Detecção de Seqüências Específicas de DNA Parte 1. Procurando um gene Imagine que você é um cientista e acabou de extrair um DNA. Você precisa saber se este DNA contém o gene para fibrose cística. Você sabe pouco sobre o gene da fibrose cística, então, como você pode dizer se o tem em sua amostra? Quando um cientista procura por um determinado segmento de DNA, ele pode utilizar um DNA especial denominado sonda (probe). Normalmente uma sonda é um fragmento de DNA de fita simples. Se um pedaço de DNA de fita simples encontra outro segmento de DNA também de fita simples e com exatamente a mesma seqüência de bases, eles vão se parear formando um DNA de dupla hélice. Os cientistas utilizam um termo especial para o pareamento de duas fitas simples de DNA para constituir uma fita dupla: hibridação (Figura 1). Sonda Complementaridade de bases Gene de interesse Figura 1. Hibridação de uma sonda com uma seqüência dentro do DNA de fita simples. Para saber se um gene está presente na amostra de DNA, os cientistas utilizam uma sonda com a mesma seqüência de uma parte do gene. Ela é adicionada à amostra de DNA para saber se vai hibridar em algum local. Como eles sabem quando a sonda hibridou? Se a sonda hibridar com a amostra, irá grudar com o DNA da amostra. Se não, a sonda pode ser retirada facilmente. Após a lavagem da amostra, os cientistas conseguem saber se a sonda hibridou com a amostra ou não. Se ocorrer a hibridação é porque a seqüência de DNA da sonda está presente na amostra. Se a sonda é um pequeno segmento do gene, então, provavelmente o gene está presente na amostra.
Atividade No Anexo 1 você tem uma longa seqüência de DNA representando a sua amostra. Você também tem uma seqüência curta que é uma sonda para o gene da fibrose cística. Você vai utilizar a sonda para determinar se o gene da fibrose cística está em sua amostra de DNA. A amostra de DNA dada é de fita simples. Para saber se a sonda vai hibridar com a amostra, é necessário separar as fitas de DNA de modo que a sonda possa encontrar a seqüência de bases complementar. 1. Recorte as sondas. 2. Verifique a seqüência de DNA para ver se a sonda vai hibridar com a sua amostra. 3. O gene da fibrose cística está presente em sua amostra de DNA? Se você encontrou uma seqüência onde a sonda poderia se hibridar, marque-a na seqüência de DNA. Questões 1. O que é hibridação? 2. Como você pode utilizar a hibridação para saber se uma certa seqüência de DNA está presente em sua amostra de DNA? 3. Determine uma sonda com 10 pares de bases (pb) que poderia se hibridar com a seqüência de DNA a seguir. 5' AATGCAGGCCCTATATGCCTTAACGGCATATGCAATGTACAATGCAAGTCCAACCGG 3'
Anexo 1. Sequência de DNA de fita simples e sonda. Sonda: 3' GGATGCTACCATAGC 5' 3' GGATGCTACCATAGC 5' Amostra de DNA (a sequência está escrita no sentido 5' 3'): 1 GGATCAGACTTCTAGCAGGCTCTTGACCAATGATCACAGCTTCCGATCTAG 2 AGCTCGATCTCTTGATCTCGATCTCGTGTCGGAATCTAGCCCGGGTCAGC 3 TATCGCTAAGATAGACCGGAATCGAGAATTCCGGATCGATCGATTGTGCGA 4 CCGCGATTATTCGATCGTTTGCCCGGGATCTAGCTTTCCGATCTAGCTGTG 5 TCAAGCTAGTGGAATCGAATTCGGAACTCGGCCCGATCTTGATCTCCCGGG 6 ACAATTGTCGATCTGATGCTAGCTGAATCGATGTGCCTAAGTGCTAGCCCGG 7 GCGATCTGGGATCGATTCCCGGGATCTAGGCCTACGATGGTATCGTTAGC 8 TAGCTCTCTAGCTTAGCTCTCAAGTGATCTACCCGGGTAGATCTAGTATATTG 9 TATCGATATTTTCGCTTAGCTAGCCCGGGCTAGCTCTCTCTAGCTAATAGATAG 10 TCTAGCTAGCTAGCTAGCTGTGTCTAGTCGATCGTTTGTCGATCTTCGATC
Detecção de Seqüências Específicas de DNA Parte 2. Combinando a análise de restrição e a hibridação A análise de hibridação que você aprendeu em Procurando um gene pode indicar se uma dada seqüência de DNA está presente em sua amostra. Algumas vezes, este simples "pedaço" de informação é tudo o que é necessário. Contudo, um teste de hibridação positiva não dá nenhuma informação sobre onde a seqüência de interesse está localizada na molécula de DNA de sua amostra. Para se ter informação sobre a presença e a localização de uma determinada seqüência de DNA, os pesquisadores combinam a análise de restrição com a de hibridação. Basicamente, a amostra de DNA é digerida com uma (ou mais) enzima de restrição e os fragmentos são separados por eletroforese. Após a eletroforese é realizada a hibridação nestes fragmentos. Apenas o fragmento (ou os fragmentos) nos quais a sonda se hibridar será detectado (Figura 1). Gel corado Resultado da análise de hibridação Figura 1. A análise de hibridação mostra quais fragmentos de restrição hibridaram com a sonda.
Há alguns detalhes técnicos importantes sobre este processo. Primeiro que a eficiência não é boa se você simplesmente colocar a agarose em contado com a solução de sonda. Em 1975, um cientista chamado Southern desenvolveu um procedimento para transferir os fragmentos de DNA de um gel diretamente para uma membrana, de forma que a disposição dos fragmentos no gel fosse preservada. Após os fragmentos terem sido transferidos para a membrana, eles poderiam ser testados na análise de hibridação com a sonda. Este método de transferência é chamado de Southern blotting; e a combinação de análise de restrição, transferência para uma membrana e hibridação com uma sonda é chamado de "Análise de hibridação por Southern". Atividade 1. Recorte a seqüência de DNA da atividade anterior ao longo das linhas pontilhadas. Cole a fita 1 na fita 2 e esta na fita 3 sucessivamente até a fita 10, formando uma molécula longa e linear. Esta molécula poderia ser um cromossomo como um dos nossos. 2. Agora simule a atividade da enzima de restrição SmaI. Esta enzima corta o DNA nas seqüências 5' CCCGGG 3' entre a C e a G no meio da seqüência. Corte a sua seqüência em todos os sítios de restrição SmaI. (Os seus fragmentos estão em fita simples antecipadamente para facilitar a hibridação. Na realidade, a digestão e a eletroforese são realizadas com o DNA em fita dupla; apenas após a eletroforese e a transferência para a membrana é que os fragmentos serão separados ou desnaturados). 3. Agora, simule a eletroforese dos seus fragmentos. Distribua-os por ordem de tamanho e disponha-os em sua mesa como se eles estivessem em um gel. 4. Utilize o esquema dado no Anexo 1 e desenhe a disposição dos seus fragmentos no gel. 5. Marque com um asterisco a(s) banda(s) onde houve hibridação com a sonda. 6. Lembre-se de que o padrão de fragmentos de DNA no seu gel será transferido exatamente da mesma forma para a membrana. Na membrana, os fragmentos serão testados para a hibridação com a sonda e apenas o(s) fragmento(s) que hibridou com a sonda será detectado (como foi demonstrado na Figura 1). Desenhe o que será detectado após a hibridação no quadro marcado "Resultado da análise de hibridação".
Questão 1. É possível recortar uma banda de um gel de eletroforese, purificar o DNA que estiver nesta banda e clonar este DNA. Suponha que você tem uma sonda para um gene viral que você gostaria de clonar, mas você não sabe onde ele se encontra no cromossomo de 40.000 pb do vírus. Como a análise de hibridação poderia ajudá-lo a clonar este gene?
Anexo 1. Esquemas para a eletroforese em gel e para o resultado da análise de hibridação. Gel de eletroforese corado Resutado da análise de hibridação Tamanho dos Tamanho dos fragmentos Amostra fragmentos (pb) (pb) 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20
Detecção de Seqüências Específicas de DNA Parte 3. Hibridação por Southern Problema A Você está analisando o DNA de um vírus recém-descoberto. Você já construiu um mapa de restrição com 26.500 pb, demonstrado no Anexo 1. Já que você está interessado em enzimas DNA polimerases, você conduziu a análise de hibridação do DNA do vírus X utilizando um gene de DNA polimerase de outro vírus como sonda. Você acredita que esta seqüência é relacionada com o vírus X. Para sua alegria, a sonda hibridou com o DNA do vírus X. Você acredita que a seqüência de DNA do vírus X na qual a sonda hibridou seja o gene da DNA polimerase do vírus X. Agora você gostaria de determinar a localização do gene da DNA polimerase do vírus X e, para isto, realizou a análise de hibridação por Southern. Você digeriu o DNA viral com EcoRI e BamHI separadamente, separou os fragmentos em um gel, transferiu-os para uma membrana e realizou a hibridação utilizando a mesma sonda do gene da DNA polimerase. No Anexo 1 há uma figura dos fragmentos no gel de eletroforese e o padrão obtido após a hibridação com a sonda na membrana. Questões 1. Marque os fragmentos no gel com os seus respectivos tamanhos em pares de bases. 2. Indique, nos mapas de restrição, a região do DNA do vírus X na qual está localizado o gene da DNA polimerase. 3. A que distância da esquerda o gene poderia estar, em termos de sítios de restrição? E a que distância da direita? 4. Porque o gene da DNA polimerase de um outro vírus poderia hibridar com fragmentos de DNA do vírus X?
Problema B No Anexo 2 você encontra um mapa de restrição do Bacteriófago lambda. Você digeriu uma amostra de DNA do fago com as enzimas BamHI e HindIII separadamente e submeteu os fragmentos digeridos à eletroforese. Agora você transferiu os fragmentos para uma membrana e realizou a análise de hibridação utilizando um fragmento de 4.878 pb do lambda digerido com EcoRI (referido no mapa) como uma sonda. 1. Desenhe o resultado do gel de eletroforese no esquema dado no Anexo 2 (os dois fragmentos menores da HindIII vão correr para fora do gel). 2. Indique quais fragmentos vão hibridar com a sonda de 4.878 pb (A hibridação vai ocorrer mesmo que ocorra uma complementaridade apenas parcial da sonda com o fragmento de restrição). 3. No segundo quadro, desenhe o que poderia ser visto após a detecção da sonda na membrana.
Anexo 1. Mapas de restrição e análise de hibridação do vírus X para a detecção de seqüências específicas do DNA Parte 3. O mapa de restrição superior mostra os sítios de restrição EcoRI e o inferior mostra os sítios de restrição BamHI. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de bases. O gel de eletroforese corado mostra os fragmentos EcoRI e BamHI do vírus. A análise de hibridação mostra quais as bandas que hibridaram com a sonda. Mapa de restrição EcoRI 9.000 5.500 4.000 2.000 6.000 Mapa de restrição BamHI 3.000 7.500 10.500 5.500 Gel corado Resultado da análise de hibridação EcoRI BamHI EcoRI BamHI Tamanho, pb 10.000 8.000 4.000 2.000
Anexo 2. Mapas de restrição e análise de hibridação do bacteriófago lambda para a detecção de seqüências específicas do DNA Parte 3. Os sítios de restrição do bacteriófago lambda para as enzimas BamHI, HindIII e EcoRI estão demonstrados abaixo. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de bases. Os esquemas do gel e da análise de hibridação são fornecidos para o seu uso. Mapa de restrição BamHI 5.505 16.841 5.626 6.527 7.233 6.770 Mapa de restrição HindIII 2.027 2.322 23.130 9.416 6.557 4.361 564 125 Mapa de restrição EcoRI 3.530 21.226 4.878 5.643 7.421 5.804 Gel corado Resultado da análise de hibridação EcoRI BamHI EcoRI BamHI Tamanho, pb 10.000 8.000 4.000 2.000