1 Escopo MAPA/SDA/CGAL Página 1 de 11 Este MET tem por objetivo descrever o procedimento para execução do ensaio de índice de caseínomacropeptídeo (CMP) por método de cromatografia líquida de exclusão molecular (SEC). Este método é aplicado para todas as apresentações de leite fluido e leite em pó. 2 Fundamentos 2.1 Introdução O CMP é um fragmento da κ-caseína, liberado pela ação da enzima quimosina durante a coagulação enzimática do leite no processo de produção de queijos. A enzima hidrolisa a κ- caseína entre os aminoácidos fenilalanina e metionina, originando dois fragmentos: (1) um N- terminal denominado para-κ-caseína (aminoácidos 1-105) que permanece nas micelas da caseína na massa do queijo e (2) um segundo polipeptídio, hidrofílico, de 64 resíduos de aminoácidos, denominado caseinomacropeptídeo (aminoácidos 106-169) que permanece solúvel no soro. A detecção de CMP é indicativa de adição de soro de queijo no leite. A legislação brasileira estabelece que o leite (cru, pasteurizado, esterilizado e em pó) não pode conter sólidos de soro de queijo. Porém, em decorrência do seu baixo custo e por ser uma forma de aproveitamento desse resíduo da indústria queijeira, torna-se economicamente atrativa a adição de soro ao leite. Contudo, a presença de CMP não pode ser considerada indicação exclusiva de fraude com soro, pois a proteólise, por enzimas de bactérias psicotróficas, pode levar ao aparecimento de fragmentos similares ao CMP. Algumas proteinases liberadas por bactéria psicotróficas
Página 2 de 11 presentes no leite, principalmente as produzidas Pseudomonas fluorescens, são termo- resistentes e, dependendo da sua concentração inicial, podem hidrolisar a κ-caseína, e acarretar na liberação e surgimento de pequenas quantidades de CMP e de outros peptídeos com pesos moleculares semelhantes chamados de pseudo-cmp. As proteinases psicotróficas, apesar de serem menos específicas que a quimosina, hidrolisam a caseína na ligação 105-106, levando a formação do CMP, e também clivam as ligações 103-104, 104-105, 106-107 e 107-108. O principal pseudo-cmp difere do CMP por possuir um único aminoácido a menos (uma metionina no fragmento terminal do CMP, resíduo 106). A liberação do pseudo-cmp pode ocorrer naturalmente no leite, sendo que vários fatores, tais como tempo pós-ordenha e condições de transporte e armazenagem, interferem na sua produção. O ensaio pelo método de cromatografia líquida de exclusão molecular não permite a diferenciação do CMP presente por adição do soro daquele produzido pela ação das bactérias psicotróficas o pseudo-cmp. Desta forma, a quantificação é feita em relação ao índice de CMP (CMP e pseudo-cmp quantificados em conjunto). A validação do método foi realizada pelo laboratório de resíduos Pesticidas e medicamentos (RPM) e os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) definidos em procedimentos intralaboratoriais, bem como os valores de CCα e CCβ, que são medidas de estudo do erro analítico no nível do limite aceitável. Os limites aceitáveis de índice de CMP são estabelecidos pelo DIPOA. Estes limites são apresentados na tabela abaixo: Tabela 1 Valores de Limites Aceitáveis (LA), LD e LQ para CMP (aplicável ao método SEC) CMP LA (mg.l -1 ) 30 a 30-75 b a Adequado para consumo direto. CCα (mg L -1 ) CCβ (mg L -1 ) LD (mg L -1 ) LQ (mg L -1 ) 75 c 33,6 35,5 6,75 13,5 b Destinação para produção de derivados lácteos, a critério da autoridade responsável. c -Destinado à alimentação animal, à indústria química em geral ou a outro destino a ser avaliado tecnicamente, caso a caso, pelo DIPOA. De acordo com a legislação brasileira, amostras de leite que apresentarem concentração de CMP acima de 30 mg/l não podem ser destinados ao consumo direto, pois, ou apresentam
Página 3 de 11 adição de soro de queijo (leite fraudado) ou são de má qualidade devido a intensa atividade proteolítica no produto. 2.2 Fundamento do ensaio A primeira etapa do procedimento analítico consiste na separação do CMP de outras proteínas do leite por precipitação com ácido tricloroacético (TCA) 24%. A separação é baseada na diferença de solubilidade entre os peptídeos e as proteínas. O CMP e outros peptídeos menores permanecem em solução enquanto que as demais proteínas precipitam. A etapa posterior consiste na injeção do filtrado diretamente no sistema de HPLC. A cromatografia líquida de alta eficiência possibilita a separação do CMP dos demais peptídeos do leite, através do uso de coluna de exclusão molecular (gel filtração). A metodologia utiliza um sistema de bombeamento isocrático, sendo a fase móvel constituída de uma solução tampão fosfato, em ph 6,0. A coluna utilizada é a Zorbax GF-250, cujo princípio de separação baseia-se no tamanho das moléculas (ver figura 2). A detecção é feita por espectrofotometria no UV, no comprimento de onda de 205 nm, sendo os compostos quantificados por integração eletrônica das áreas dos picos (amostra e curva padrão). 3 Reagentes, padrões e materiais 3.1 Reagentes 1) Ácido tricloroacético (TCA); 2) Dihidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 ); 3) Hidrogenofosfato de potássio (K 2 HPO 4 );
Página 4 de 11 4) Leite cru (preferencialmente recém-ordenhado) ou leite ausente de CMP e pseudo-cmp (previamente analisado); 5) Sulfato de sódio anidro. 3.2 Padrões 1) Padrão de CMP (Davisco Foods ou similar). 3.3 Materiais 1) Barras magnéticas de 2,5-3,0 cm aproximadamente; 2) Bureta (preferencialmente de 25 ou 50 ml); 3) Copo de béquer de vidro ou plástico (ou frasco similar) de 50, 100 ou 150 ml; 4) Frascos de injetor automático com volume de 1,5-2,0 ml (vial); 5) Funil de vidro; 6) Papel de filtro qualitativo Whatman nº 4, nº 5 ou similar; 7) Proveta de 100 ml; 8) Membrana filtrante para solventes aquosos de 0,45 µm; 9) Sistema de filtração a vácuo; 10) Suporte para funis; 11) Tubos de ensaio de vidro ou plástico do tipo Falcon com capacidade de 15 ml e 50 ml ou similar. 4 Equipamentos 1) Agitador magnético; 2) Banho-maria; 3) Termômetro; 4) Banho de ultrassom (freqüência 40 khz); 5) Balança analítica; 6) Bomba de vácuo; 7) Coluna Zorbax GF 250, 9,4 mm de diâmetro de 250 mm de comprimento ou similar; 8) Homogeneizador tipo vórtex; 9) Micropipetas eletrônicas para a faixa de volume 100-1000 µl e 1000-5000 µl;
Página 5 de 11 10) Sistema de análise completa de HPLC com detector de UV ou arranjo de diodos capaz de operar em 205 nm. O volume do amostrador automático deve ser capaz de injeção entre 20-100 µl de amostra. 5 Precauções analíticas 1) O ácido tricloroacético é corrosivo e irritante da pele e mucosas; 2) Descartar o resíduo de TCA 24% em frasco apropriado, etiquetada como Classe de risco 8 Ácido tricloroacético. 6 Procedimentos 6.1 Preparo de soluções 6.1.1 Solução de ácido tricloroacético (TCA) 24% Pesar 240,0 g de TCA e diluir com água d/d para um volume de 1000 ml. Esta solução demonstrou ser bem estável e pode ser utilizada por até três semanas após o preparo, desde que armazenada sob refrigeração. 6.1.2 Solução-padrão estoque de CMP (1 mg.ml -1 ) Pesar 0,025 g de CMP e diluir em balão de 25 ml com água d/d com 5% de metanol grau HPLC. Esta solução é mantida refrigerada até o momento de uso, sendo estável por 1 mês nestas condições. Para uso imediato, o solvente pode ser água d/d. Concentração final da solução: 1 mg.ml -1. 6.1.3 Solução da fase móvel tampão ph 6,0 para SEC Para 1000 ml de fase móvel: dissolver 1,74g de hidrogenofosfato de potássio (K 2 HPO 4 - KPD), 12,37g de dihidrogenofosfato de potássio (KH 2 PO 4 - KPM) e 21,41 g de sulfato de sódio anidro (Na 2 SO 4 ) em aproximadamente 700 ml de água; ajustar o ph da solução em 6,0, usando solução de KPD 0,1 mol.l -1. Completar para 1000 ml com água deionizada e filtrar a solução em membrana para solventes aquosos de 0,45 µm.
6.1.4 Solução de K 2 HPO 4 (0,1 mol.l -1 ) - KPD Página 6 de 11 Dissolver 8,71g de K 2 HPO 4 em 500 ml de água deionizada. Esta solução é preparada no dia da análise. Pode também ser feita uma solução estoque concentrada (1,0 mol.l -1 ) com validade de três meses e efetuar a diluição no momento de uso. As soluções preparadas são registradas conforme POP POA/01 Controle de Soluções. 6.2 Preparo das amostras 6.2.1 Leite fluido 1) Amostra congelada: descongelar a amostra de leite até atingir a temperatura ambiente. Para tanto, descongelar as amostras em refrigerador no dia anterior da análise e deixar na temperatura ambiente antes do ensaio. Uma alternativa é utilizar banho de água à 30ºC. Homogeneizar agitando e invertendo o recipiente ou embalagem entre 5 e 6 vezes. 2) Se a amostra não estiver congelada, homogeneizar, agitando e invertendo o recipiente ou embalagem entre 5 e 6 vezes. 6.2.2 Leite em pó Pesar 10 g de leite em pó desnatado ou 13g de leite em pó integral, acrescentar 100 ml de água com auxilio de uma proveta e agitar até a completa dissolução. Para leite parcialmente desnatado ou semi-desnatado, verificar a forma de reconstituição de acordo com as instruções do fabricante. 6.3 Processamento das amostras A precipitação das amostras de leite fluido ou leite em pó reconstituído e das amostras de curva de calibração pode ser feita por qualquer um dos protocolos descritos a seguir: 6.3.1 Método de gotejamento 1) Pipetar 10 ml de leite para um copo de béquer ou frasco similar; 2) Colocar uma barra magnética no interior do béquer; 3) Adicionar, com auxílio de uma bureta, 5 ml de solução de TCA 24% de forma lenta e agitação constante; 4) Deixar em repouso por aproximadamente 60 minutos em temperatura ambiente;
Página 7 de 11 5) Filtrar por filtro de papel qualitativo e transferir em torno de 1,5 ml para frasco injetor (vial); 6) Injetar o filtrado diretamente no sistema de HPLC. 6.3.2 Método do ultrassom 1) Pipetar para tubo Falcon de 50 ml, 10 ml de leite; 2) Adicionar, com auxílio de um dispensador ou pipeta, 5,0 ml de solução de TCA 24%; 3) Colocar no banho de ultrassom por 20 minutos; 4) Filtrar usando papel qualitativo e transferir cerca de 1,5 ml para frasco injetor (vial); 5) Injetar o filtrado diretamente no sistema de HPLC. Os dados brutos obtidos durante o ensaio são registrados no formulário Dados Brutos da Análise de Índice de CMP anexo do POP POA/06 Controle de itens de ensaio: Ensaio Físicoquímico de Leite, Derivados Lácteos, Água e Mel. 6.4. Preparo da curva de calibração A curva é feita em matriz, isto é, alíquotas de amostra branca (leite cru recém-ordenhado ou leite fluido ou em pó previamente analisado ausente de CMP e pseudo-cmp) fortificadas com padrão de CMP 1 mg/ml. Preparar, no mínimo cinco pontos da curva que contemple, no mínimo, um ponto abaixo de 30 mg/l e um ponto acima de 75 mg/l. Também preparar um ponto sem adição de padrão que é utilizado como branco da curva. Um exemplo é apresentado na tabela 2. Tabela 2. Preparação da curva de calibração em matriz. Ponto Concentração Volume soluçãoestoque (µl) (ml) qsp 10 ml Volume amostra branca (µg.ml -1 ) 0 0 0 10.0 1 20 200 9.8 2 40 400 9.60 3 60 600 9.4 4 80 800 9.2 5 100 1000 9,0 6 120 1200 8,8
Página 8 de 11 Após a fortificação, agitar suavemente e deixar em repouso por aproximadamente 15 minutos. Proceder ao procedimento de precipitação conforme itens 6.3.1 ou 6.3.2. Nota: Realizar o mesmo procedimento de precipitação na amostra e na curva de calibração, isto é, se a amostra for feita pelo método de gotejamento a curva obrigatoriamente é feita usando a mesma metodologia. 6.4.1 Amostras brancas A curva de calibração do ensaio de índice de CMP é realizada em matriz. Todas as amostras utilizadas como matrizes da curva são analisadas previamente a fim de verificar o nível endógeno do índice de CMP. Só utilizar amostras com valor abaixo do limite de quantificação do método. 6.4.1.1 Registro e identificação As amostras são registradas no formulário do anexo A deste POP. Utilizar o seguinte procedimento para o registro: a) Matriz: especificar o tipo de amostra; b) Amostra de origem: especificar a origem da amostra. Se for analise proveniente de fiscalização, citar o nº de registro laboratorial; c) Data da análise e resultado preliminar do índice de CMP; d) Identificação do lote: refere-se ao número seqüencial da amostra branca no ano; e) Quantidade de frascos gerados pelo fracionamento do leite; f) Local de armazenamento; g) Identificação do frasco. 6.4.1.2 Identificação Os frascos contendo as amostras brancas recebem a seguinte identificação: sigla BR seguida pelo lote, ano, código do ensaio, nº seqüencial do frasco. As diferentes informações são separadas por barras. Exemplo: BR 03/ 13/ 045/ 01 SIGLA LOTE ANO ENSAIO UNIDADE DO LOTE
Página 9 de 11 6.5 Injeção no sistema HPLC Os dados da injeção podem variar dependendo da coluna, do sistema de HPLC, porém normalmente utiliza-se: a) Volume de injeção: 50 µl; b) Tempo de corrida: 20 minutos; c) Fluxo de injeção: 1mL por minuto. d) O tempo de retenção do CMP usualmente está situado entre 9,8 e 10,0 minutos. 7 Resultados 7.1 Cálculos Calcula-se a concentração dos analitos nas amostras utilizando a seguinte equação, obtida pela injeção dos padrões da curva y = ax + b onde: y = concentração em µg.ml -1 ; x = área do pico; a = inclinação da reta; b = intercepto y. Os cálculos gerados nos formulários de dados brutos são inseridos em planilhas eletrônicas de acordo com a IT POA/04. Notas: a) Se o cálculo da concentração das amostras originar resultados abaixo de 13,5 mg/l, o resultado é expresso como Resultado abaixo do limite de quantificação do método. b) Se o cálculo da concentração da amostra originar resultado acima da concentração do ponto mais alto da curva, o resultado é expresso como Resultado acima de mg/l. Em casos particulares, em que é necessário estabelecer o valor absoluto, como por exemplo, em ensaios interlaboratoriais, fazer uma diluição da amostra e repetir o ensaio. c) Após a conferência, o analista decide a necessidade de repetição do ensaio, conforme item 7.2
7.2 Critérios de aceitabilidade dos resultados Página 10 de 11 (1) O coeficiente de correlação (R 2 ) da curva de calibração em matriz deve ser maior ou igual a 0,92. Caso contrário, a curva é repetida. (2) Amostras com resultados entre 30-35 mg/l (muito próximos ao limite) são repetidos. Para a amostra de leite cru este critério não é utilizado porque dados experimentais demonstraram que a concentração de índice de CMP aumenta com o decorrer do tempo em virtude da produção endógena. 8 Arquivamento dos registros Não aplicável. Observação: os formulários utilizados neste método de ensaio são arquivados conforme procedimento descrito no POP POA/06 Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados Lácteos e IT POA/04 Uso de Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas Análises de Leite, Derivados Lácteos, Água e Mel. 9 Referências Não aplicável. 10 Anexos Anexo A MET POA/04/03 Formulário Registro de Amostras Brancas CMP. 11 Alterações Excluído da lista de materiais as pipetas graduadas de 5 e 10 ml. Incluído o banho-maria e termômetro na lista de equipamentos. Incluído o subitem 6.4.1 Amostras brancas e o anexo A do MET para o seu registro. Incluído a informação do fluxo da fase móvel usada no método de CMP no item 6.5 Injeção no sistema HPLC. Alterado o texto em várias partes para melhorar a compreensão, sem alterar tecnicamente os procedimentos.
Página 11 de 11 12 Responsabilidades O Responsável pelo POA é responsável por garantir: a elaboração, emissão, distribuição de cópias, análise crítica e revisão deste MET; o treinamento dos funcionários para utilização deste MET e pelo gerenciamento das nãoconformidades decorrentes. A UGQ é responsável pela verificação deste MET. A Responsável pelo POA é responsável pela aprovação técnica deste POP. Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação: Rita Beatriz Andrade - POA Tiago Charão - POA Eliana Menezes - UGQ Data: 05/09/2013 Data: 03/10/2013 Data: 13/02/2014