BIOQUÍMICA Aula 4 Estrutura proteica (cont.) Métodos de análise de proteínas Proteínas estrutura secundária 1
Proteínas estrutura terciária A estrutura terciária relaciona-se com a associação dos elementos de estrutura secundária estabilizada por interacções covalentes e não covalentes - corresponde ao valor mínimo da energia de Gibbs Proteínas estrutura terciária A organização 3-D de uma proteína corresponde à sua estrutura terciária(caso de proteínas constituidas por uma só cadeia polipeptídica) A contráriodo queacontececom a organizaçãotridimensional local (estruturasecundária), a estruturaterciáriaincluia contribuição de interacções entre locais distantes na sequência mas que se aproximam espacialmente A estrutura terciária é determinada pela localização e orientação dos elementosde inversão, hélices α, cadeia βe tiposde folhas β 2
Proteínas estrutura terciária Representações Proteínas estrutura quaternária 3
Proteínas estrutura quaternária Proteínas podem ser constituídas por mais do que uma cadeia polipeptídica, sendo esta associação essencial à função que desempenham Oligómeros/multimeros (várias unidades monoméricas, subunidades) Proteínas monoméricas 1 cadeia polipeptídica Proteínas diméricas 2 cadeias polipeptídicas Proteínas triméricas 3 cadeias polipeptídicas Proteínas tetraméricas 4 cadeias polipeptídicas Proteínas pentaméricas 5 cadeias polipeptídicas Proteínas hexaméricas 6 cadeias polipeptídicas. Se as cadeias polipeptídicas forem idênticas adiciona-se o prefixo homo-, ou se forem diferentes adiciona-se o prefixo hetero- à designação oligomérica(exs. proteína homodimérica; proteína heterotetramérica) A estrutura quaternária corresponde à estrutura 3D resultante da associaçãoentre duasoumaissubunidades/cadeiaspolipeptídicase é estabilizada por interacções físicas Complexos supramoleculares Várias proteínas(com função própria) associam-se para uma determinada função celular 4
O que é que determina a estrutura nativa? Qual é a estrutura nativa? A estrutura/conformação nativa depende das condições físico-químicas em que se encontra a proteína O que é que determina a estrutura nativa? Qual é a estrutura nativa? A estrutura/conformaçãonativacorrespondeà estrutura3d definida e funcional de uma proteína Os mecanismos de folding são entendidos como um processo físico queocorrememsistemasbiológicosde modoa gerarestruturas3d bem definidas com uma energia conformacional menor que outras estruturas alternativa resultando na forma funcional da proteína A estrutura3d das proteínase suaestabilidaderesultamde um equilibrio extremamente complexo de diversas interacções compensatórias 5
O que é que determina a estrutura nativa? Qual é a estrutura nativa? Em condições fisiológicas: Forma nativa (N) Forma desnaturada (D) os factores que influenciam este equilibrio -sequência de aa -ligandos(ex. metais) -condições do meio (ph, temp., força iónica) O estado nativo das proteínas monoméricasé cerca de 20-80kJ/molmais estável que as suas formas desnaturadas Para proteínas oligoméricasesse valor é cerca de 150 kj/mol O que é que determina a estrutura nativa? Qual é a estrutura nativa? Em geral, as cadeias polipeptídicas passam por vários estados intermédios em termos conformacionais até atingirem uma conformação estável 6
Estrutura proteica- papel das chaperonas As chaperonassão conhecidas por interactuarem com as cadeias polipeptídicasnascentes e com proteínas parcialmente desnaturadas facilitando/ajudando na aquisição da sua conformação nativa Cap Polypeptide Correctly folded protein Hollow cylinder Figure 5.23 Chaperonin (fully assembled) Steps of Chaperonin Action: 1 An unfolded polypeptide enters the cylinder from one end. 2 The cap attaches, causing the cylinder to change shape in such a way that it creates a hydrophilic environment for the folding of the polypeptide. 3 The cap comes off, and the properly folded protein is released. 7
Estrutura proteica Proteínas Globulares e fibrosas Existem dois grandes grupos de proteínas de acordo com a suaestrutura3d global: - Proteínas globulares - Proteínas fibrosas 8
Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas Em geral, as proteínas fibrosas são: - constituídas por um único elemento de estrutura secundária -insolúveisemágua(têmmuitosresíduoshidrofóbicos) - têm uma função estrutural nas células Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas- α-queratinas As α-queratinas têm a capacidade de se auto-associarem originando filamentos flexíveis de natureza não polar e possuem 3 domínios: -região não helical (terminal amina) -região central constituído por hélices a -regiãonãohelical (terminal carboxilo) Os filamentos individuais têm uma estrutura 3D dominada pela super-helice(coiled-coil) formada através do entrelaçar de duas cadeias polipeptídicas e originando a estrutura quaternária da proteína 9
Ondese encontram? Cabelo Lã Unhas e garras Cornos pele Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas- α-queratinas Rigidez e estabilidade conferida pelas pontes dissulfureto α-queratina do cabelo Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas- Fibroína A fibroína é a proteína constituinte da seda sendo produzidapelobichodaseda(casulo) e pelas aranhas que fabricam teias É constituída por folhas β antiparalelas que se dispõem paralelamente em relação ao eixo da fibra Cada cadeia polipeptídica de fibroína é composta por múltiplas repetições da sequência: Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala A estrutura é estabilizada por pontes de hidrogénioe interacções de van der Waals 10
Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas- Colagénio O colagénioé a proteínaestruturalmaisabundante, originando filamentos que conferem resistência aos tendõese redesde fibrasquesuportama pelee os orgãos Os ossose osdentesresultamdaadiçãode minerais na forma cristalina ao colagénio O colagénio é composto por 3 cadeias polipeptídicas que formam uma estrutura denominada por hélice tripla de colagénio O tipode héliceé diferentedas hélices α Proteínas Globulares e fibrosas Proteínas Fibrosas- Colagénio A hélicetriplade colagénioé estabilizada porpontes de hidrogénio entre as diferentes cadeias polipeptídicas Existem 12 tipos diferentes de cadeias polipeptídicas que constituem o colagénio que por sua vez originam 7 tipos diferentes de hélices triplas As hélices triplas podem ser homo ou heterotrímeros As cadeias polipeptídicas constituintes do colagénio são caracterizadaspelarepetiçãode tripletosgly-x-y, ondex ou Y são frequentemente resíduos de Pro Muitos dos resíduos de Pro e Lys sofrem hidroxilação originando hidroxiprolina e hidroxilisina 11
Proteínas Globulares e fibrosas Colagénio A associaçãolateral (cross-link) de moléculasde colagénio ocorre via ligações pouco unsuais entre aminoácidosoriginandomicrofibrasde colagénio Exemplo: ligação entre grupos R de lisina de duas cadeias polipeptídicas constituintes do colagénio Proteínas Globulares São proteínas compactas Constituídas porregiões hélice α, regiões folhas β, e β-turns entre outros A estabilidade resulta essencialmente do core hidrófoboe pontes de hidrogénio Grande variedade funcional que está relacionada com a composição aminoacídicaassim como com a grande diversidade de possíveis combinações de elementos estruturais que podem possuir Algumas proteínas possuem pontes dissulfuretoaumentando desta forma a sua estabilidade A ligação a metais (metaloproteínas) também ajuda a estabilizar as proteínas Os grupos polares estão geralmente hidratados e encontram-se na superfície da proteína 12
Proteínas Globulares Mioglobina Uma pequena proteína(153 aa s, 16.7 kd) Contém um grupo prostético hemo(é uma metaloproteína) Armazena oxigénio nas células dos músculos É praticamente uma hélice α(78% dos aa s encontram-se em 8 segmentosde 7 a 23 aa s) ligadaporturns Boa parte da sua estabilidade resulta das interacções hidrófobas no core Proteínas multiméricas Hemoglobina A hemoglobina é o principal componente do sangue e é responsável pelo transporte do oxigénio dos pulmões aos tecidos e de dióxido de carbono dos tecidos até aos pulmões. É uma proteína tetramérica, com massa molecular de 64 500 Da, constituída por dois tipos de subunidades, α e β, num arranjo α2β2, em que cada subunidade tem um hemocomo grupo prostético 13
Estrutura proteica Questões tipo Quais as estruturas secundárias predominantes na fibroína? É constituída por folhas β antiparalelas que se dispõem paralelamente em relação ao eixo da fibra O colagénioé uma proteína fibrosa e é uma proteína que possui estrutura quaternária. Justifique. O colagénio é composto por 3 cadeias polipeptídicas que formam uma estrutura denominada por hélice tripla de colagénio 14
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO, ANÁLISE e CARACTERIZAÇÃO de PROTEÍNAS 15
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO, ANÁLISE e CARACTERIZAÇÃO de PROTEÍNAS Homogeneização/disrupção /lise celular Métodos enzimáticos Métodos osmóticos(lise hipotónica) Métodos mecânicos(ex. sonicação) Fraccionamento Centrifugação Cromatografia Electroforese Análise Cinética enzimática Microscopia Concentração de proteínas PREPARAÇÃO DE EXTRATOS CELULARES Homogeneização/disrupção /lise celular Métodos enzimáticos Métodos osmóticos(lise hipotónica) Métodos mecânicos(ex. sonicação) 16
Métodos colorimétricos para a detecção de proteínas Formação de cor é proporcional à concentração de proteína Reagente Reacção Absorção (nm) Biureto complexo de Cu2+ com ligação peptídica Bradford Resíduos hidrofóbicos e Arg 595 Lowry BCA complexo de Cu2+-proteínas reagem com reagente Folin-Ciocalteau Redução Cu 2+ a Cu 1+ seguida de reacção do ácido bicinconínico(bca) 560 650 562 D.O. 562 nm 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,001x + 0,0241 R² = 0,998 0 500 1000 1500 2000 [BSA] (µg/l) Métodos de fraccionamento de extractos proteicos Centrifugação Em geral, a sedimentação, utilizando a força centrifuga, depende essencialmente do peso, densidade, tamanho e forma das moléculas(ou organelos) a sedimentar. 17
FRACCIONAMENTO Centrifugação diferencial FRACCIONAMENTO Centrifugação em gradiente de densidade -Centrifugação ZONAL (gradiente pré-formado) -Centrifugação ISOPÍCNICA (isodensidade, gradienteforma-se durante a centrifugação) 18
FRACCIONAMENTO Electroforese A electroforeseé uma técnica que assenta na separação de macromoléculas por aplicação de um campo eléctrico. Quando um campo eléctrico é aplicado a uma solução de proteínas, estas moléculas migram numa direcção e com uma velocidade que reflectem a sua dimensão (massa molecular) e carga global (www.e-escola.pt) FRACCIONAMENTO - electroforese A electroforese em gel de poliacrilamida(page) Numa electroforese, o movimento das partículas ocorre geralmente em meio líquido que é suportado e estabilizado por uma substância sólida inerte(papel) ou semi-sólida(gel) Os géis mais utilizados para a separação(fraccionamento) de proteínas são de poliacrilamida O gel de poliacrilamidaé formadoatravésde um processode polimerização de monómeros de acrilamida e bis-acrilamida 19
FRACCIONAMENTO - electroforese Polimerização de monómeros de acrilamida e bis-acrilamida Variandaa proporçãode monómeros de acrilamida e bisacrilamidaobtêm-se géiscom diferentes poros A reacção processa-se em presença de um catalisador Persulfato de amónio(psa) O TEMED é utilizado como iniciador pois promove a decomposição de persulfato em radical livre: S 2 O 8 2- + e - SO 4 2- + SO 4 - FRACCIONAMENTO - electroforese A electroforese em gel de poliacrilamida(page) é um método rápido e sensível para analisar a composição de misturas de biomoléculas complexas, emparticular proteínas. 20
FRACCIONAMENTO - electroforese A electroforese em gel de poliacrilamida(page) PAGE NATIVA SDS-PAGE (desnaturante) Mobilidadedependede z e m FRACCIONAMENTO SDS-PAGE As proteínas são separadas em géis de poliacrilamida em condições desnaturantes(na presença de SDS, sulfato dodecil de sódio) O SDS -é um detergente aniónico capaz de se ligar fortemente às proteínas desnaturandoas -Liga-se às proteínas na proporção 1.4 gr de detergente/gr proteína(constante para diferentes proteínas), conferindo-lhes carga negativa -O SDS é usadoemcombinaçãocom agentesredutores(quebrapontes dissulfureto) Emmédia, 1 moléculasds liga-se a 2 resíduosde aao queconfere uma carga total negativa à proteína proporcional à sua massa 21
As proteínastratadascom SDS, aplicadasnum gel de poliacrilamidae submetidasa um campo eléctrico migram no sentido do pólo positivo(ânodo), sendo separadas de acordo com o seutamanhopelamalhado gel A razãoz/m é constante O peso molecular (PM) de um polipéptidoou proteína é, normalementeexpresso em Daltons(Da), e pode ser calculado através da seguinte formula PM = (nax 71.07) + (nrx 156.18) + (nnx 114.08) + (ndx 115.08) + (ncx 103.10) + (nqx 128.13) + (nex 129.11) + (ngx 57.05) + (nhx 137.14) + (nix 113.15) + (nlx 113.15) + (nkx 128.17) + (nmx 131.19) + (nfx 147.17) + (npx 97.11) + (nsx 87.07) + (ntx 101.10) + (nwx 186.20) + (nyx 163.17) + (nvx 99.13) + 18.02 Como a maioria das proteínas têm um PM elevado (>10000 Da) normalmente o seu peso é expresso em kda(kilodaltons, 1000xDa) 22
Detecção/visualização de proteínas Method Sensibility Dynamic range (protein amount/orders of magnitude) Radioisotopic labeling ~0.5 ng 0.5-1000 ng (3.3) Coomassie Blue >10-50 ng 20-1000 ng (1.7) Silver Nitrate ~0.5 ng 0.5-10 ng (<1.3) SYPRO Ruby ~0.5 ng 0.5-1000 ng (3.3) Flamingo ~0.5 ng 0.5-1000 ng (3.3) CyDyes ~0.5 ng 0.5-1000 ng (3.3) Em geral, os métodos de detecção baseiam-se ma formação de complexos entre as proteínas e os corantes/compostos fluorescentes Para cada tipo de detecção existe uma gama de concentrações em que há uma proporcionalidade entre intensidade de côr/fluorescência e concentração Focagem isoeléctrica 23
Focagem isoeléctrica A focagem isoeléctricaé um método electroforéticoque separaas proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico(pi), isto é, com base no conteúdo de grupos carregados positiva ou negativamente O gel utilizado tem um poro largo para não impedir a mobilidade proteica e contém anfólitos(polímeros policatiónicose polianiónicosde baixa massa com diferentes pi) Aplicando um campo eléctrico, os anfólitosseparam-se criando um gradiente contínuo de ph As proteínas desnaturadas irão migrar até atingirem a zona em que a sua carga total é nula, que corresponde ao seu pi Focagem isoeléctrica 24
16-10-2013 Electroforese bi-dimensional (2-D) Separação de proteínas em géis de poliacrilamida com base no seu: - ponto isoeléctrico (1ª dimensão) - peso molecular (2ªdimensão) Electroforese bi-dimensional 25
Fraccionamento técnicas cromatográficas A cromatografia líquida separa misturas proteicas de acordo com a sua velocidade de movimento entre duas fases: -Fase estacionária sólida, constituída por grânulos esféricos com determinadas características (resina) e empacotados numa coluna -Fase móvel líquida -As moléculas da amostra, ao passarem ao longo da coluna vão estabelecendo interacções com a fase sólida -As moléculas que interagem frequentemente com a superfície dos grânulos demoram mais tempo a atravessar a coluna do que aquelas que interagem pouco -Em geral, regista-se a eluiçãoda amostra ao longo do tempo (ex. Absorvância280 nm) Fraccionamento técnicas cromatográficas Cromatograma 26
Fraccionamento técnicas cromatográficas Tipos de Cromatografia Cromatografia de troca iónica A cromatografia de troca iónica separa biomoléculascom base nas suas características de carga A resina (permutador) consiste numa matriz sólida à qual se encontram ligados grupos químicos ionizáveis Resinas contendo grupos carregados positivamente servem para separar proteínas carregadas negativamente (troca aniónica) Resinas contendo grupos carregados negativamente servem para separar proteínas carregadas positivamente (troca catiónica) 27
Cromatografia de troca iónica Proteínas distintas possuem diferentes quantidades de resíduos de aminoácidos com carga e a um determinado ph a carga total de cada uma será diferente As proteínas existentes numa amostra, ao passarem numa resina com carga iónica de sinal oposto, vão ficando adsorvidasà resina, consoante a sua afinidade As proteínas que possuírem carga nula ou a mesma carga que a resina não serão adsorvidase são arrastadas pelo tampão de lavagem Cromatografia de troca iónica As proteínas que ficam absorvidas são removidas aumentando a força iónica do tampão de eluição Os iões do tampão vão competir com a proteína para os locais de ligação na resina As proteínas também poderão ser eluidas por variação de ph 28
Cromatografia de exclusão molecular (filtração em gel) As moléculas são separadas com base no seu raio hidrodinâmico As resinas utilizadas nas cromatografiasde exclusão possuem poros de dimensões definidas no seu interior As proteínas são separadas de acordo com a sua aptidão para entrar em todos, alguns ou nenhuns desses poros Proteínas de pequenas dimensões entram em todos os poros enquanto que as de dimensões entram só em alguns e as de grandes dimensões são excluídas de todos os poros O limite de separação são ~10 kda Cromatografia de interacção hidrófoba Esta técnica explora a hidrofobicidadeda superfície das proteínas A resina contém grupos hidrófobos (ex. fenilo) A altas concentrações salinas a exposição de resíduos hidrófobos de uma proteína aumenta e, consequentemente, aumentam-se as interacções hidrófobas com as resinas As proteínas são eluídasaplicando um gradiente decrescente de sal à coluna As primeiras a eluirsão menos hidrófobas e as mais hidrófobas são eluídas na ausência de sal 29
Determinação da sequência de proteínas Em 1953 Frederick Sanger sequenciou as duas cadeias da insulina. Os resultados de Sanger estabeleceram que todas as moléculas de umadeterminadaproteínatêma mesmasequênciade aminoácidos. As proteínas podem ser sequenciadas de duas maneiras: - sequenciação real da cadeia polipeptídica - sequenciação do DNA do gene correspondente A insulina consiste em duas cadeias polipeptídicas, A e B, unidas por duasligaçõesdissulfito. A cadeiaa possui21 residuose a cadeiab possui 30 residuos. Sanger demorou 10 anos a completar a sequência Sequencia da insulina bovina. 30
Determinação da sequência de proteínas - uma estratégia em oito passos 1. Se possuir mais do que uma cadeia, separá-las. 2. Cortar(reduzir) as ligação dissulfito 3. Determinar a composição de cada cadeia 4. Determinar os resíduos no N- e C-terminais 5. Cortar cada cadeia em fragmentos menores e determinar a sequencia de cada fragmento 6. Repetir o passo 5., utilizando um método de fragmentação diferente de modo a gerar fragmentos diferentes 7. Reconstruir a sequência da proteína a partir dos fragmentos 8. Determinar a posição das ligações dissulfito Passo 1 Separação das cadeias A interacção das subunidades depende de ligações fracas A separação pode ser executada com : -ph extremo -ureia 8M -guanidina HCl6M -Elevadasconcentrações salinas(normalmente com sulfatode amónio) Passo 2 Quebra das ligações dissulfito Oxidação com ácido Performico Utilização de reagentes redutores de sulfidrilo - mercaptoetanol - dithiotreitol or dithioeritritol -de modoa prevenir a recombinação, tratarde seguida com um agente alquilante como o iodoacetato 31
Passo 3 Passo 4 Passo 4 Passos 5 e 6 Fragmentação das cadeias Fragmentação enzimática tripsina, quimotripsina, clostripaina, protease de staphylococcos fragmentação química Brometo de cianogénio 32
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Passo7 Reconstituição da sequência Use two or more fragmentation agents in separate fragmentation experiments Sequence all the peptides produced (usually by Edman degradation) Compare and align overlapping peptide sequences to learn the sequence of the original polypeptide chain Espectrometria de Massa Peptide mass fingerprinting (PMF) (also known as protein fingerprinting) is an analytical technique for protein identification: 1. The unknown protein of interest is cleaved into peptides by a protease such as Trypsin. 2. The collection of peptides resulting from this cleavage comprise a unique identifier of the unknown protein. 3. The absolute masses of the (still unknown) peptides are accurately measured with a mass spectrometer. 4. These masses are then in silico compared to either a database containing known protein sequences or even the genome. Computer programs translate the known genome of the organism into proteins, then theoretically cut the proteins into peptides with the same protease (for example trypsin), and calculate the absolute masses of the peptides from each protein. They then compare the masses of the peptides of the unknown protein to the theoretical peptide masses of each protein encoded in the genome. The results are statistically analyzed to find the best match. The great advantage is that only the masses of the peptides have to be known (so de novo sequencing is not necessary). A disadvantage is that the protein sequence has to be present in the database of interest. (Wikipedia) 1. 2. 3. 4. Digestion Mass analysis Database search 34
Espectrometro de massa Inlet Ion source Mass analyzer Detector Instrument control system Vacuum system data Análise dos espectros Peptide masses [M+H]+ Conversion of TOF spectrum into Mass spectrum Mass spectrum 684,323467 775,385728 842,507677 926,502101 958,51419 1034,567432 1149,583945 1197,592158 1211,6705 1285,721845 1296,6853 1319,616818 1382,738633 1833,911057 2093,0867 2134,093133 2135,040396 2348,074887 2439,325132 2491,378872 2502,331101 2807,432234 2885,55773 3013,642226 70 35