- dehidroascórbico Ácido eritórbico

21 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Sensível Tiamina (B1) Pode sofrer oxidação na presença de B2 Não é naturalmente fluorescente Altas temperaturas Meio alcalino

22 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Riboflavina (B2) Encontrada como riboflavina livre, riboflavina-5-fosfato (FMN) e flavina adenina dinucleotideo (FAD) Todas suas formas são fluorescentes

23 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Niacina (B3) Participa de reações de oxido-redução no metabolismo da glicose, ácidos graxos e aminoácidos O aminoácido triptofano é metabolizado a niacina Presente nos alimentos em duas formas: Ácido nicotínico Nicotinamida

24 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Ácido pantotênico (B5) Estável em condições neutras Facilmente destruído pelo calor Não suporta ph muito alcalino ou ácido Em sua forma livre é instável e absorve muita água Apresenta-se também ligado á proteínas ou forma de sais

25 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Piridoxina (B6) Encontrada na forma de piridoxamina, piridoxina e piridoxal e os ésteres fosfatos correspondentes

26 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Biotina (B7) Presente nos alimentos de forma livre Coenzima: auxilia reações enzimáticas Deve-se evitar calor e luz excessiva na amostra para análise

27 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Ácido fólico (B9) Altamente instável Na forma ácida é levemente solúvel em água Na forma de sal é muito solúvel Coenzima: auxilia reações enzimáticas

28 Propriedades físico-químicas das vitaminas hidrossolúveis Cobalamina (B12)

29 Principais métodos analíticos das vitaminas hidrossolúveis Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE Método Fluorimétrico Método Microbiológico

30 Método Fluorimétrico Técnica utilizada na determinação qualitativa ou quantitativa de substâncias nas quais ocorre o fenômeno da fluorescência.

31 Método Microbiológico Uso da vitamina como micronutriente essencial para os microorganismos cultivados; Conforme o crescimento da cultura, é estipulada a quantidade de vitamina. Algumas das espécies utilizadas: Enterococcus faecalis Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum Lactobacillus casei

32 Vitaminas e os métodos

33 Vitaminas e os métodos Vitamina C Método fluorimétrico não distingue ácido ascórbico de ácido dehidroascórbico, ambos com atividade de vitamina C; Método titulométrico mede apenas o acido ascórbico. Niacina B3 Método microbiológico não distingue o ácido nicotínico da nicotinamida.

34 Vitaminas e os métodos Piridoxina B6 Método microbiológico não apresenta resposta igual para os vitâmeros, mede apenas o valor total. Ácido Fólico B9 Método microbiológico não apresenta resposta igual para os vitâmeros, mede apenas o valor total. Método CLAE não mede todos os vitâmeros de maneira correta.

35 Conclusão O método CLAE é o mais utilizado para a análise de vitaminas apesar de seu alto custo. Existem métodos mais baratos que também são eficazes - ex: Microbiológico para vitaminas hidrossolúveis Os métodos nem sempre são eficazes pois há: Mais de uma substância com atividade biológica da mesma vitamina; Vitaminas presentes em pequenas quantidades nos alimentos; Presença de substâncias interferentes; Facilidade de isomerização de algumas vitaminas.

36 Referências Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia, um breve ensaio. Química Nova na Escola, 07, 21-25, Disponível em: < GREENFIELD. H., SOUTHGATE, D.A.T. Food composition data: Production, management and use. 2ed. Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO), Rome, MANSUR, L. M. Vitaminas hidrossolúveis no metabolismo. Disponível em: < PAIXAO, José A. da; STAMFORD, Tânia L. M.. Vitaminas lipossolúveis em alimentos: uma abordagem analítica. Quím. Nova, São Paulo, v. 27, n. 1, Feb Disponível em: < PENTEADO, M.V.C. Vitaminas: aspectos nutricionais, bioquímicos, clínicos e analíticos. Barueri: Manole, 2003.