Isolamento e identificação de Campylobacter spp em amostras clínicas Grace Theophilo LRNCEB - Fiocruz- IOC gtheo@ioc.fiocruz.br
Bacilos Gram Características gerais Finos, curvos ou em forma de S Móveis com único flagelo em 1 ou ambas extremidades (movimento em saca rolha) Espécies são oxidase + e redutora de nitrito Não fermentam nem oxidam carboidratos Microaerofilia (3-5 % de O 2 e 2-10% de CO 2 ) Espécies termotolerantes C.coli e C lari C. jejuni,
Epidemiologia - Zoonose de distribuição mundial - Comensais no TGI (bovinos, suínos, cães, gatos e principalmente aves) - Infecções + freqüente nos meses quentes C. jejuni CDC 2,4 milhões de casos/ano C. coli Alimentos envolvidos - leite - carne de frango - carne bovina - carne suína Dose infectante: 500 mo C.jejuni: 10 4
Infecção Período de incubação : 2 a 10 dias Doença é autolimitante Período da infecção: 1 a 7 dias O microrganismo é excretado nas fezes durante várias semanas Infecção depende dos fatores do hospedeiro e do patógeno.
Patogenia Transmissão: fecal-oral e pessoa-pessoa -1 coloniza a mucosa intestinal -Invade através da superfície epitelial o tecido subjacente = inflamação na lâmina própria e abcessos nas criptas hemácias e leucócitos nas fezes
Sintomas 24 h após início dos sintomas - Dor abdominal, diarréia (aquosa ou com sangue),náusea, dor muscular e febre. - Infecções extra intestinais em imunocomprometidos: Colecistite Pancreatite SUH Síndrome de Guillén-Barré Nefrite
Isolamento e identificação Coleta A coleta da amostra pode ser realizada através de swab retal evacuação espontânea (Frasco) processada + rápido possível(sensível ao O 2 ) T >2 horas = meios de transporte
Meios detransporte Água Peptonada Alcalina com tioglicolato e cistina meio de Stuart modificado meio de Cary & Blair As amostras em meio de Cary & Blair - armazenadas a 4ºC
Preparo da Amostra Fecal Pode ser semeada diretamente em placa de Agar seletivo para Campylobacter suspensão em uma solução tampão (Solução Salina ou Água Peptonada 0,1%)
Meios de cultura = Isolamento - Agar Skirrow = chave do sucesso do isolamento Peptonas, sangue de cavalo e antibióticos - Meios c/ sangue : peptonas, sangue (ag. seqüestrante de O 2 ) e antibióticos Ex.: Agar Skirrow, Agar Butzler e Agar Preston LRNCEB Campylobacter Agar Base (Difco/214892)
Meios de cultura = Isolamento Meios s/ sangue: proteína, carvão (ag. seqüestrante de O2) e antibióticos Ex:mCCDA e Kamali Agar modificado de carvão, cefoperazona e desoxicolato LRNCEB Campylobacter Blood-free Selective Agar Base (Oxoid/CM 0739)
Antibióticos A inclusão dos antibióticos foi crucial para o isolamento: - Vancomicina = inibe cocos Gram + - Polimixina B = inibe enterobactérias e Pseudomonas spp - Trimetoprim = inibe Proteus spp e cocos gram + - Cefalosporina = inibe Enterobacter spp, Serratia spp, P. aeruginosa, alguns Proteus e Yersínia enterocolítica - Anfotericina B = inibe fungos
Atmosfera de Incubação - Substituição de uma atmosfera normal por uma mistura apropriada de gases (bomba de vácuo) - Utilização de geradores de gases comerciais. Ex: BBL, Oxoid, Bio-Meriuex e Probac - Geradores opcionais: Para jarra de 2,5 L de capacidade: ½ bombril embebido em solução de sulfato de cobre ½ Alka-Seltzer (em uma placa) acrescida de Sol. Sulfato de cobre
Fluxograma de isolamento e identificação presuntiva de Campylobacter sp Plaqueamento em ágar seletivo ágar seletivo + suplemento seletivo (Merck) 42ºC/48h (microaerofilia) Isolamento Identificação Presuntiva Bioquímica
Identificação Presuntiva -Coloração de Gram - Motilidade
Identificação Presuntiva - Teste de Catalase LRNCEB (Difco/261203) - Teste de Oxidase LRNCEB (Difco/261181)
Diferenciação das espécies -Hidrólise do Hipurato LRNCEB Ác. Hipúrico sal sódico (Sigma/H9380) - Termo-tolerância -Hidrólise do Indoxil-Acetato LRNCEB Indoxyl acetate (Sigma/076K1485)
Diferenciação das espécies Teste de Sensibilidade a Antibióticos (Ácido Nalidíxico e Cefalotina) LRNCEB (Oxoid) Produção de H2S em TSI
Prova C.fetus ssp.fetus C.hyointes tinalis C.jejuni ssp.jeju ni C.jejuni ssp.doylei C.coli C.lari C.upsalie nsis Catalase + + + V + + - Redução de NO 3 + + + - + + + Produção de H 2 S (TSI) - + - - V - - Hidrólise do: -hipurato - - + V - - - -indoxilacetato - - + + + - + Crescimento : 25 C + V - - - - - 37 C + + + + + + + 42 C - V + - + + V Sensibilidade: Acido nalidíxico V R S S S R S Cefalotina S S R S R R S
FIM!!!!!