Semana de Prevenção contra o Cancro do colo do útero ECCA 2015 Detecção e Genotipagem do HPV Relevância no rastreio do Carcinoma do colo do útero Daniela Cochicho Laboratório de Virologia 1
HPV Agente Etiológico do Carcinoma do Colo 1974 Zur Hausen vai aos EUA: sugere que o HPV é um agente indutor do Carcinoma Colo Útero 1991 Produção das primeiras VLPs 2008 Primeiras vacinas Em 1980, zur Hausen verificou que: 1984 Propõe-se a fazer uma vacina: HPV 16 e 18 detectado em biópsias do colo, bem como em lesões pré cancerígenas. Oncogenes E6 e E7 imortalizavam células 1999 HPV é proposto como agente etiológico do carcinoma do colo do útero (estudos epidemiológicos) B. Kleter 70% das biópsias do colo tinham HPV 16 e 18; 2/3 das biópsias tinham o DNA integrado no genoma celular Genes virais E6 e E7 estavam activos Estes genes, quando transfectados, imortalizavam células 1996: a World Health Association associou o HPV 16 e 18 ao carcinoma do colo do útero; Bernard Kleter (1999) demonstrou que o HPV estava presente em 99.7% de todos os carcinomas do colo; Com os dados clínicos e epidemiológicos provou-se o efeito de causalidade, cumprindo o 3º Postulado de Koch O agente tem de estar sempre presente na lesão que provoca 2
Era Molecular Harald zur Hausen Alemanha 1936 HPV Prémio Nobel Medicina 2008 HPV: Agente etiológico do Carcinoma Colo do Útero
Diagnostico Clínico carcinoma do colo Tem como suporte inquestionável os exames citologicos (Papanicolaou) e histológicos que não detectam o agente viral mas apenas os seus efeitos citopatogenicos. Técnicas Células normais vs. Células neoplasicas Citologia _ exame Papanicolau 4
Detecção do HPV Detecção Directa do agente PCR Polimerase chain reaction- DNA L1; mrna E6; E7 p16 Técnicas BIOLOGIA MOLECULAR 5
Porquê detectar e genotipar o HPV? 6
HPV: Os diferentes genótipos Região L1: Homologia 90% - Tipo; 90% a 98% - Subtipo > 98% - Variante Actualização em 2005, o 8º relatório da comissão internacional de taxonomia dos vírus (ICTV) propôs a classificação de: 92 Genótipos de HPV 24 Genótipos de PVs animais In Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments. Bernard Hans-Ulrich. virology 401(2010)70-79. 7
Classificação Epidemiológica e Filogenética ALPHA-PAPILOMAVIRUS Classificação Filogenética Alto Risco Classificação Epidemiológica Alto Risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 82 26, 53, 66 Baixo Risco 73 Adaptado de Meijer C. J. et al NEJM, 348; 6, 2003 Baixo Risco 70 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81, CP6108 8
Porquê detectar e genotipar o HPV? CARCINOMA DO COLO Kaiser permanente health plan, 20.810 mulheres, monitorização durante um período 10 anos M.J.Khan, et al, GENOTIPOS de HPV Estimativa de risco para CIN 3+ (%) HPV negativo 0.8 HPV 16 17.2 HPV 18 13.6 HPV positivo (outros tipos) 3 Nos adenocarcinomas in situ existe uma grande dificuldade no resultado citológico (teste papanicolau) 9
HPV no cancro do colo 10
Diferentes tipos de HPV podem corresponder a diferentes tipos de lesão Laser capture microscopy (LCM) Wim Quint, dol diagnostic laboratory, voorburg, in HPV today nº23, 2011 Infecções Múltiplas podem estar relacionadas com lesões complexas, dados epidemiológicos experimentais evidenciam que cada genótipo de HPV pode produzir lesões independentes. 11
Detecção do HPV em laboratório 12
ESTRUTURA MOLECULAR O genoma É dividido em 3 regiões funcionais: Upstream regulatory region (URR) Early (E) Late (L) In Current understanding of the role of Brd4 Protein in Papillomavirus lifecycle. Viruses 2013, 5, 1374-1394. Alison A. McBride. 13
Como detectar? Vírus a DNA Cadeia dupla A região L1 é a mais conservada Detecção directa por técnicas de biologia molecular Genoma com 8kbp Primers consenso desenhados 14
Recolha da Amostra biológica Áreas de intervenção Natureza do produto Biópsias Meio de conservação Meio liquido ThinPrep Meio seco em Tubo estéril Esfregaço Meio liquido ThinPrep 15
Processamento de amostras Preparação da amostra Isolamento das células por meio de centrifugação Lavagem do pellet com soro fisiológico Lise Celular Tampão de lise Proteinase K (enzima) Duração O/N Extracção do DNA Kit comercial em sistema de colunas (membrana de sílica) Eluição em 50 ul de tampão Quantificação e pureza do DNA Leitura das absorvências nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, permite determinar a quantidade de DNA obtido do método de extracção e em que pureza se encontra. 16
Implementação de uma Metodologia in house PCR em tempo real qpcr COM SYBR GREEN na detecção do vírus do Papiloma Humano DNA Extraído Primers específicos 7900 Fast Applied Biosystems 17
Implementação de uma Metodologia in house PCR em tempo real Um método válido para a detecção de HPV em displasias e neoplasias Validação analítica Validação clínica Detecção de cerca de 40 tipos de HPV Cada tipo de HPV apresenta um limite de detecção Sensibilidade = Verdadeiros positivo / Verdadeiros positivos + falsos negativos Especificidade = Verdadeiros negativos / Verdadeiros negativos + falsos positivos Análise efectuada Software OpenEpi 18
Implementação de uma Metodologia in house PCR EM TEMPO REAL: VALIDAÇÃO ANALÍTICA Um método válido para a detecção de HPV em displasias e neoplasias Cada tipo de HPV apresenta um limite de detecção TIPOS DE HPV CONCENTRAÇÃO DETECTADA EM qpcr (IU/5 ul) 6 500 50 11 500 50 16 2500 500 50 25 5 18 500 50 5 31 500 50 33 500 50 35 500 50 39 50 45 500 50 51 500 50 52 500 50 56 500 50 58 500 50 59 500 50 66 500 50 68 500 50 19
Técnica de genotipagem do HPV Tecnologia Microarrays O kit Papillocheck utiliza uma metodologia em microarrays, tem a capacidade de identificar 24 genótipos de VPH: 15 genótipos de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 2 de provável alto risco (VPH 53 e 66) e 7 de baixo risco (VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44/55, 70). Tecnologia Inno-Lipa O Kit INNO-LIPA utiliza uma metodologia em LiRAS, tem a capacidade de detectar 28 genótipos diferentes de VPH: 15 de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82), 3 de provável alto risco (VPH 26, 53 e 66) e 7 de baixo risco (VPH 6, 11, 26, 40, 43, 44, 54 e 70). Os genótipos VPH 69, 71 e 74 detectados pelo kit não se encontram classificados. 20
Participação em PROGRAMAS DE RASTREIO 21
Sensibilidade para CIN2 (%) Sensibilidade 53.0% Sensibilidade 96.1% Valor clínico do teste de HPV DNA Citologia Teste HPV 100 80 60 40 20 0 Hart Tuebingen Hannover Jena French Seattle Canada Combined 1. Cuzick J, et al. Int J Cancer 2006; 119:1095 1101. 22 O teste de HPV DNA é indicado como primeira linha no rastreio Após 5 anos, mulheres com um teste de HPV Neg. tem um risco mais baixo de desenvolver CIN3+ (0.25%) do que mulheres com citologia negativa (0.83%) Joakim Dillner (HPV Today, Nº 21 Junho 2010).
Esquema das diferentes fases histológicas do desenvolvimento do carcinoma do colo 23
Resultado laboratorial Regredir Amostra Progredir Persistir 24
Algoritmo 25
População: estudo da prevalência USSC Bairro da Boavista USSC Bairro do Armador USSC Bairro Padre Cruz/Telheiras USSC Castelo USSC Dr. José Domingos Barreiro USSC Vale de Alcântara/Tapada 441total de mulheres avaliadas no programa de rastreio e indicadas para a detecção do HPV CENTROS desde 2007 DE SAÚDE a 2014 Mulheres provenientes de 6 centro de saúde da região centro sul de Portugal e com uma idade média de 42 (21-64) 26
Análise de resultados Colo útero: Casuística IPO Distribuição das amostras por resultado citologico/histologico Dados de 2009-2010 27
Incidência do numero total de doenças sexualmente transmissíveis: HPV é o vírus mais sexualmente transmissível 50% das infecções estão representadas nas idades mais jovens 28
Os rastreios organizados contribuem para o diagnostico precoce da patologia do colo As metodologias de detecçao do DNA do HPV contribuem para um melhor valor preditivo negativo, como teste de screening optimizar recursos económicos associados a esta patologia 29
It is the laboratory that has helped turn medicine from art into science Laboratório de Virologia do Instituto Português de Oncologia Daniela Cochicho Leonor Rebelo Luís Banha Luís Martins Margarida Figueiredo Mário Cunha Carmo Ornelas Margarida Silveira 30