Determinação da seqüência de aminoácidos de cadeias polipeptídicas
Determinação da seqüência de aminoácidos de cadeias polipeptídicas 1ª Etapa: Determinação da composição em aminoácidos Hidrólise de todas as ligações peptídicas do polipeptídeo puro. A mistura obtida é analisada por cromatografia de troca iônica, para determinação dos aminoácidos presentes e das suas proporções relativas. 2ª Etapa: Identificação dos resíduos amino-terminal e carboxila-terminal. Resíduo Amino-terminal (utilizando 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno ou cloreto de dansil) 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno + peptídeo 2,4-dinitrofenil-peptídeo HCl 2,4-dinitrofenil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres NO2 2 F NO2 O resíduo de aminoácido N-terminal ligado ao 2,4-dinitrofenil é identificado por comparação cromatográfica com padrões de derivados dinitrofenilados dos diferentes aminoácidos. 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno
Cloreto de dansil + peptídeo dansil-peptídeo HCl dansil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres H 3 C CH 3 N O dansil-aminoácido é fortemente fluorescente. Pode ser detectado e dosado em concentrações muito menor que os dinitrofenil-aminoácidos. O S Cl O Cloreto de Dansil Resíduo Carboxila-terminal Utilizando a enzima carboxipeptidase que hidrolisa a ligação peptídica a partir da ponta carboxila-terminal da cadeia. Determinando qual aminoácido é liberado em primeiro lugar pela ação da carboxipeptidase, identifica-se o resíduo C-terminal no polipeptídeo.
3ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica (hidrólise seletiva) Tripsina - hidrolisa as ligações peptídicas das quais participa a carboxila de resíduos de arginina ou lisina. Um polipeptídeo com cinco resíduos de arginina e/ou lisina deverá produzir seis peptídeos menores. Com exceção de um, todos terão arginina ou lisina na posição C-terminal. Quimotripsina - hidrolisa as ligações peptídicas cujo grupo carboxila pertence a resíduos de fenilalanina, triptofano e tirosina. Mapa peptídico - Separação dos fragmentos produzidos por cromatografia de troca iônica em coluna, por eletroforese em papel ou por cromatografia em duas dimensões 2ª cromatografia origem 1ª eletroforese
4ª Etapa: Determinação da seqüência dos fragmentos peptídicos O método de degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo N-terminal de peptídeos, deixando intacta todas as outras ligações peptídicas. Após a remoção e identificação do resíduo N-terminal, o novo resíduo N-terminal exposto pode ser marcado e removido pela repetição da mesma reação. Desta maneira, resíduo a resíduo, a degradação de Edman pode elucidar a seqüência inteira de aminoácidos de um peptídeo. Fenilisotiocianato + peptídeo OH feniltiocarbamoil-peptídeo HCl feniltiohidantoína (derivado do resíduo N-terminal) + peptídeo original (sem o resíduo N-terminal)
O resíduo de aminoácido N-terminal na feniltiohidantoína é identificado por cromatografia. Seqüências contendo até 20 aminoácidos podem ser facilmente identificadas. Permanece, entretanto, o problema de determinar como esses fragmentos são arranjados na cadeia polipeptídica original.
5ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica por um segundo método Brometo de Cianogênio - quebra apenas as ligações peptídicas nas quais o grupo carboxila pertence ao resíduo metionina. Assim, se o polipeptídeo contem 8 resíduos de metionina, a quebra com o brometo de cianogênio deverá produzir nove fragmentos peptídicos. Os fragmentos são separados por eletroforese ou cromatografia Temos agora dois grupos de fragmentos peptídicos, um obtido pela ação da tripsina e outro pela quebra química com o brometo de cianogênio. 6ª Etapa: Ordenação dos fragmentos peptídicos através da determinação de superposições A superposição de porções dos peptídeos obtidos na 2ª fragmentação indica a ordem correta dos peptídeos obtidos na 1ª fragmentação. Às vezes a 2ª quebra falha em estabelecer superposições para dois ou mais peptídeos da 1ª quebra. Neste caso, uma terceira ou mesmo quarta quebra por métodos diferentes deve ser utilizada.
Arranjo dos peptídeos em sua ordem correta, pelas sobreposições Exemplo: Resultados obtidos utilizando hidrólises seletivas com tripsina e quimotripsina. Resíduos terminais: N-terminal = Ser C-terminal = Gli Fragmentos da 1ª quebra (c/ tripsina): Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Tyr-Cys-Arg Phe-Asp-Gli Leu-Ile-Lys Val-Lys Fragmentos da 2ª quebra (c/quimotripsina): Ser-Asn-Tre-Trp Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe Asp-Gli Arg-Val-Lys-Tyr 1º grupo de fragmentos Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Val-Lys Tyr-Cys-Arg Leu-Ile-Lys Phe-Asp-Gli 2º grupo de fragmentos Ser-Asn-Tre-Trp Arg-Val-Lys-Tyr Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe Seqüência deduzida Asp-Gli Ser-Asn-Tre-Trp-Arg-Val-Lys-Tyr-Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe-Asp-Gli
Especificidade de alguns métodos importantes de fragmentação seletiva de cadeias polipeptídicas Tratamento Tripsina Quimotripsina Pepsina Termolisina Broneto de Cianogênio Ponto de quebra Lisina, Arginina (extremidade C-terminal) Fenilalanina, Triptofano, Tirosina (extremidade C-terminal) Fenilalanina, Triptofano, Tirosina e outros (extremidade N-terminal) Leucina, isoleucina, valina (extremidade N-terminal) Metionina (extremidade C-terminal)