MARCELO EUSTÁQUIO DE SIQUEIRA E ROCHA

MARCELO EUSTÁQUIO DE SIQUEIRA E ROCHA EFEITO DO ÁCIDO URSODESOXICÓLICO E O PAPEL DA MUCOSA NO DESENVOLVIMENTO DE DISMOTILIDADE ESOFAGIANA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM COBAIAS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo programa de pós-graduação em Gastroenterologia Cirúrgica. São Paulo 2010

MARCELO EUSTÁQUIO DE SIQUEIRA E ROCHA EFEITO DO ÁCIDO URSODESOXICÓLICO E O PAPEL DA MUCOSA NO DESENVOLVIMENTO DE DISMOTILIDADE ESOFAGIANA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM COBAIAS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo programa de pós-graduação em Gastroenterologia Cirúrgica. Orientador: Prof. Dr. Fernando A. M. Herbella Fernandes Coorientador: Prof. Dr. José Carlos Del Grande São Paulo 2010

Rocha, Marcelo Eustáquio Siqueira EFEITO DO ÁCIDO URSODESOXICÓLICO E O PAPEL DA MUCOSA NO DESENVOLVIMENTO DE DISMOTILIDADE ESOFAGIANA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM COBAIAS./ Marcelo Eustáquio Siqueira Rocha São Paulo, 2010. xv, 76f. Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Gastroenterologia Cirúrgica. Título em inglês: Effects of ursodeoxycolic acid and the role of mucosa in esophageal dysmotility. An experimental study. cobaia. 1. Motilidade. 2. Esôfago. 3. Ácido ursodesoxicólico. 4. Estudo experimental /

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GASTROENTEROLOGIA Chefe do Departamento: Prof.ª Dr.ª Lydia Masako Ferreira Coordenador do Curso de pós-graduação: Prof. Dr. Delcio Matos iii

MARCELO EUSTÁQUIO DE SIQUEIRA E ROCHA TÍTULO: EFEITO DO ÁCIDO URSODESOXICÓLICO E O PAPEL DA MUCOSA NO DESENVOLVIMENTO DE DISMOTILIDADE ESOFAGIANA: ESTUDO EXPERIMENTAL COM COBAIAS Presidente da banca: Prof. Dr. Fernando A. M. Herbella Fernandes BANCA EXAMINADORA MEMBROS TITULARES Prof. ª Dr.ª Alice Teixeira Ferreira Prof. Dr. Gaspar de Jesus Lopes Filho Prof. Dr.Nelson Adami Andreollo Prof. Dr.Paulo Roberto Corsi MEMBROS SUPLENTES Prof. Dr. Jorge Mali Jr Prof. Dr. Jose Francisco Farah iv

Dedicatória À Josiane, esposa amada, meu porto seguro. A João Pedro, Maria Clara e João Gustavo, filhos queridos, fonte de minha perseverança. v

Agradecimentos Ao Prof. Dr. Fernando A. M. Herbella Fernandes, meu orientador, fonte de sabedoria apesar da tenra idade, pela presença amiga em todos os momentos do desenvolvimento deste trabalho, pelas orientações sempre seguras, pela dedicação e amor à pesquisa, que foi e sempre será um exemplo em minha vida profissional e pelo grande estimulo na conclusão de mais uma etapa acadêmica, sem o qual, certamente, não seria possível a concretização desse sonho. Ao Prof. Dr. Delcio Matos, que, de braços abertos, me recebeu no Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica da UNIFESP, como pós-graduando, colocando à disposição todos os recursos da Disciplina e pela importante participação em minha formação em metodologia da pesquisa. Ao Prof. Dr. José Carlos Del Grande pelo apoio e estímulo durante o desenvolvimento deste trabalho. À Prof.ª Dr.ª Alice Teixeira Ferreira, Chefe do Laboratório de Biofísica da Universidade de São Paulo, que permitiu a realização deste estudo em seu laboratório. Ao pós-graduando Chandler Tahan, pelo auxílio técnico, pelo apoio e colaboração na obtenção dos espécimes e pelas palavras amigas de incentivo nos momentos de incertezas. A todos os colegas da pós-graduação da disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica, da Universidade Federal de São Paulo, pelas valorosas sugestões, contribuições e críticas no decorrer deste estudo. Aos funcionários da disciplina de Gastroenterologia Cirúrgica, da Universidade Federal de São Paulo, pela presteza, carinho e educação com os alunos da pósgraduação. vi

A todos os residentes e ex-residentes do nosso Serviço de Cirurgia Geral da Santa Casa de Misericórdia de Montes Claros que, muito mais que aprendizes, me ensinam, a cada dia, o valor da vida acadêmica. Aos colegas da Clínica Cirúrgica, da Santa Casa de Misericórdia de Montes Claros pelo apoio logístico na realização deste trabalho. Aos colegas da disciplina de Clínica Cirúrgica, da Universidade Estadual de Montes Claros, por compreenderem e apoiarem minha ausência nessa fase de minha vida acadêmica. A minha querida tia, Judith Siqueira, a qual me acolheu e hospedou durante as diversas estadas em São Paulo, fazendo-me sentir em casa. Ao Dr. Geraldo Magela Serpa, ex-aluno, ex-residente e atual colega com o qual sempre pude contar nos momentos árduos do cotidiano. Às colegas da EMTN, pelo apoio, compreensão e suporte na criação do nosso Grupo de Terapia Nutricional da Santa Casa de Montes Claros. estudo. À Prof.ª Marize Fagundes, pelo apoio importante na análise estatística deste À Prof.ª Nely Rachel Veloso Lauton, pelo esmero na revisão e correção ortográfica. Ao Alisson Mauro, pela aplicação e esmero na digitação e diagramação dos originais deste estudo. A meus pais que, apesar de figurarem ao final desta lista, não menos importantes, foram a razão inicial de tudo isso, me dando carinho, educação, caráter e por sempre estarem presentes em todos os momentos de minha vida. Meu respeito, minha admiração e minha eterna gratidão. vii

Temos que aprender a desaprender para afinal, talvez muito mais tarde, alcançar ainda mais: mudar de sentir. Os maiores acontecimentos e pensamentos são os que mais tardiamente são compreendidos: as gerações que lhe são contemporâneas não vivem tais acontecimentos - sua vida passa por eles. Aqui acontece algo como no reino das estrelas. A luz das estrelas mais distantes é a que mais tardiamente chega aos homens; e antes que chegue, o homem nega que ali haja estrelas. De quantos séculos precisa um espírito para ser compreendido? Nietzsche (1885-1886) viii

SUMÁRIO Dedicatória... v Agradecimentos... vi Listas... xi Resumo... xv 1 INTRODUÇÃO... 1 1.1 Objetivo... 4 2 REVISÃO DA LITERATURA... 5 2.1 Doença do refluxo gastroesofagiano... 5 2.1.1 Definição... 5 2.1.2 Prevalência... 5 2.1.3 Mecanismos de refluxo... 6 2.1.4 Relaxamento esfincteriano... 7 2.1.5 Hérnia hiatal... 7 2.1.6 Retardo do esvaziamento gástrico... 8 2.1.7 Mecanismos protetores... 8 2.1.7.1 Defesa pré-epitelial... 8 2.1.7.2 Defesa epitelial... 8 2.1.7.3 Defesa pós-epitelial... 9 2.1.8 Papel do refluído... 10 2.1.9 Manifestações clínicas e diagnóstico... 11 2.1.10 Indicações e limitações dos principais métodos diagnósticos... 13 2.2 Refluxo ácido... 18 2.3 Refluxo duodenogástrico... 18 2.4 Refluxo duodenogastroesofagiano... 19 2.4.1 Histórico... 20 2.4.2 Detecção de suco duodenal... 21 2.4.2.1 Técnicas de aspiração... 21 2.4.2.2 Técnicas cintilográficas... 21 2.4.2.3 Monitorização do ph... 21 2.4.2.4 Monitorização ambulatorial da bilirrubina... 22 2.5 Refluxo gastroesofagiano do suco duodenal... 22 2.6 Suco duodenal e esofagite... 22 2.7 Doença do refluxo gastroesofagiano e desordens motoras... 23 2.7.1 Conceituação... 23 2.7.2 Causas e consequências de disfunções motoras... 24 2.7.3 Estudos in vitro que demonstram alterações na função neuromotora intestinal após processos inflamatórios ou ativação imunológica... 24 3 MÉTODOS... 26 3.1 Método... 26 3.1.1 Delineamento da pesquisa... 26 3.1.2 Projeto piloto... 26 ix

3.1.3 Cálculo do tamanho da amostra... 26 3.1.4 Casuística... 27 3.1.5 Comitê de Ética... 27 3.1.6 Origem dos animais... 27 3.1.7 Coleta do material... 27 3.1.8 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no Grupo A... 29 3.1.9 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no Grupo B... 32 3.1.10 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no Grupo C... 34 3.2 Materiais... 34 3.2.1 Drogas e reagentes... 34 3.2.2 Soluções nutritivas... 35 3.2.2.1 Concentração dos componentes em mm... 35 3.3 Análise estatística... 35 3.4 Fluxograma da pesquisa... 36 4 RESULTADOS... 37 4.1 Cálculo do tamanho da amostra... 37 4.2 Análise dos resultados... 38 4.2.1 Avaliação da amplitude contrátil dos grupos A,B e C... 38 4.2.2 Análise descritiva... 39 4.2.3 Teste de aderência a normalidade... 40 4.2.4 Resultados da comparação entre grupos (Pré)... 41 4.2.5 Resultados da comparação entre grupos (Pós)... 42 4.2.6 Resultados das comparações intragrupos... 42 4.2.6.1 Gráfico resumo das comparações intragrupos... 43 5 DISCUSSÃO... 44 5.1 Estratégias de pesquisa e critérios de seleção de trabalhos... 44 5.2 Metodologia... 44 5.3 Doença do refluxo gastroesofagiano e dismotilidade esofagiana... 47 5.4 Papel da bile... 50 5.5 Papel da mucosa esofagiana... 55 5.6 Considerações finais... 56 5.6.1 Autocrítica... 56 5.6.2 Implicações clínicas... 57 5.6.3 Perspectivas futuras... 58 5.6.4 Dificuldades da tese... 58 6 CONCLUSÕES... 60 7 ANEXO... 61 8 REFERÊNCIAS... 63 Abstract Bibliografia consultada x

LISTA DE FIGURAS Figura 01 Aspectos anatômicos da junção esofagogástrica... 6 Figura 02 Ilustração dos diferentes mecanismos de citotoxicidade mediados por ácido e bile... 9 Figura 03 Exposição do tórax e abdômen de cobaia... 28 Figura 04 Detalhe da transição esofagogástrica... 28 Figura 05 Espécime de esôfago... 29 Figura 06 Espécime de esôfago em câmara de perfusão de órgão... 30 Figura 07 Sistema computadorizado de aquisição e análise de dados... 30 Figura 08 Estímulo dos espécimes para avaliação da amplitude contrátil... 31 Figura 09 Espécimes de esôfago banhados com ácido ursodesoxicólico... 31 Figura 10 Representação gráfica dos ensaios de contração... 31 Figura 11 Introdução do bastão metálico no esôfago... 32 Figura 12 Inversão do esôfago sobre seu próprio eixo... 32 Figura 13 Inversão do esôfago sobre seu próprio eixo com auxílio de pinça anatômica... 33 Figura 14 Espécime esofagiano invertido com exposição da túnica mucosa... 33 Figura 15 Cuidadosa dissecção com remoção da mucosa e submucosa... 33 Figura 16 Gráfico do teste de normalidade para a variável amplitude de contração segundo grupo... 43 xi

LISTA DE TABELAS Tabela 01 Tabela 02 Tabela 03 Tabela 04 Tabela 05 Tabela 06 Tabela 07 Tabela 08 Resultados da avaliação da amplitude contrátil nos grupos A, B e C (Pré)... 38 Resultados da avaliação da amplitude contrátil nos grupos A, B e C (Pós)... 39 Medidas descritivas da variável amplitude de contração segundo grupo nos dois momentos (Pré e Pós)... 40 Teste de normalidade para a variável amplitude de contração segundo grupo nos dois momentos (Pré e Pós)... 40 Resultado da análise de variância (Anova) que comparou as médias da variável dependente entre os três grupos (PRÉ)... 41 Resultados das múltiplas comparações entre as médias dos grupos A e B... 41 Resultado da análise de variância (Anova) com as médias da variável dependente entre os três grupos (PÓS)... 42 Teste t pareado (para cada grupo) onde se observa as médias das diferenças, seus respectivos desvios padrão, a estatística do teste t e valor-p... 42 xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS DRDGE Doença do refluxo duodenogastroesofagiano DRGE Doença do refluxo gastroesofagiano DRNE Doença do refluxo não erosiva EB Esôfago de Barret EE Esofagite erosiva EEI Esfíncter esofágico inferior ER Esofagite de refluxo ETREEI Episódios transitórios de relaxamento do esfíncter esofagiano inferior F Estatística do teste FAP Fator de agregação plaquetária gl grau de liberdade H2O2 Peróxido de hidrogênio HH Hérnia do hiato esofágico IBP Inibidor bomba protônica IL-1 β Interleucinas 1-beta (IL-1) IL-6 Interleucina 6 JEG Junção esofagogástrica KCl Cloreto de potássio MQ média dos quadrados PGE2 Prostaglandina E2 RAGE Refluxo ácido gastroesofágico RDG Refluxo duodenogástrico RDGE Refluxo duodenogastroesofagiano RGE Refluxo gastroesofagiano RNA Refluxo não ácido SQ Soma dos Quadrados t teste T de Student xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 2 d Variância estimada das diferenças entre as médias (antes e depois); z 2 Escore da distribuição normal associado ao erro tipo I (α); z 1 Escore da distribuição normal associado ao poder do teste (1- β); Diferença estimada entre as médias (antes e depois). xiv

RESUMO Objetivo: Determinar o efeito do ácido ursodesoxicólico e o papel da mucosa no aparecimento de alterações motoras, na musculatura esofagiana de cobaias. Métodos: Trabalho experimental realizado com 18 cobaias albinas do sexo masculino pesando entre 200 e 250g. Os animais foram distribuídos em 03 grupos, sendo assim constituídos: Grupo (A)- 06 animais formaram o grupo experimental Esôfago com mucosa, Grupo (B)- 06 animais formaram o grupo experimental Esôfago sem mucosa e Grupo (C)- 06 animais formaram o grupo controle. Os animais foram sacrificados e o esôfago distal foi removido. Após identificação da transição epitelial escamo-colunar, foi realizada a secção ao nível da mesma desprezando-se a câmara gástrica. Os espécimes de esôfago foram encaminhados para prova de avaliação contrátil, utilizando-se câmaras de perfusão de órgãos e um sistema de aquisição de dados com o programa KITCAD 8. Os espécimes foram mantidos em solução salina oxigenada por 01 hora, com estiramento de 01 grama a fim de readquirirem sua tensão basal e foram estimulados com 40mM de KCl. Após a verificação da manutenção contrátil e avaliação da amplitude contrátil inicial, os fragmentos foram banhados na solução de 100 mm de ácido ursodesoxicólico, nos grupos A e B, e em solução salina fisiológica, no grupo C, por 01 hora, e, então, novamente estimulados com 40mM de KCl, e realizados cinco estímulos com intervalo de cinco minutos para o registro da amplitude contrátil. Resultados: A média da amplitude de contração antes da incubação (pré) variou entre os grupos (p=0,006) com médias de 1,319(A), 0,306(B) e 1,795(C). Após a incubação (pós), a média da amplitude de contração foi de 0,709, 0,278 e 1,353 para os grupos A, B e C, respectivamente. Antes da incubação, não houve diferença na amplitude de contração entre os grupos A e C (p=0,633) e houve diferença entre os grupos A e B (p=0,039) e B e C (p=0,048). Após a incubação, quando comparamos as diferenças das médias dentro dos grupos nos momentos pré e pós, encontramos apenas diferenças no grupo A (p=0,030). Conclusões: A exposição esofagiana ao ácido ursodexosicólico, componente da bile, induz a uma diminuição da amplitude de contração esofagiana. A mucosa esofagiana desempenha importante papel na motilidade esofagiana. Palavras-chave: 1. Motilidade. 2. Esôfago. 3. Ácido ursodesoxicólico. 4. Estudo experimental / cobaia. xv

1 INTRODUÇÃO A doença do refluxo gastroesofagiano (DRGE) é uma das doenças mais comuns do trato gastrointestinal. (1) O refluxo gastroesofagiano (RGE) é definido como retorno passivo do conteúdo gástrico para o esôfago sem implicação etiológica. A passagem espontânea de conteúdo gástrico e/ou duodenal para o esôfago ocorre repetidamente durante a vida em todos os indivíduos normais, porém se ocorre muito frequentemente, torna-se anormal e causa doença. Assim, o RGE pode ocorrer em condições normais, constituindo um evento fisiológico, sem maiores consequências clínicas, conhecido, nesse caso, como refluxo fisiológico ou, então, ocorrer em condições patológicas quando, seja pela frequência aumentada dos episódios de refluxo, seja pelo maior tempo de exposição da mucosa esofágica ao material refluído ocorrem complicações clínicas e histopatológicas. Nesta última situação, o RGE passa a constituir uma entidade atualmente conhecida como DRGE. (1-2) Os sintomas relacionados à DRGE são extremamente comuns, visto que aproximadamente 20% dos adultos apresentam pirose e/ou regurgitação, pelo menos, uma vez por semana e 40%, mensalmente. (1) Se forem consideradas as manifestações extraesofágicas estima-se que a real prevalência de refluxo patológico possa estar subestimada. A denominação sintomas atípicos serve de sinônimo para os sintomas extraesofágicos relacionados à DRGE que podem se associar a manifestações pulmonares e doenças de vias aéreas inferiores, como asma, tosse crônica, bronquite, pneumonia aspirativa e fibrose pulmonar idiopática; sinais e sintomas otorrinolaringológicos, incluindo rouquidão, laringite, estenose subglótica, granuloma de prega vocal e carcinoma de laringe; outras manifestações extraesofágicas como dor torácica não cardíaca, erosão dentária, sinusite, faringite, apneia do sono e fenômenos de dismotilidade esofagiana. (3) A maioria dos pacientes com os sintomas extraesofágicos da DRGE não apresenta os sintomas típicos. Isso confere dificuldade em se fazer o diagnóstico da DRGE, visto que, na maioria dos casos, a investigação subsequente será baseada

Introdução 2 primariamente na suspeita clínica. Os pacientes com manifestações extraesofágicas da DRGE, quando avaliados com endoscopia digestiva alta, usualmente apresentam uma baixa prevalência de esofagite. (4) A endoscopia digestiva alta pode ser realizada para averiguação de lesões na mucosa esofagiana, embora cerca de 75% dos pacientes não apresentem evidências de esofagite. (3-4) Esses pacientes apresentam a mucosa esofagiana grosseiramente normal ou, mais frequentemente, apresentam a chamada doença do refluxo não erosiva (DRNE). Sem os sintomas clássicos da DRGE ou a presença de esofagite, a monitorização do ph esofágico em 24 horas (ph metria -24h) torna-se uma ferramenta útil para se documentar o refluxo patológico. Mesmo sendo considerado o padrão ouro, apresenta alta taxa de resultados falso-negativos (20% a 50%), não sendo possível se excluir o diagnóstico de DRGE.. (3) A ph metria esofagiana é capaz de aferir apenas os episódios de refluxo ácido gastroesofagiano (RAGE), não sendo possível a mensuração dos episódios de refluxo não ácido (RNA), muito citados na literatura, por seus efeitos lesivos à mucosa esofagiana. Atualmente, apesar de ainda não bem conhecida a fisiopatologia da DRGE, acredita-se que o refluxo patológico seja multifatorial, sendo causado por alterações na secreção ácida gástrica, RNA, alterações motoras esofagianas, hérnia hiatal (HH), baixa pressão do esfíncter esofagiano inferior (EEI), episódios transitórios de relaxamento do esfíncter esofagiano inferior (ETREEI), anormalidades no esvaziamento gástrico, defeitos na barreira mucosa, aumento da pressão intraabdominal e possivelmente infecção pelo Helicobacter pylori. (5-6) Pacientes que apresentam permanentemente baixas pressões do EEI evoluem com esofagites graves, enquanto que aqueles com ETREEI, que representa o principal mecanismo da DRGE, são os pacientes com esofagite não erosiva ou aqueles com quadros moderados. (5-6)

Introdução 3 O papel do RAGE parece estar bem estabelecido na fisiopatologia da DRGE. Estudos têm demonstrado que a exposição prolongada da mucosa esofagiana ao conteúdo gástrico com ph abaixo de 4 leva ao aparecimento de sintomas e de lesões na mucosa. (7) De fato, a exposição da mucosa esofagiana a um ph abaixo de 4 ou 3 é um fator preditivo relacionado ao aparecimento de sintomas e se correlaciona bem com a severidade das lesões mucosas. (8) Embora o RAGE seja considerado o principal responsável pela DRGE, tem sido sugerido que o componente não ácido do refluxo possa exercer papel nas alterações esofagianas. (8) Estudos experimentais têm demonstrado que o RAGE só desencadearia alterações esofagianas em altas concentrações, porém, quando associado a pequenas quantidades de pepsina as alterações micro e macroscópicas, na mucosa esofagiana apareceriam. (9-11) A maioria dos estudos de RNA têm como foco principal o refluxo duodenogastroesofagiano (RDGE), particularmente o seu papel na etiologia da lesão esofagiana, assim como na sua sintomatologia. O RDGE pode desencadear pirose, quando associado ao RAGE causando mais sintomatologia do que o refluxo ácido isolado. (12-13) As evidências do potencial papel de participação da bile nas alterações esofagianas surgiram com a demonstração de uma maior concentração desta no conteúdo refluído de pacientes portadores de esofagite, quando comparados com indivíduos sem esofagite. (14-15) A falta de um método de avaliação fidedigno, considerado padrão ouro, para a correta aferição do RNA talvez seja a principal causa responsável para a implicação do mesmo, de forma incisiva, na DRGE. Manifestações esofagianas decorrentes da DRGE, muito estudadas nos últimos anos, são as alterações motoras induzidas pelo refluxo (ácido e/ou não ácido), o qual produziria um processo inflamatório na mucosa, com impacto na liberação de neurotransmissores teciduais. Essas alterações, quando mais bem estabelecidas, podem gerar mudanças na abordagem diagnóstica e terapêutica da DRGE. Um grande número de trabalhos na literatura tem demonstrado as alterações motoras esofagianas induzidas pelo RAGE, porém o mesmo não é verdade para o

Introdução 4 RNA. Desta forma, delineamos o presente estudo a fim de demonstrar a presença ou não, de alterações motoras na musculatura esofagiana, em cobaias submetidas a estímulo esofagiano, com ácido ursodesoxicólico, um dos componentes da bile. 1.1 Objetivo Determinar o efeito do ácido ursodesoxicólico e o papel da mucosa no aparecimento de alterações motoras na musculatura esofagiana de cobaias.

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Doença do refluxo gastroesofagiano 2.1.1 Definição Definição da afecção é sugerida pelo I Consenso Brasileiro sobre Doença do Refluxo Gastroesofágico (16) : é uma afecção crônica decorrente do fluxo retrógrado de parte do conteúdo gastroduodenal para o esôfago e/ou órgãos adjacentes, acarretando variável espectro de sintomas (esofágicos ou extraesofágicos), associados ou não a lesões teciduais. 2.1.2 Prevalência A DRGE é afecção de grande importância médico-social pela elevada e crescente incidência e por determinar sintomas de intensidade variável, que se manifestam por tempo prolongado, podendo prejudicar consideravelmente a qualidade de vida do paciente. A prevalência global da DRGE no mundo ocidental é estimada em 20-40%. Na Ásia, uma prevalência de 5-20% foi reportada, (17) e na África subsaariana, a doença se apresenta extremamente rara, assim como o adenocarcinoma do esôfago. (18) No ocidente, tem havido relatos de aumento na incidência de DRGE. (19-20) Apresenta prevalência estimada de 20% na população adulta dos EUA (21) e taxas similares na Europa. Sintomas diários de refluxo são manifestados por 4-7% da população ocidental sendo que até 20% têm sintomas semanais. (19,21) Estudo populacional realizado no condado de Olmsted revelou que cerca de 59% da população relatava azia ocasional e/ou regurgitação. (22) Sintomas ocasionais de refluxo foram relatados por 25% na população sueca. (23) Esofagite erosiva (EE) é vista em 2% da população, e

Revisão da Literatura 6 complicações como metaplasia epitelial em 0,4%, sendo o adenocarcinoma do esôfago em 4 / 100 000. (21) O adenocarcinoma tem sido fortemente associado com a DRGE (24) e tem representado a neoplasia com mais rápido aumento na incidência de todos os cânceres, tendo superado o carcinoma de células escamosas, que se apresentava como forma mais frequente de câncer esofagiano. (25) idade. (26) Na população adulta, a prevalência de DRGE não é dependente de sexo ou No Brasil, em estudo populacional empreendido em 22 metrópoles, entrevistandose amostra de 13.959 indivíduos, (27) observou-se que 4,6% das pessoas entrevistadas apresentavam pirose uma vez por semana e que 7,3% apresentavam tal queixa duas ou mais vezes por semana. Em função desses dados, estima-se que a prevalência da DRGE, em nosso meio, seja ao redor de 12%. 2.1.3 Mecanismos de refluxo O RGE aparece quando ocorre alguma falha na complexa estrutura da junção esofagogástrica (JEG). A estrutura é composta pelo EEI, a crura diafragmática, o ligamento freno-esofagiano, o ângulo agudo de His, o segmento intra-abdominal do esôfago e pela disposição da mucosa em forma de roseta (Figura 1). Crura Segmento Abd. Esfíncter esofagiano inferior Ângulo de His Prega da mucosa em roseta Figura 1 - Aspectos anatômicos da junção esofagogástrica

Revisão da Literatura 7 2.1.4 Relaxamento esfincteriano Refluxo pode ocorrer como resultado da baixa pressão crônica do EEI ou durante ETREEI (28) que, aparentemente, representa a principal causa da doença do refluxo. (29) Acredita-se que os ETREEI são responsáveis pela eliminação do excesso de ar, quando o estômago se encontra distendido, sendo mais frequentes na posição vertical, (30) acionados pela distensão gasosa do estômago, principalmente pela distensão do cárdia. (31) Os ETREEI não são mais frequentes em pacientes com doença do refluxo quando comparados com indivíduos assintomáticos, mas são mais frequentemente associados ao refluxo ácido. (32) Os ETREEI duram mais do que o relaxamento do EEI induzido pela deglutição, (33) sendo mediados neurologicamente com concomitante inibição da crura diafragmática. (34) Baixas pressões do EEI são frequentemente observadas em pacientes portadores de EE. Quando a pressão do EEI cai abaixo de 10 mmhg, o refluxo ocorre frequentemente como resultado do aumento da pressão abdominal (flexão e tosse). Não se sabe ainda se a diminuição da contratilidade do EEI é causada pelo refluxo ou por uma doença primária motora, entretanto, a pressão esfincteriana não melhora com o tratamento ácido supressor. (35) 2.1.5 Hérnia hiatal Pacientes que apresentam HH perdem vários dos mecanismos antirrefluxos; o segmento abdominal do esôfago, o ângulo agudo de His e a prega da mucosa em forma de roseta. Além disso, a crura diafragmática aplica a sua pressão abaixo do EEI perdendo, assim, o sinergismo com ele. Episódios de refluxo são geralmente causados pelo esforço, inspiração profunda e pelo relaxamento do EEI, induzido pela deglutição normal e não por ETREEI. (36) Entretanto, em um estudo realizado por Kahrilas et al., (37) ETREEI induzidos pela distensão gástrica foram mais frequentes em pacientes com HH do que em controles e pacientes com doença do refluxo gastroesofagiano sem HH.

Revisão da Literatura 8 2.1.6 Retardo do esvaziamento gástrico O retardo no esvaziamento gástrico é observado em casos de obstrução pilórica e em condições de redução da motilidade gástrica, tais como diabetes mellitus, doença de Parkinson e após cirurgias com vagotomia. Na DRGE, parece haver um atraso no esvaziamento do estômago proximal, mas não no esvaziamento gástrico total. (38) Existem, no entanto, alguns estudos anteriores que encontraram evidências para o esvaziamento gástrico total retardado, (39-40) e os que também demonstram ausência de alterações no esvaziamento gástrico em pacientes com DRGE. (41-42) 2.1.7 Mecanismos protetores 2.1.7.1 Defesa pré-epitelial A defesa pré-epitelial consiste na ação neutralizadora conjunta do muco produzido a partir de glândulas salivares e glândulas da mucosa esofagiana distal, concomitante ao movimento peristáltico esofagiano, desempenhando o papel de clareamento da luz esofagiana. Um defeito em qualquer um destes fatores pode aumentar o risco de lesão esofágica, como visto em indivíduos com acalásia (43) e esclerodermia. (44) No entanto, não se sabe se a saliva desempenha um papel importante na proteção esofágica em homens. (45) Aproximadamente 20% dos pacientes com EE têm alguma disfunção na motilidade esofagiana, aferida no corpo esofagiano ou pelas características do EEI; se isso é secundário ao refluxo, entretanto, ainda não se sabe. (46-47) Existem relatos que a motilidade diminuída não melhora após tratamento clínico ou cirúrgico do refluxo, (48-49) porém, Herbella et al. (50) nos demonstram os efeitos positivos da terapêutica cirúrgica antirrefluxo. 2.1.7.2 Defesa epitelial O epitélio esofagiano é muito resistente à exposição ao ácido. Perfusões com HCl 0,1 N por 30 minutos, como se faz no teste Bernstein, (51) não afetam a integridade

Revisão da Literatura 9 epitelial. O esôfago praticamente não dispõe do muco, que protege o epitélio cilíndrico, dos segmentos mais distais do trato digestório, em vez disso, apresenta uma resistente membrana apical e camadas de tight junctionsˮ com glicoproteinas intracelulares. Se essas estruturas (barreiras) forem superadas (quebradas) e os íons de hidrogênio penetrarem nas células epiteliais, bombas de troca de hidrogênio, na membrana celular, entram em ação. Um delas é a Na + / H + e outra é a bomba trocadora de Na + que depende da concentração de Clˉ/HCO3ˉ. (52) Quando essas bombas entram em ação, nota-se um acúmulo de líquido no espaço extracelular que pode ser observado à microscopia óptica e eletrônica. (53) (Figura 2) Figura 2 - Ilustração dos diferentes mecanismos de citotoxicidade mediados por ácido e bile 2.1.7.3 Defesa pós-epitelial A capacidade de neutralização da micro circulação da túnica submucosa esofágica é chamada de defesa pós-epitelial. Isto é, onde os íons de hidrogênio, em última instância, são transportados para longe do epitélio.

Revisão da Literatura 10 2.1.8 Papel do refluído Substâncias endógenas capazes de induzir agressão ao esôfago são: ácido clorídrico, pepsina, tripsina, fosfolipases e ácidos biliares. Essas substâncias representam as causas mais comuns de ER. Estudos sobre a toxicidade dessas substâncias têm sido realizados principalmente em esôfagos de animais. Ácido clorídrico: A membrana apical do epitélio estratificado esofágico é muito resistente aos íons de hidrogênio. Um ph luminal de 2 promove pouca ou nenhuma acidificação do citosol epitelial. (54-55) Quando, porém, existem danos na integridade epitelial, o ácido clorídrico é capaz de provocar azia, como no teste de Bernstein, (51) quando a mucosa esofágica é lavada com 0,1 N de ácido clorídrico por 30 minutos ou até que os sintomas de azia ou dor no peito apareçam. O HCl também atua como um mecanismo facilitador para a ação da pepsina, tripsina e ácidos biliares. Pepsina: Pepsina é uma enzima proteolítica produzida pelo estômago. É ativada em um meio ácido, aumentando a permeabilidade celular, permitindo que íons de hidrogênio entrem no espaço intercelular, que é menos resistente do que a membrana apical. (54,56-57) A pepsina não é proteolítica em ph neutro. Tripsina: Tripsina é uma enzima proteolítica pancreática que é inativada em ph ácido. Aumenta a permeabilidade da mucosa e facilita lesões pelo ácido. (56) Estudos demonstram que o tratamento com um inibidor da tripsina diminui a esofagite induzida cirurgicamente em ratos com DRGE. (58) Lipase: A lipase pancreática também tem a capacidade de aumentar a permeabilidade da mucosa esofágica em ph neutro. (59) Bile: Sais biliares conjugados e não conjugados, bem como a lisolecitina formada pela ação da fosfolipase sobre a lecitina, são os principais componentes lesivos da bile. Sais biliares são excretados nos ductos biliares na forma conjugada. Os ácidos biliares primários cólico e quenodesoxicólico são conjugados com taurina

Revisão da Literatura 11 ou glicina na proporção de 1:3. A conjugação aumenta a solubilidade dos ácidos biliares. No intestino, bactérias intestinais podem transformar ácidos biliares primários em ácidos biliares secundários, tais como ácido desoxicólico (derivado do cólico) e litocólico (derivado do quenodesoxicólico). Os ácidos biliares podem penetrar nas células da mucosa, quando estão em sua forma lipofílica. Isso ocorre em um intervalo de ph de 2-5 para os ácidos biliares conjugados e em ph neutro para os sais biliares não conjugados. Esta ph-dependência também influencia a precipitação dos mesmos. Ácidos biliares conjugados, quando precipitados, se tornam inofensivos em um ph inferior a 1,5. Os ácidos biliares não conjugados se precipitam em um ph abaixo de 3-4. A concentração epitelial dos ácidos biliares apresenta níveis cerca de oito vezes maiores que a concentração luminal, (60-61) provavelmente por ionizações intracelular e de membrana. (62-63) Em diferentes modelos animais, ácidos biliares demonstraram poder causar danos tóxicos ao epitélio, após algumas horas de exposição nas concentrações de 1-10 mmol/l (54,56,64) e após 5-8 dias à exposição a concentrações de 100-200 µmol/l. (65-66) Os mecanismos tóxicos não são totalmente conhecidos e várias teorias foram apresentadas. Em estudos animais, ficou demonstrado que a citotoxicidade é mediada através da disfunção mitocondrial com depleção de ATP, resultando no influxo de cálcio e morte celular. (66-69) Outra teoria é a de que a bile poderia causar danos celulares por sua propriedade detergente levando, assim, à ruptura das membranas celulares. Esse mecanismo é menos provável do que a ativa captação provocando, dessa forma, a ruptura da membrana celular que ocorre em concentrações mais baixas do que as necessárias para a formação de micelas ou perda de membrana estrutural. (70-71) A bile também induz à ciclooxigenase-2 e, assim, promove atividade inflamatória no esôfago. (72) 2.1.9 Manifestações clínicas e diagnóstico O primeiro passo para o diagnóstico adequado da DRGE é o conhecimento do conceito atual da afecção e de suas várias formas de apresentação clínica. As manifestações clínicas consideradas típicas da DRGE são pirose e regurgitação. Apesar desses sintomas sugerirem a presença da afecção, vale salientar que outras doenças (como úlcera péptica, gastrites e eventualmente neoplasias) podem cursar

Revisão da Literatura 12 com um deles. Contudo, quando tais queixas coexistem, a possibilidade de o paciente ter DRGE é superior a 90%. (73) Mais recentemente, reconheceu-se que outras manifestações clínicas podem ser decorrentes do RGE. Considera-se que dor torácica não-coronariana, sensação de globus faríngeo, manifestações extraesofágicas respiratórias (fundamentalmente tosse e asma brônquica), otorrinolaringológicas (basicamente disfonia e pigarro) e alterações motoras possam também ser decorrentes de RGE. A ausência de manifestações típicas do refluxo (pirose e regurgitação) não exclui o diagnóstico da DRGE. Pacientes com manifestações atípicas frequentemente não apresentam sintomas típicos do refluxo concomitantemente. (74) São cabíveis dois tipos de abordagem inicial em pacientes com DRGE: tratamento empírico (teste terapêutico) e tratamento baseado na confirmação diagnóstica da afecção por exames subsidiários. Na decisão sobre a abordagem a ser adotada, é importante considerar a idade e a presença ou não de manifestações de alarme. Recomenda-se confirmação diagnóstica em pacientes com idade superior a 40 anos, na presença de manifestações de alarme, tais como disfagia, odinofagia, anemia, hemorragia digestiva e emagrecimento, nos indivíduos com história familiar de câncer e naqueles com queixas de náuseas e vômitos e/ou sintomas de grande intensidade ou de ocorrência noturna. (75-77) No entanto, quando se depara com manifestações típicas em pacientes com menos de 40 anos de idade, sem manifestações de alarme, pode-se considerar a instituição do teste terapêutico. Nesses casos, é prescrito um inibidor da bomba protônica (IBP) em dose plena diária por quatro semanas, como conduta inicial. A resposta satisfatória, com remissão dos sintomas, sugere o diagnóstico da DRGE. Entretanto, a respeito do teste terapêutico, aconselha-se cautela, pois estudo baseado em revisão sistemática de literatura (78) conclui que: "o teste terapêutico com IBP, em pacientes com suspeita clínica de DRGE, não estabelece o diagnóstico confiável da afecção". Justificando tal afirmação, destaca-se que o RGE pode desencadear sintomas decorrentes da acidez do material refluído (ex: pirose). Contudo, pode também determinar sintomas que são mais dependentes da presença física do refluxo que da sua acidez propriamente dita (ex: regurgitação e muitas das

Revisão da Literatura 13 manifestações extraesofágicas). Os sintomas decorrentes da acidez do refluxo costumam melhorar com o uso de medicamentos antissecretores (os mais usados são os IBP). Porém, os sintomas decorrentes da presença física do refluxo (independentemente da sua acidez) não são adequadamente controlados por tais drogas. Portanto, havendo melhora da queixa clínica durante o teste terapêutico com IBP, sugere-se fortemente a participação do RGE. Caso contrário, não se pode descartar o diagnóstico da DRGE, pois há duas situações que podem justificar o insucesso do teste: 1) Os sintomas apresentados pelo paciente podem ser decorrentes de RNA, que não é adequadamente tratado pelos medicamentos antissecretores; 2) Os sintomas podem ser decorrentes de RAGE não adequadamente bloqueado pelo IBP em uso. (73) 2.1.10 Indicações e limitações dos principais métodos diagnósticos O melhor entendimento da fisiologia digestiva e do RGE evoluiu consideravelmente desde o século XVI. Durante esse período, vários métodos têm sido desenvolvidos engenhosamente para detectar o refluxo gástrico, alguns dos quais permanecem hoje o padrão-ouro. (79) Endoscopia digestiva alta Indicações: avalia a presença e o grau de esofagite (é considerado o melhor método para tal diagnóstico). Lembrar que existe esofagite endoscópica em cerca de 50% dos pacientes com DRGE, com predomínio de manifestações típicas (pirose e regurgitação) e em apenas 15% a 20% daqueles com predomínio de manifestações atípicas. Portanto, a ausência de esofagite ao estudo endoscópico não exclui o diagnóstico da DRGE; (80) caracteriza a presença de complicações da DRGE (esôfago de Barrett, estenose e ulcerações esofágicas);

Revisão da Literatura 14 evidencia afecções associadas (HH, úlceras pépticas gastroduodenais, neoplasias etc.) Limitações: Não avalia a presença do RGE e sim apenas eventuais conseqüências do mesmo. (80) phmetria esofágica prolongada Avalia a presença e a intensidade do RAGE; caracteriza o padrão de refluxo (ortostático, supino ou combinado) e relaciona a queixa clínica com o RAGE. (73) Indicações: identificação dos portadores da DRGE sem esofagite; caracterização do padrão de refluxo; estudo da participação do refluxo ácido nas manifestações atípicas do refluxo (nessa situação, recomenda-se phmetria com dois ou mais canais de registro: um posicionado no esôfago distal, para caracterizar RGE, outro posicionado no esfíncter superior do esôfago ou logo acima dele, para caracterização de refluxo supraesofágico ou também chamado de laringofaríngeo); estudo da recidiva dos sintomas no pós-operatório; avaliação da eficácia do tratamento clínico (nessa situação, também é recomendada a phmetria com dois ou mais canais de registro: um posicionado no estômago, para avaliar a eficiência da droga em uso na neutralização da acidez gástrica, outro no esôfago inferior para caracterizar RGE.

Revisão da Literatura 15 Limitações: Não avalia a presença de esofagite e nem de suas complicações e tampouco a ocorrência de RNA. A endoscopia digestiva alta e a phmetria esofágica prolongada são os dois métodos diretamente relacionados com o diagnóstico da DRGE. O primeiro identifica o sub-grupo da doença que cursa com esofagite; o segundo caracteriza o grupo com RGE patológico sem esofagite. A endoscopia propicia ainda a realização de coleta de material de biópsia para estudo histológico. Tal procedimento é de fundamental importância no estudo das complicações da doença. A seguir, são destacadas as indicações e limitações de outros métodos diagnósticos que podem ter utilidade na prática clínica. Estudo radiológico contrastado do esôfago Indicações: propicia boa avaliação morfológica do órgão e características do trânsito da substância de contraste; pode evidenciar complicações da DRGE (estenoses e ulcerações) e condições favorecedoras do refluxo (HH e ângulo esôfago-gástrico anormal). Limitações: Não identifica esofagite (apenas eventuais complicações desta) e não caracteriza adequadamente o RGE.

Revisão da Literatura 16 Manometria esofágica Avalia o tônus pressórico dos esfíncteres do esôfago e a atividade motora do corpo esofágico. (81) Indicações: fornece bom parâmetro preditivo de evolução da doença. Pacientes com hipotonia muito acentuada do EEI frequentemente necessitam de tratamento medicamentoso continuado, para controle adequado dos sintomas. Nesses casos, cogita-se mais precocemente a opção do tratamento cirúrgico do refluxo; diagnóstico de distúrbios motores específicos do esôfago, que podem alterar a orientação terapêutica (presença de acalásia, aperistalse e hipocontratilidades muito acentuadas); fornece bom parâmetro da atividade motora no pré-operatório de cirurgia antirrefluxo. Na presença de complicação disfágica, no pós-operatório de fundoplicatura, a avaliação manométrica do esôfago tem mais chance de poder auxiliar no esclarecimento da causa da disfagia nos pacientes submetidos à manometria pré-operatória (a manometria prévia fornece bom parâmetro referencial, aumentando a chance de esclarecimento diagnóstico da causa da disfagia); identificação da localização do EEI, para posicionamento adequado dos sensores de phmetria (para esse fim, não é necessário estudo manométrico completo do esôfago; realiza-se estudo sumário, apenas para identificação do EEI). (73) Limitações: Não avalia a real capacidade que o esôfago tem de transportar as substâncias ingeridas, ou seja, não há correlação entre achados manométricos e a progressão do bolo alimentar. (82)

Revisão da Literatura 17 Impedanciometria esofágica A impedanciometria intraluminar esofágica é um novo método que possibilita o acompanhamento do movimento anterógrado (transporte das substâncias ingeridas) e do movimento retrógrado (RGE) do conteúdo intraluminar esofágico. Contudo, ressaltase que a disponibilidade do método, na prática clínica assistencial, ainda é limitada. Quando associada à manometria esofágica, permite avaliar o transporte das substâncias ingeridas simultaneamente ao estudo da atividade pressórica intraluminar. Com isso, pode-se relacionar a atividade pressórica intraesofágica (avaliada pela manometria) com a real capacidade de transporte do esôfago (avaliada pela impedanciometria). Associando-se a impedanciometria com a phmetria (impedanciophmetria esofágica), pode-se avaliar o movimento retrógrado do material refluído, caracterizar sua natureza física (líquido, gasoso ou misto) e química (ácido, não-ácido e levemente ácido). Com isso, pode-se verificar se ocorre refluxo, se este é líquido, gasoso ou misto e se é ácido ou não-ácido. (83-84) Estudos recentes, em adultos e jovens, sugerem que a impedanciophmetria tem potencial para ser o novo padrão-ouro ao diagnóstico da DRGE. (85) Tutuian e Castell, (86) em revisão sobre o tema, afirmam que a presença e a ascensão proximal dos episódios de refluxo não-ácido, que ocorrem predominantemente no período pósprandial (quando a acidez gástrica pode estar tamponada pelos alimentos ingeridos) e durante o tratamento com drogas antissecretoras, podem agora ser adequadamente analisadas. A possibilidade de estudo da relação existente entre as manifestações sintomáticas do paciente e a presença de refluxo não-ácido podem ser de grande valor, sobretudo na avaliação dos sintomas em pacientes na vigência de drogas antissecretoras. A associação de ph e impedância também tem-se mostrado útil no auxílio à indicação cirúrgica de alguns casos. Torquati et al., (87) avaliando 13 pacientes com sintomas persistentes apesar do uso de IBP em dose dupla, observaram que 7 apresentavam sintomas relacionados com o refluxo: 1 deles com refluxo ácido e 6 com

Revisão da Literatura 18 RNA. Isso significa que a maioria (6/7) dos pacientes apresentava sintomas persistentes devido a RNA, ou seja, não detectados pela phmetria convencional. Dez pacientes foram submetidos à fundoplicatura e reavaliados, notando-se desaparecimento de sintomas e de refluxo. Isso indica que, diferentemente do tratamento com anti-secretores, o tratamento cirúrgico pode eliminar também o RNA. 2.2 Refluxo ácido O conceito de esofagite sendo causada por refluxo gástrico foi primeiramente descrito por Quincke, na última década do século XIX e elaborado por Winkelstein. (88) Até então, a esofagite era considerada como sendo causada por irritantes (mecânicos, térmico, químico), infecções, tais como a sífilis ou a tuberculose, ou como complicação de outras doenças, tais como cardiospasmo, divertículos ou neoplasias. O refluxo de ácido clorídrico é geralmente aceito como a principal causa da esofagite, mas não pode explicar todos os casos da DRGE. Dessa forma, a natureza e o volume do material refluído também representam fator importante na fisiopatologia da DRGE. 2.3 Refluxo duodenogástrico Refluxo do suco duodenal frequentemente ocorre após cirurgias envolvendo o piloro, mas também é visto em pacientes com o piloro intacto. Indivíduos saudáveis têm refluxo biliar para o estômago com mais frequência durante a postura supina do que na posição ereta (para uma média de 25% versus 4% do tempo) com uma grande variação individual. (89) O refluxo duodenogástrico (RDG) ocorre tardiamente na fase III do complexo migratório mioelétrico, a "vassoura" do duodeno. Metade dessas ondas pressóricas são retrógradas. (90) A bile é desviada para a vesícula biliar, durante esse período, e é vista no conteúdo gástrico refluído em apenas 17% dos indivíduos saudáveis. (91) O RDG é mais frequente após a colecistectomia (92-93) e estudos em cães, demonstram que o mecanismo para que isso ocorra, parece ser um aumento do

Revisão da Literatura 19 número de relaxamento do piloro. (94) Em estudo realizado por Fiorucci et al., (95) constatou-se que pacientes com DRGE apresentam RDG significativamente maior do que controles, 85 vs 59%. Além disso, as concentrações dos ácidos biliares intragástricas foram 6-8 vezes maiores em pacientes com DRGE do que em controles. Curiosamente, refluxo acima do EEI é visto durante o complexo migratório mioelétrico do estômago somente em pacientes com DRGE, (96) ligando a DRGE e o RDG ao complexo migratório mioelétrico, indicando talvez uma disfunção motora difusa em pacientes com RDGE. 2.4 Refluxo duodenogastroesofagiano Esofagite é vista em pacientes submetidos à gastrectomia subtotal e total, em que o refluxo ácido parece improvável e sendo resolvida após operações de derivação duodenal. (97-100) Além disso, a moderna terapia medicamentosa com drogas IBP, efetivas para abolir a secreção gástrica, cura apenas 87-89% dos pacientes com esofagite. (101) Também é sabido que 75-90% dos pacientes com ER têm ph normal em diversos estudos, indicando, novamente, existir outra explicação para as lesões esofagianas. (74,102) Existe interesse científico no assunto há várias décadas,desde o trabalho pioneiro feito por Ferguson et al., (103) antes de 1950, em gatos e cães, e nos trabalhos com primatas, realizado por Gillison et al. (104) em que ficou demonstrado que o suco duodenal causa graves danos ao esôfago. Refluxo do suco duodenal para o esôfago parece ser um fator importante no desenvolvimento da esofagite e suas complicações. Esta introdução dará uma breve panorâmica histórica e, em seguida, continuará com aspectos da DRGE e o papel do suco duodenal como causador de doença.

Revisão da Literatura 20 2.4.1 Histórico A bile tem sido considerada um fator importante na saúde e na doença desde tempos remotos. Na civilização do Tamil, 12.000 a.c., o antigo sistema de medicina Siddha era baseado em três humores corporais, constituído por Vatha, Pittha e Kapha (vento, bile e flegmão). Pittha correspondia ao calor e estava localizado no plexo solar, sendo representado pelo Sol. Esse vínculo entre a bile e o calor também pode ser visto na medicina hipocrática, originária 400 a.c., onde a teoria humoral nos fala dos quatro humores corporais; bile amarela, bile negra, flegmão e sangue. A bile amarela representava o elemento do fogo e residia no fígado, sendo associada ao mau-humor e a uma personalidade impulsiva. Em Aeschylus, " The Libation-bearersˮ, 458 a.c., Electra, no intuito de transmitir a todos a sua agonia, recita: " Acima do meu coração há uma onda de bile, e eu tenho os sintomas de uma pessoa perfurada por uma lança. Electra descreve o refluxo biliar para o esôfago causando esofagite e dor retroesternal, nos remetendo à medicina moderna. (105) A insatisfação com a ideia do refluxo gástrico como o único agente causador de erosões esofágicas foi levantada porque a esofagite era frequentemente vista após gastrectomias total e subtotal, quando se removia a porção gástrica produtora de ácido. O significado da bile na esofagite de refluxo foi claramente demonstrado, em primatas, por Gillison et al., (104) quando macacos Rhesus foram submetidos à cirurgia para desenvolverem refluxo de ácido e bile e de ácido isoladamente. Os macacos submetidos a refluxo biliar tinham esofagites mais graves.

Revisão da Literatura 21 2.4.2 Detecção de suco duodenal 2.4.2.1 Técnicas de aspiração Técnicas de aspiração são utilizadas e representam um método muito preciso para a análise dos componentes refluídos (106-109). No entanto, essa técnica necessita de recursos, sendo difícil ser executada por longo período de tempo. Amostras são recolhidas do conteúdo refluído, porém, picos de concentração podem ser perdidos. É de difícil realização em ambulatório e sua relação com a configuração fisiológica normal pode ser questionada. 2.4.2.2 Técnicas cintilográficas Esse método é prático, uma vez que envolve o mínimo desconforto para o paciente, mas apresenta vários inconvenientes. O uso do Tc99 HIDA é limitado por sua pouca sensibilidade para o refluxo esofágico e pela utilização de isótopos radioativos. Existe também o problema dos movimentos do paciente, sobreposição de órgãos e da natureza intermitente do refluxo biliar. (110) Essa técnica também é limitada pelo curto período de tempo da realização do exame. 2.4.2.3 Monitorização do ph Sendo o suco duodenal alcalino, pensou-se que o registro de refluxo alcalino no estômago e no esôfago poderia ser um bom marcador para o RDGE. Entretanto, esse não é o caso, já que pequenas quantidades de refluxo duodenal podem ser tamponadas em um meio ácido no estômago. De fato, foi demonstrado que a maioria das ocorrências de RDGE se dá em condições de ph normal ou ácido no esôfago. Uma situação alcalina, no esôfago, também pode ocorrer como resultado da presença de saliva alcalina e/ou pela presença de bicarbonatos oriundos de glândulas da submucosa esofagiana. (111)

Revisão da Literatura 22 2.4.2.4 Monitorização ambulatorial da bilirrubina Um sistema ambulatorial para detecção de bilirrubina foi validado em 1993 por Bechi et al. (112) Esse sistema consiste de uma sonda de fibra óptica que emite sinais luminosos no esôfago e os transporta de volta para um sistema eletrônico. A bilirrubina é detectada entre um espelho e a ponta do cabo de fibra óptica, por absorção da luz em 453 nm, em que a bilirrubina tem um pico de absorção (espectrofotometria). As informações são coletadas em um sistema portátil de aquisição de dados e posteriormente analisados em computador. Essa técnica permite a detecção ambulatorial de bile no esôfago, assim como a detecção do ph. Existem ainda algumas limitações. Alguns corantes alimentares interferem nas medições e pequenos pedaços de alimentos podem ficar presos entre o espelho e a ponta do cabo de fibra óptica. Em ph baixo, a bilirrubina forma dímeros com diferentes propriedades ópticas, provocando uma subestimação da concentração de bilirrubina em, pelo menos, 30%. (113) 2.5 Refluxo gastroesofagiano do suco duodenal Não há indicações de que os pacientes com RDGE possuam outro mecanismo de RGE que pacientes com DRGE. 2.6 Suco duodenal e esofagite É ainda controverso se o refluxo duodenogastroesofagiano apresenta relevância clínica. Kauer et al. (114) verificaram que pacientes com estágios mais avançados da doença do refluxo apresentam maior exposição à bile. Quase todos os pacientes com esôfago de Barrett (EB) tinham refluxo biliar, metade dos pacientes com esofagite erosiva tinham RDGE e que apenas alguns indivíduos normais apresentavam bile detectável no esôfago. Estudos de aspiração esofagiana encontraram níveis de ácidos

Revisão da Literatura 23 biliares em concentração suficiente para causar danos na mucosa de pacientes com esofagite. (106,109) 2.7 Doença do refluxo gastroesofagiano e desordens motoras A motilidade do trato gastrointestinal altera-se em situações de processos inflamatórios intestinais desde o esôfago, nas esofagites pépticas, até o intestino grosso, nas colites ulcerativas. Estudos experimentais demonstram claramente uma relação entre inflamação da mucosa e alterações sensório-motoras. (115) O processo de clareamento do ácido refluído para o esôfago, em indivíduos normais, se procede através de ondas secundárias de clareamento, sendo essas a chave principal de defesa esofagiana contra o refluxo, quando as barreiras gastroesofagianas falham. Pacientes com esofagite de refluxo apresentam anormalidades na motricidade esofagiana e tem-se debatido se essas anormalidades seriam primárias ou secundárias às lesões esofagianas induzidas pela exposição ao ácido ou álcali. 2.7.1 Conceituação A motilidade intestinal serve para vários propósitos, incluindo a passagem ordenada dos alimentos para os intestinos desde a orofaringe e esôfago, seu armazenamento e trituração no estômago antes de ser transferidos para o intestino delgado; passagem do alimento pelos intestinos em uma velocidade que permita sua digestão e absorção e pela passagem deste pelo intestino grosso, permitindo a formação de fezes. Esse rápido repertório de eventos motores é controlado por um sistema complexo que inclui mecanismos de regulação neural, miogênica e hormonal.

Revisão da Literatura 24 2.7.2 Causas e consequências de disfunções motoras Distúrbios da função motora produzem uma variedade grande de sintomas, incluindo dor torácica e disfagia no esôfago; plenitude, náuseas e vômitos no estômago e jejuno e constipação e diarréia no íleo e cólons. Esses sintomas podem aparecer na vigência de processos inflamatórios ou ativação imunológica em várias regiões dos intestinos, como nas esofagites, gastrites e doenças inflamatórias intestinais. Essas alterações sugerem que a motilidade intestinal está sujeita às influências do sistema imunológico. Nesse contexto, o sistema motor intestinal pode ter um importante papel na defesa intestinal contra estímulos nocivos presentes no lúmen intestinal. (115) 2.7.3 Estudos in vitro que demonstram alterações na função neuromotora intestinal após processos inflamatórios ou ativação imunológica Originalmente, suspeitou-se que alterações motoras intestinais produzissem espasmo muscular e, possivelmente, isquemia, podendo ser este, o fator etiológico no desenvolvimento de colite experimental em cachorros. (116) Porém, estudos subsequentes indicaram que inflamação altera a motilidade intestinal. Kern et al. (117) descreveram uma relação temporal entre as alterações da motilidade retossigmoideana e a presença de inflamação em pacientes com colite ulcerativa. No esôfago de gatos, com esofagite induzida por ácido, a indução de processo inflamatório produz uma redução na pressão do EEI, (118-119) assim como afeta a produção de trifosfato de inositol (120) e causa uma redução nas reservas de cálcio. (121) Em pacientes com ER, um considerável número de moléculas pró-inflamatórias, como citoquinas, quimioquinas e outros mediadores tem sido detectado em biópsias de mucosa esofagiana e, ocasionalmente, em tecidos esofagianos provenientes de ressecções cirúrgicas. Em gatos, Cao et al. (122) demonstraram que a esofagite, induzida por ácido experimentalmente, reduz significantemente a contração da túnica muscular circular lisa em resposta a estímulos elétricos, mas não afeta a contração induzida pela

Revisão da Literatura 25 acetilcolina e que uma série de mediadores químicos inflamatórios, como as interleucinas 1-beta (IL-1β), interleucinas 6 (IL-6), peróxido de hidrogênio (H2O2), fator de agregação plaquetária (FAP) e prostaglandina E2 (PGE2) estão presentes na túnica muscular. (122-123) Quando aplicados à musculatura circular lisa do gato, esses mediadores reproduziram as alterações motoras induzidas pela esofagite, inibindo a contração induzida por estímulos elétricos devido à inibição da liberação da acetilcolina, mas não inibindo a contração em resposta direta à aplicação desta. Cheng et al. (124) desenvolveram um modelo in vitro de esofagite, removendo o esôfago de espécies animais, separando a mucosa e submucosa da túnica muscular por meio de dissecção, fechava-se então a túnica mucosa, formando um saco revestido internamente com epitélio escamoso e externamente com submucosa. O saco era preenchido com solução ácida e após algumas horas o sobrenadante era aplicado à túnica muscular circular lisa ou usado para medição de mediadores inflamatórios. Recentemente, em esôfago humano que apresentava esofagite originária de doador de órgão, os autores evidenciaram que a estimulação da mucosa com ácido clorídrico (HCL) levou ao aumento dos níveis do FAP e da IL-6 na mucosa e que somente o FAP afetou a contração da túnica muscular. (125)

3 MÉTODOS 3.1 Método 3.1.1 Delineamento da pesquisa Estudo experimental agudo. 3.1.2 Projeto piloto Foi realizado com quatro cobaias. 3.1.3 Cálculo do tamanho da amostra a fórmula: n Onde: O dimensionamento das amostras, em nosso estudo, foi efetuado empregando-se 2. 2. z z d 2 2 2 1 2 d = Variância estimada das diferenças entre as médias (ante e depois); z 2 = Escore da distribuição normal associado ao erro tipo I (α); z 1 = Escore da distribuição normal associado ao poder do teste (1- β); = Diferença estimada entre as médias (antes e depois).

Método 27 3.1.4 Casuística A casuística constituiu-se de 18 (dezoito) cobaias albinas de 3 meses, do sexo masculino, pesando entre 200-250 g, que foram utilizadas para ensaios de contração, provenientes do Biotério Central da UNIFESP/EPM. As cobaias foram distribuídas aleatoriamente em três grupos de seis animais, assim denominados: Grupo A - Seis animais constituíram o grupo experimental Esôfago com mucosa Grupo B - Seis animais constituíram o grupo experimental Esôfago sem mucosa Grupo C - Seis animais constituíram o grupo controle 3.1.5 Comitê de Ética Foi solicitado parecer favorável do comitê de ética para pesquisa em animais da UNIFESP. (anexo 1) 3.1.6 Origem dos animais As cobaias, provenientes do Biotério Central da UNIFESP/EPM foram mantidas em jejum por 24 h antes de serem utilizadas. 3.1.7 Coleta do material As cobaias foram submetidas a traumatismo raquimedular e sacrificadas pelo esgorjamento.

Método 28 Os animais foram mantidos em uma prancha com angulação de 15 graus para se evitar aspiração. As cavidades torácica e abdominal das cobaias foram abertos com uma incisão mediana expondo o esôfago e estômago. (Figuras 3 e 4) O esôfago e o estômago foram retirados em conjunto e fixados em bloco de isopor, conforme sua orientação anatômica sendo, então aberto o estômago pela grande curvatura. Figura 3 - Exposição do tórax e abdômen de cobaia Figura 4 - Detalhe da transição esofagogástrica

Método 29 3.1.8 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no grupo A Após identificação da transição epitelial escamo-colunar, foi realizada a secção ao nível desta, desprezando-se a câmara gástrica. (Figura 5) Figura 5 - Espécime de esôfago Os espécimes de esôfago foram mantidos em solução oxigenada e salina fisiológica, em temperatura de 37 C. A solução era equilibrada com uma mistura gasosa contendo 95% de O2, 5% de CO2, numa temperatura de 37 C e ph de 7,4. Os espécimes de esôfago dos animais foram encaminhados para prova de avaliação contrátil. Para estudar as alterações funcionais dos tecidos musculares esofagianos, fragmentos de 3 cm de comprimento, obtidos do esôfago distal de cobaias, foram montados em câmaras de perfusão de órgão isolados (Figura 6). Uma das extremidades foi atada ao fundo da cuba de vidro e a outra a um transdutor isométrico de força, acoplado a um sistema de aquisição de dados com o programa KITCAD 8 (Soft & Solutions Ltda, São Paulo, Brasil). O volume do banho é de 5 ml o qual foi preenchido com a solução salina fisiológica, permanecendo a 37 C. O tecido foi mantido em constante aeração de ar ambiente com a tensão basal de estiramento de 1 g, esperando-se um período de 1 h para a estabilização após a montagem.

Método 30 Figura 6 - Espécime de esôfago em câmara de perfusão de órgão O registro isométrico da contração dos fragmentos foi obtido despolarizando-se com 40 mm KCl extracelular e medindo-se por meio de transdutores eletrônicos de força e enviados a um sistema computadorizado de aquisição e análise de dados. (Figura 7) Figura 7 - Sistema computadorizado de aquisição e análise de dados Para verificar a manutenção da contratilidade, os fragmentos foram estimulados com 40 mm de KCl sendo realizados cinco estímulos com intervalo de cinco minutos. (Figura 8)

Método 31 Figura 8 - Estímulo dos espécimes para avaliação da amplitude contrátil Após as medições iniciais, os fragmentos foram banhados com uma solução de cinco ml de ácido ursodesoxicólico a 100 µm (Figura 9) por 01 hora, sendo, então, novamente realizados cinco estímulos com 40 mm de KCl, em intervalos de cinco minutos, para registro contrátil. (Figura 10) Figura 9 - Espécimes de esôfago banhados com ácido ursodesoxicólico Figura 10 - Representação gráfica dos ensaios de contração

Método 32 3.1.9 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no Grupo B Após identificação da transição epitelial escamo-colunar, foi realizada a secção ao nível da mesma desprezando-se a câmara gástrica. Uma cuidadosa dissecção foi realizada a fim de se remover a mucosa e submucosa da túnica muscular. Para que isso pudesse ser feito, foi necessária a inversão do espécime esofagiano sobre o seu próprio eixo, utilizando-se um bastão metálico, como demonstrado nas figuras 11, 12, 13, 14 e 15. Figura 11 - Introdução do bastão metálico no esôfago Figura 12 - Inversão do esôfago sobre seu próprio eixo

Método 33 Figura 13 - Inversão do esôfago sobre seu próprio eixo com auxílio de pinça anatômica Figura 14 - Espécime esofagiano invertido com exposição da túnica mucosa Figura 15 - Cuidadosa dissecção com remoção da mucosa e submucosa

Método 34 A túnica muscular esofagiana foi mantida em solução oxigenada e salina fisiológica, em temperatura de 37 C. Os espécimes de túnica muscular dos animais foram encaminhados para prova de avaliação contrátil, como descrito no grupo A. 3.1.10 Preparo da musculatura esofagiana e mensuração da amplitude contrátil muscular no Grupo C Após identificação da transição epitelial escamo-colunar, foi realizada a secção ao nível da mesma desprezando-se a câmara gástrica. de 37 C. O esôfago foi mantido em solução oxigenada e salina fisiológica, em temperatura Os espécimes de esôfago dos animais foram encaminhados para prova de avaliação contrátil, como descrito nos grupos A e B. Após a verificação inicial da manutenção contrátil, os fragmentos, ao contrário dos grupos A e B, permaneceram banhados na solução salina fisiológica por 01 hora, sendo, então, novamente estimulados com 40 mm de KCl e realizados cinco estímulos com intervalo de cinco minutos para registro contrátil. 3.2 Materiais 3.2.1 Drogas e reagentes Utilizamos o cloreto de potássio (KCl) em uma concentração de 40 mm.