MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS

MONITORAMENTO TEÓRICO E PRÁTICO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS COORDENADORES: Profa. Dra. Dejanira Franceschi de Angelis Prof. Dr. Octávio Antonio Valsechi RIO CLARO 2006

MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS Profa. Dra. Maria Cecília F. Leite de Oliveira Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis OBJETIVO: Desenvolvimento de técnicas microbianas que possibilitem a identificação da presença de bactérias contaminantes e leveduras diferentes daquelas usualmente empregadas (Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum) na fermentação etanólica. 1. MEIO WLN 1.1. Preparo do meio WLN Plaqueamento Introdução sobre a finalidade: - o que é meio de cultura - característica principal dos meios verde de bromocresol - necessidade de antibiótico - o que permite avaliar: a) número total de células b) diferenças morfológicas entre colônias c) produção de ácido - possibilidade de tornar o meio parcialmente seletivo pela adição de actidiona - o que é actidiona - níveis de inibição sobre algumas leveduras 1.2. Preparo do meio 1.2.1. Composição do WLN-modificado (quantidade para 100mL): Glicose... 5,0000g KH 2 PO 4... 0,0550g (a) KCl... 0,0425g (b) CaCl 2.2H 2 O... 0,0125g (c) MgSO 4.7H 2 O... 0,0125g (d) FeCl 3.6H 2 O... 0,2500g (e) MnSO 4.4H 2 O... 0,2500g (f) Peptona de caseína...... 0,5000g Extrato de levedura... 0,4000g Ágar... 2,0000g Verde de bromocresol... 0,0022g (g) Ácido nalidíxico... 5,0000mg (h) Ampicilina... 5,0000mg (i) ph = 5,5 (HCl, 1 N)

Observação: os ingredientes a, b, c, d, e, f, g, h e i serão adicionados na forma de solução. a) Solução de KH 2 PO 4 5,5 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. b) Solução de KCl 4,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. c) Solução de CaCl 2.2H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. d) Solução de MgSO 4.7H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. e) Solução de FeCl 3.6H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. f) Solução de MnSO 4.4H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. g) Verde de bromocresol 220mg/ 100 ml. Dissolver em 5 ml de álcool e completar para 100 ml com água. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. 1.2.2. Procedimento a) Pesar a glicose em um becker. Coletar água em um becker (1/10 do volume total do meio, isto é, 10 ml) e acrescentar a glicose. Dissolver. Transferir para o tubo. Etiquetar glicose 5 g/ 10 ml para 100 ml de WLN. Esterilizar, após fechar com tampão e folha de alumínio. b) Coletar 83 ml de água destilada em um becker, acrescentar a peptona de caseína, extrato de levedura e as soluções. Dissolver em banho-maria, medir ph e ajustar com HCl 1N, se necessário. Acrescentar o ágar e voltar ao banho-maria. Após a dissolução, transferir para erlenmeyer de 250 ml e etiquetar WLN sem glicose. Fechar com tampão de algodão e folha de alumínio. Esterilizar 10 minutos a 1 atmosfera (121 o C). 1.2.3. Uso de antibiótico e preparação das soluções Para minimizar o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio WLN sofre a adição de antibióticos. Na rotina dos laboratórios III e IV do Departamento de Bioquímica e Microbiologia do Instituto de Biociências sa UNESP-Rio Claro, verificou-se a eficiência da combinação do antibiótico ácido nalidíxico com ampicilina. a) Preparo da solução de ácido nalidíxico (Solução h)

Triturar 1 comprimido de 500 mg de ácido nalidíxico farmacêutico em almofariz. Dissolver a solução de NaOH 0,05N completando o volume para 100 ml. Guardar em geladeira. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio de forma a obter 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). A solução de ácido nalidíxico é autoclavável, podendo ser acrescentado ao meio antes da esterilização. b) Preparo da solução do antibiótico ampicilina (Solução I): Triturar 1 comprimido de 500 mg de ampicilina (farmacêutica) num almofariz. Dissolver em água destilada, completando o volume para 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio, de forma a obter a concentração final de 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). Pode ser autoclavado. 2. MEIO WLN SEM BROMOCRESOL A preparação é idêntica à descrita em 1.2.1 e 1.2.2, exceto que não se acrescente o verde de bromocresol. 3. MEIO WLN COM ACTIDIONA O meio WLN pode sofrer a adição de actidiona a um nível suficiente para inibir o crescimento de leveduras de processo e permitir o desenvolvimento daquelas espécies presentes que tenham menor sensibilidade ao produto. Vale lembrar que algumas espécies de leveduras são insensíveis a 1000 ppm. A actidiona inibe Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum nas concentrações de 2,5 e 0,17 ppm. Por medida de segurança, trabalha-se com 5 ppm de actidiona. Preparação da solução de actidiona A actidiona deve ser manipulada com máxima cautela, com o objetivo de evitar sua ingestão ou contato com a pele. Solução estoque A: Pesar 0,2 g e dissolver em 1 ml de acetona. Juntar 9 ml de água e esterilizar por filtração em membrana millipore GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa solução terá a concentração de 20 mg/ ml. Guardar em geladeira.

Solução de trabalho B: Transferir 5 ml da solução A e adicionar 95 ml de água destilada estéril. A solução de trabalho terá a concentração de 1mg/ ml. Usar 0,5 ml para cada 100 ml de meio já esterilizado e fundido. Guardar em geladeira. 4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA Toma-se um volume medido da amostra (por exemplo, 10 ml). Centrifuga-se com assepsia, ressuspende-se em 9 ml de solução salina estéril. Após nova centrifugação, o sobrenadante é descartado e a massa celular é ressuspensa em salina de forma a se reconstituir o volume inicial da amostra. A suspensão sofrerá diluição em série até 10-7. O plaqueamento em meio WLN sem actidiona é feito em duplicata, nas diluições 10-5, 10-6 e 10-7. O plaqueamento nos demais meios é feito nas diluições 10-1, 10-2 e 10-3. Observação: a prática de cada laboratório indicará as melhores diluições. 5. PLAQUEAMENTO Plaquear em superfície 0,1 ml de suspensão de células por placa, espalhando com espátula de Drigalsky. Incubar em estufa a 28 o C e proceder às leituras de 2 a 5 dias. 6. MEIO DE LISINA 6.1.Introdução sobre a finalidade do uso - característica principal do meio de lisina - necessidade de antibiótico - o que permite avaliar 6.2. Preparo do meio 2.1. Composição do meio de lisina modificado (para 100 ml de meio) YCB (Yeast Carbon Base)...1,17 g Lisina...0,10 g

Ágar...2,00 g Ampicilina...5,00 g Ácido nalidíxico...5,00 g 6.2.1. Preparo do meio a) Preparo da solução YCB concentrada 10 vezes. Tomar 11,7 g de YCB e preparar 100 ml de solução concentrada 10 vezes, usando água morna. Esterilizar através de membrana millipore GSWP-04700 (0,22 micrômetros) e pré-filtro AP15-04700. Esta quantidade é suficiente para preparar 1000 ml de meio. b) Preparo do meio sólido Dissolver 2,0 g de ágar e 0,1 g (100 ml) de lisina em 88 ml de água destilada em banhomaria. Adicionar 1 ml de solução de ampicilina e 1 ml de solução de ácido nalidíxico preparados como nos itens 1.2.3.b. Autoclavar 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Após autoclavagem, adicionar assepticamente 10 ml da solução de YCB concentrada 10 vezes. 6.3. Preparo da amostra e plaqueamento Seguir instruções dos itens 4 e 5. 7. MEIO DE PRESERVAÇÃO DE LEVEDURAS 7.1.Meio Sólido de Sabouraud 4% - Peptona ou triptona...10 g - Glicose...40 g - Ágar...17 g - Água destilada...1000 ml Misturar os componentes e fundir em banho-maria. a seguir, distribuir em frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Observação: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose.

7.2.Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) - Glicose...20 g - Peptona...20 g - Extrato de levedura...10g ou 20 ml de hidrolisado de levedura - Ágar...15 a 17 g - Água destilada...1000 ml Misturar os componentes, fundir em banho-maria e a seguir, distribuir em frascos ou tubos. Esterilizar durante 10 minutos a 1 atm de pressão. 7.3.Extrato de malte 2% - Extrato de malte...20 g -Ágar...15 a 17 g -Água destilada...1000 ml Dissolver em banho-maria o extrato de malte e o ágar. A seguir distribuir em frascos ou tubos, tamponar e esterilizar durante 15 minutos a 1 atm de pressão (121 o ) Foto 1: Leveduras de dorna cultivada no meio WLN com verde de bromocresol onde verifica-se diferentes biotipos.

Foto 2: Leveduras selvagens cultivadas em meio WLN com verde de bromocresol e actidiona, onde verifica-se diferentes biotipos. CONTAGEM DIRETA E DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR EM LEVEDURAS Os métodos de contagem direta são simples e rápidos, exigem um mínimode equipamento e permitem que seja observada simultaneamente, a morfologia celular. No controle da viabilidade celular na fermentação alcoólica, a coloração das células com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. A porcentagem e o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteurs a mostra para a câmara de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1mm 2 de área; a lâmina é coberta com uma lamínula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm 3 ou 0,1 mm 3 (equivalente a 1 ml).

Figura 1. Câmara de Neubauer