Oinvestigação Citofunil e Megafunil : estudo comparativo em líquidos de cavidades serosas 1 1 1 1 1 Carla Pinheiro ; Rúben Roque ; Andreia Adriano ; Maria José Praça ; Saudade André 1 - Laboratório de Citopatologia, Serviço de Anatomia Patológica Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil, EPE Correspondência para Carla Pinheiro - e-mail: cscpinheiro@gmail.com RESUMO Em laboratórios de Citologia, a citocentrifugação é um dos métodos utilizados para o processamento de amostras, quer de citologia aspirativa quer de citologia esfoliativa. Para isso podem ser usados diversos funis, como o Citofunil e o Megafunil. O objectivo deste estudo consistiu em processar amostras de líquidos de cavidades serosas utilizando o Citofunil e Megafunil e comparar a qualidade da preparação e o diagnóstico. Neste estudo utilizámos 9 líquidos de cavidades serosas, as amostras foram processadas recorrendo ao Citofunil e Megafunil. Os dois métodos foram testados com as colorações de Papanicolaou e May- -Grünwald Giemsa. A avaliação das amostras foi realizada por três observadores independentes que utilizaram uma grelha de avaliação para os seguintes parâmetros: afinidade tintorial, preservação celular, celularidade e sobreposição celular. Foi também avaliada a concordância no diagnóstico. O Citofunil revelou uma média final ligeiramente superior na qualidade da preparação. Contudo, não existiram diferenças significativas entre os dois métodos. Da análise dos parâmetros, observou-se que foi na sobreposição celular que existiu maior diferença, registando o Megafunil um desempenho inferior. Este facto pode ser justificado por não ser recomendado fazer esfregaço após a citocentrifugação neste método. O diagnóstico foi concordante nas duas técnicas. PALAVRAS-CHAVE: Citocentrifugação, Citofunil, Megafunil, Líquidos de Cavidades Serosas. INTRODUÇÃO O Cytospin é um dos métodos utilizados para o processamento de amostras citológicas. O princípio desta técnica baseia-se no uso da força centrífuga que vai depositar a amostra sobre uma lâmina de vidro [1,2]. A Thermo Electron Corporation lançou a Cytospin I que veio revolucionar o processamento das amostras. A partir desta surgiram outros equipamentos que permitiram obter excelentes resultados com o material processado. As Cytospin II a IV apresentam mecanismos diferentes da primeira. Ao formarem bolhas de ar entre a amostra e a lâmina diminuem a perda celular. No entanto, este método tem limitações. Os dois aspectos mais apontados são a distorção da morfologia celular e a perda de material devido à absorção pelo filtro [1,3]. Nesta técnica pode ser utilizado o Citofunil que vai permitir o processamento de amostras com volume máximo de 0,5ml. Este tem um filtro que vai absorver o sobrenadante, concentrando as células na lâmina. As versões mais recentes da Cytospin permitem utilizar outro tipo de funil, o Megafunil, que possibilita o processamento de amostras com volume até 6ml (12 vezes a capacidade do Citofunil ). O Megafunil foi concebido para amostras com elevada celularidade como os líquidos de cavidades serosas, lavados brônquicos e expectorações [1-5]. Apesar de se basearem nos mesmos princípios, existem diferenças entre estas duas técnicas. Ao contrário do Citofunil, o Megafunil não possui filtro e deposita a amostra numa área maior na 2 2 lâmina (325mm vs 28mm do Citofunil ). Outra diferença é o tipo de lâmina utilizada, enquanto que para o Citofunil não há requisitos específicos, o Megafunil requer uma lâmina própria fornecida com o kit (Figuras 1 e 2). Esta lâmina tem uma margem com relevo que delimita a área onde serão depositadas as células (Figura 2). Ambas as técnicas são de fácil utilização e permitem boa preservação da morfologia. Possibilitam diferentes colorações, 28
Figura 1 - Processamento por Citofunil - Citofunil, CitoClip e perspectiva macroscópica da lâmina. por exemplo Papanicolaou (Pap) e May-Grünwald Giemsa (MGG), e a realização de lâminas para técnicas complementares [3-8]. Ao pesquisar sobre este tema deparámo-nos com a escassez de artigos científicos, onde os poucos que foram publicados referem a utilização das técnicas mas não as comparam directamente. Este trabalho teve como objectivo processar amostras de líquidos de cavidades serosas utilizando o Citofunil e Megafunil e comparar a qualidade da preparação e o diagnóstico. MATERIAL E MÉTODOS No presente estudo processaram-se 9 líquidos de cavidades serosas (3 lavados peritoneais e 6 derrames pleurais). As amostras chegaram a fresco ao laboratório e foram processadas de imediato. Para os dois métodos centrifugou-se a mesma quantidade de amostra (2ml) e posteriormente citocentrifugou-se, na Thermo Scientific Cytospin IV, recorrendo ao Citofunil e Megafunil. Para cada um dos métodos, da mesma amostra, fizeram-se duas lâminas (uma para Pap e outra para MGG) obtendo no total 18 lâminas por método. O protocolo utilizado para o processamento das amostras pode ser observado no Quadro I. O protocolo recomendado para o Megafunil foi adaptado à rotina do laboratório. No protocolo original é sugerido o uso de duas soluções de base alcoólica antes da centrifugação, que têm acção mucolítica, hemolítica e preservante. Uma fixação alcoólica iria prejudicar a coloração de amostras com MGG, pelo que optámos por eliminar este procedimento. Após a citocentrifugação com o Citofunil avaliou-se macroscopicamente o sedimento e fez-se esfregaço nos casos que apresentaram sobreposição de material. De acordo com as instruções do fabricante este procedimento não foi aplicado no Megafunil, a existência da margem com relevo pode interferir com a distribuição homogénea da amostra na lâmina. Figura 2 - Processamento por Megafunil - Megafunil com citoclip incorporado, descartável e perspectiva macroscópica da lâmina onde é visível a margem com relevo. distribuição homogénea da amostra na lâmina. A grelha de avaliação utilizada para avaliar as lâminas pode ser consultada no Quadro II. Os parâmetros avaliados foram medidos numa escala de 0 a 2, onde 0 é o pior resultado e o 2 demonstra a melhor qualidade. Deste modo, o score final das lâminas poderia variar entre 0 e 8. Este instrumento de recolha de dados foi validado previamente através de uma avaliação facial por um painel de Delphi a três avaliadores. A avaliação microscópica foi realizada por três observadores independentes com experiência na observação deste tipo de amostras. Foi efectuado tratamento estatístico dos scores no programa informático SPSS 17.0. Quadro I - Protocolos de processamento: Citofunil e Megafunil. Quadro II - Grelha de avaliação: parâmetros avaliados e respectivos valores. 29
RESULTADOS Na análise estatística realizada através do teste Oneway ANOVA o protocolo do Citofunil obteve a média mais elevada e o menor desvio padrão, sendo de 7,39 e 1,280 respectivamente. O Megafunil apresentou valores inferiores, com uma média de 7,04 e um desvio padrão de 1,331. A Tabela I, para além de suportar os resultados acima referidos, demonstra que para cada método foram realizadas 54 observações, perfazendo um total de 108. Apesar da diferença das médias nenhum protocolo registou um score inferior a 3 e em ambos existiram casos que obtiveram o score máximo (8). Analisaram-se também os intervalos onde existiram maior concentração de resultados, utilizando um intervalo de confiança de 95%. Para um nível de significância de 0,05 não existiram diferenças estatisticamente significativas quando se comparam os dois protocolos (p=0,164). Nas colorações utilizadas, o MGG obteve uma média de 7,26 no Citofunil (desvio padrão 1,403) e 6,78 no Megafunil (desvio padrão 1,672). Relativamente à coloração de Pap a média foi de 7,52 no Citofunil (desvio padrão 1,156) e 7,30 no Megafunil (desvio padrão 0,823). No diagnóstico não se verificou diferenças entre os dois métodos. Gráfico I - Resultados dos 3 observadores para o parâmetro afinidade tintorial. Tabela I - Resultados obtidos para o Citofunil e o Megafunil no teste Oneway ANOVA. A média de resultados obtidos para cada parâmetro (por método) pode ser observada na Tabela II. Gráfico II - Resultados dos 3 observadores para o parâmetro preservação celular. Tabela II - Média de cada método, para cada parâmetro. O número de observações registado para cada parâmetro/método encontra-se nos Gráficos I a IV. Na maioria dos parâmetros os resultados entre os dois métodos foram semelhantes, com excepção da sobreposição celular no Megafunil, onde se verificaram 18 observações (33,3%) em que este factor limitou a visualização. 30 Gráfico III - Resultados dos 3 observadores para o parâmetro celularidade.
Gráfico IV - Resultados dos 3 observadores para o parâmetro sobreposição celular. DISCUSSÃO O Citofunil revelou uma média final ligeiramente superior na qualidade da preparação. Os resultados obtidos pelos dois métodos foram semelhantes para os parâmetros afinidade tintorial, preservação celular e celularidade (Figuras 3 a 8). Figuras 5 (Citofunil) e 6 (Megafunil) - Células mesoteliais bem preservadas que demonstram boa coloração citoplasmática e nuclear. Papanicolaou, 400x. A maior discrepância entre os dois métodos verificou-se a nível da sobreposição celular (Figuras 7 e 8). O pior desempenho do Megafunil foi devido ao facto de, ao contrário do Citofunil, não se ter efectuado esfregaço do sedimento resultante da citocentrifugação, conforme recomendação do fabricante. No entanto, este desempenho inferior não inviabilizou a interpretação das amostras nem o seu diagnóstico. Em ambos os métodos não houve discrepâncias nos diagnósticos. Considerando os resultados obtidos, não se observaram diferenças significativas entre o Citofunil e Megafunil. Uma limitação do estudo foi o reduzido número de amostras utilizadas devido à quantidade de Megafunis disponíveis. Apesar da escassa amostragem, os bons resultados do Citofunil fizeram com que o mantivéssemos no nosso laboratório. Como futuros estudos seria pertinente comparar o protocolo original do Megafunil com outros métodos em vários tipos de amostras. Figuras 3 (Citofunil) e 4 (Megafunil) - Amostras de baixa celularidade onde se observam eosinófilos e linfócitos com boa preservação celular. Papanicolaou, 100x. 31
AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Thermo Shandon e Garal Lda pelo fornecimento do kit do Megafunil, sem o qual o estudo não teria sido possível. Figuras 7 (Citofunil) e 8 (Megafunil) - Amostra de elevada celularidade onde no Megafunil se observa uma distribuição celular heterogénea com alguma sobreposição celular. May-Grϋnwald Giemsa, 100x. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bales C. Laboratory Techniques. In: Koss L. editor. Koss' Diagnostic Cytology and It's Histopathologic Bases. 5th ed. New York: Lippincott Williams & Wilkins; 2006. pp. 1585-7. 2. Barrett D. Cytocentrifuge Technique. In: Keebler C, Reagan J, Wied G, editors. Compendium on cytopreparation techniques tutorials of cytology. 4th ed. Illinois: Tutorials of Cytology; 1976; pp. 80-83. 3. Thermo Scientific. Recuperado em 2009, Novembro 13, de http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productid=11956302&grouptype=product&s earchtype=0&storeid=11152 4. Ritter, D; and Michels, H. Pulmonary Cytologic Specimens using the Shandon Megafunnel - Lab Leader Article. (s/d) In: Biomoda. http://www.biomoda.com/tech/lableader-11-3.htm (14Nov2009) 5. Thermo Electron Corporation. (s/d) http://www.kendro.com/ethermo/cma/pdfs/product/productpdf_24987.pdf; (14Nov2009) 6. Manzoni, G et al. The presence of bone marrow cytokeratin-immunoreactive cells does not predict outcome in gastric cancer patients. British Journal of Cancer 2002, 86 (7), pp. 1047-1051. Versão Electrónica. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2364170/?tool=pmcentrez# abstractid488031 (14Nov2009) 7. Piaton, E; Hutin, K; Faÿnel, J; Ranchin, M-C; and Cottier, M. Cost efficiency analysis of modern cytocentrifugation methods versus liquid based (Cytyc Thinprep) processing of urinary samples. Journal of Clinical Pathology 2004, 57, 11, pp. 12081212. Versão Electrónica. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1770469 (14Nov2009) 8. Priestnall S. Shandon Megafunnel Aids inaction Research. In: Axlab. (s/d). http://www.axlab.dk/fileadmin/user_upload/lableader_spring_2004.pdf (15Nov2009) 32