Análise das discrepâncias entre resultados laboratoriais e clínicos

Transcrição

1 Análise das discrepâncias entre resultados laboratoriais e clínicos Daniela Cochicho Carmo Ornelas Responsável Laboratório Virologia IPO Lisboa

2 Sumário HPV com ciclo replicativo completo Lesões benignas Viriões. HPV como agente etiológico do carcinoma do colo. Forma epissomal e forma integrada. HPV como agente causal do carcinoma de células escamosas de cabeça pescoço

3 Motoo Kimura: Teoria da Evolução Molecular Neutra A nossa vida é construída sobre um edifício de aleatoriedade, ou seja, no interior das nossas células, fragmentos e pedaços de ácidos nucleícos e proteínas flutuam sem destino, esperando para interagir. Nós somos genoma, epigenoma, transcriptoma e proteinoma

4 O que são os vírus? A vírus is a piece of bad news wrapped up in protein Sir Peter Medawar Prémio Nobel

5 O que são os vírus? Quando lhe perguntaram o que era um vírus, respondeu com um truísmo: A virus is a virus André Lwoff: Prémio Nobel Medicina

6 O que são os vírus? Vírus são veículos de informação genética. Eles são uma Internet do nosso DNA. Parte do DNA humano é constituido por retrotransposões (HERV)

7 O que são os vírus? Os vírus são entidades que parasitam obrigatoriamente as células Não crescem Não se dividem id Apenas replicam Replicam mal em células quiescentes O seu único objectivo consiste em fazer cópias iguais a si próprio, para sobreviver Usamestratégias diferentes, aquando das infecções Quando infectam, raramente matam o hospedeiro A partícula viral com capacidade infectante chama se virião

8 Ciclo replicativo: vírus de DNA As mutações no genoma a DNA é entre 10-5 e Escape ao sistema imune: Latência Forma epissomal e integrada no genoma

9 Infecções virais i Infecções ocultas ouinaparentes (90%) Infecções agudas Lise celular Infecções latente Sem produção de viriões Infecções persistente Infecções crónicas Lise Sintomas Virémia acentuada Infecções progressivamente lentas Panencefalite Esclerosante Sub aguda: patologia provocada não por défice imunitário mas por replicação defeituosa no CNS produção anormal da proteína M Infecções Tumorogénicas Transformação celular EBV, HPV, HTLV I

10 Família Papillomaviridea i id (Villiers, 2004) MORFOLOGIA TROPISMO PATOGENIA GENOMA Sem envólucro (vírus nú) Altamente resistente aos compostos orgânicos Cerca de 52 55nm diâmetro Simetria icosaédrica 2 Proteínas cápside (72 capsómeros) L1 e L2 (50 e 70 KDa) Pele e mucosa (Só infectam a camada basal) epitéliotropicosp p Único Reservatório é o Homem Mais de 200 tipos de HPVs detectados 100 tipos isolados Cerca de 40 infectam o tracto anogenital Estes foram classificados em Alto e Baixo Risco (A.R. e B.R.), baseados nas relações filogenéticas e epidemiológicas; Causa verrugas da pele (mãos e plantares) e mucosa (orais, anogenitais displasias e cancro) Cadeiadupla dupla, Circular, DNA, com8kbp Genes estruturais L1 e L2 (formam a cápside) Genes Regulação: E1, E2 E4, E5, E6, E7 (expressão só na célula hospedeira) Região LCR Forma epissomal e Integrada (forma predominante nos carcinomas) Formação de viriões completos em células diferenciadas (sem virémia)

11 HPV: genoma HPV 18 3 Regiões: Early Proteínas de Regulação: E1: Proteína adenosinatrifostatadaque contribui para a manutenção da forma epissomal e está muitas vezes ausente quando o DNA viral se integra. Tem função de Helicase; E2: Reguladora de transcrição de E6 e E7 E4: Diferenciação terminal dos queratinócitos E5: Transformação e proliferação celular. Actua em EGF (Factor Crescimento Epidermóide) E6: Transformação celular. Interage com a p53. Favorece a actividade da p21; Transactiva o promotor do oncogene celular c myc; Induz aumento de expressão do Receptor do Factor de Crescimento Epidermal (EGFR); E7: Transformação celular. Interage com a prb; Late Proteínas estruturais (L1 e L2) LCR Região Reguladora com 900 pb, que inclui ia origem da replicação, ori, e os elementos amplificadores da transcrição (enhancers)

12 Infecção 1ª Fase: Camada basal, através de micro lesões do epitélio 50/100 cópias por célula; 2ª Fase: Sincronia com a divisão celular sob a forma epissomal; 3ª Fase: Proliferação celular, milhares de cópias, com produção de viriões nas células diferenciadas. A produção de viriões varia entre 3 e 18 meses;

13 Ciclo replicativo Ciclo Replicativo Completo Formação de Viriões Condilomas, ASCUS, LSIL Ciclo Replicativo Incompleto Forma epissomal, integrada Displasias + Cancro

14 Expressão de Genes de HPV EPITÉL LIO Escamoso Granular L1, L2 Virion assembly Camada Basal Adapted from 1. Zur Hausen. Nat Rev Cancer 2002;2: Tindle. Nat Rev Cancer 2002;2: Sanclemente and Gill. JEADV 2002;16:

15 Integração do DNA HPV: Progressão de neoplasia para carcinoma HPV DNA Epissomal L1 L2 LCR + E5 E6 E4 E7 E1 E2 Disrupção e ponto de integração DNA Hospedeiro DNA HPV Integrado DNA Hospedeiro E2 E4 E5 L2 L1 LCR E6 E7 E1 E2 Where E = Early; HPV = human PapillomaVirus; L = Late; LCR = Long Control Region; dotted yellow arrow = regulation. Adapted from 1. Phelps and Alexander. Ann Intern Med 1995;123: Syrjänen and Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; p

16 Modelo de carcinogénese: HPV e mucosa HPV na célula Efeito Expressão do gene E6 controlada por E2 Epissoma Após a integração E6 p53 AP Associação de E6 com p53 e AP A expressão do gene E6 não é mais controlada Actividade do p53 bloqueada Resistência stê à apoptose Aumento na instabilidade cromosómica Syrjänen and Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; p

17 Modelo de carcinogénese: HPV e mucosa HPV na célula Efeito A expressão do gene E7 controlada por E2 Epissoma Após a integração E7 + Livre prb E2F A expressão do gene E7 não é mais controlada Geração de múltiplos cromossomas Imortalização ota açãoceua celular Génese tumoral Syrjänen and Syrjänen. Papillomavirus a infections in human pathology. ogy Wiley & Sons, Chichester; p

18 Tipos de Infecção 3 Condições: Presença do Vírus HPV Alto Risco Infecção Persistente t Retirado de Thomas C. Wright et al,, NEJM, Volume 348: ,

19 Infecção/Lesão Bosch et al. J Clin Pathol 2001;54: Lesões Benignas Infecção exclusivamente intraepitelial Não causa virémia Não há infecção sistémica Não há lise celular Formação de viriões em células altamente diferenciadas Lesões Pré Malignas e Malignas Supra expressão dos oncogenes E6 e E7 Integração do genoma viral no genoma celular Interacção das oncoproteínas E6 e E7 com os genes supressores de tumores p53 e prb

20 Cofactores Nº de Parceiros Fumo HLA DQ-WR Acção nas ciclinas (ciclina D1 está sobreexpressa nas lesões baixo grau -> inactiva prb Actividade telomerase induzida pela proteína E6 Hormonas esteróides regulam a actividade id d de telomerase Telomerase inactiva genes supressores de tumor Indução oncogene celular c-myc, apesar da não integração monoclonal Factores angiogénese 20

21 Classificação filogenética Família Papillomaviridae Estão divididosidid em 16 géneros, 5 dos quais associados aos Humanos (mucosa e cutâneos). E. Villiers Alfa: E6/E7 actuam sobre genes supressores de tumor (p53 e prb) Beta e Gama: degradação do BAK (retardação da reparação do DNA danificado por radiação UV)

22 Classificação Epidemiológica ALPHA-PAPILOMAVIRUS Classificação Filogenética Classificação Epidemiológica Alto Risco Baixo Risco Alto Risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 70 68, 82 26, 53, 66 Baixo Risco 73 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81, CP6108 Carcinom a Colo: 70% Verrugas genitais: 90% Adaptado de Meijer C. J. et al NEJM, 348; 6,

23 HPV: os diferentes tipos Região L1: Homologia 90% - Tipo; 90% a 98% - Subtipo > 98% - Variante Cerca de 200 HPVs detectados; 100 isolados e sequenciados; Cerca de 40 infectam o trato anogenital Estes foram classificados em Alto e Baixo Risco (A.R. e B.R.), baseados nas relações filogenéticas e epidemiológicas;

24 HPV: vírus oncogénicos Retirado de zur Hausen (2006)

25 HPV: vírus oncogénicos Retirado de zur Hausen (Infections causing Human Cancer, 2006)

26 HPV no cancro do colo Classificação citologia / histologia Classificação Bethesda Negativa Citologia Sistema CIN Histologia Normal ASCUS (Atypical Squamous Cells Undeterminate Significance) ASC-US ASC-H (sem exclusão de Lesão Alto Grau -HSIL) AGUS L-SIL L-SIL CIN I H-SIL H-SIL CIN II/ III Carcinoma Carcinoma Carcinoma Invasivo células epiteliais Adenocarcinoma

27 Prevalência HPV citologia normal Mundo África América Norte Europa Prevalência HPV Prevalência Prevalência Tipo HPV Tipo HPV Tipo HPV Tipo HPV % HPV % HPV % Prevalência HPV % Todos 10,4 Todos 22,1 Todos 11,3 Todos 8,1 16 2,6 16 2,7 16 3,5 16 2,3 18 0,9 52 1,8 53 1,1 18 0,7 35 0,9 18 1, ,6 52 0,6 58 1, ,4 51 0,6 31 1,3 39 0,9 58 0,3 31 0,5 35 1,2 51 0,8 45 0,3 56 0,5 42 1,1 45 0,8 51 0,3 33 0,4 66 1,1 31 0,8 66 0,3 45 0,4 53 1,1 58 0,6 6 0,3 53 0,4 45 1,1 56 0,5 39 0, , , , ,2 35 0, ,5 35 0,2 66 0,4 51 0,9 84 0,4 56 0,2 70 0,3 54 0,9 59 0,4 52 0,2 59 0,3 83 0,8 73 0,4 59 0,2 42 0,3 81 0,7 54 0,4 54 0,2 6 0,3 39 0,7 83 0,3 73 0,1 68 0,3 68 0,5 33 0,3 11 0,1 62 0,3 70 0,5 42 0,3 53 0,

28 Prevalência HPV HSIL Mundo África América Norte Europa Tipo HPV Prevalência HPV Prevalência HPV Prevalência HPV Prevalência HPV Tipo HPV Tipo HPV Tipo HPV % % % % Todos 84,9 Todos 85,1 Todos 85.0 Todos , , ,8 31 8, ,1 6 9, ,3 31 7,4 18 9,6 33 8, ,4 31 9, ,9 52 6,8 58 6,7 52 3,6 52 5,1 58 6,1 35 6,4 73 3,5 35 3,8 66 5,3 33 5,5 35 3,4 51 3,6 70 5,1 56 5, ,9 6 3, ,9 45 2, ,8 56 2, , , ,2 39 2,1 56 2,8 45 2,9 39 2,2 66 1,9 68 2,4 39 2,7 66 1,5 73 1,8 51 2,2 59 2, ,1 11 1,3 11 1,7 68 1, ,3 45 1,4 11 1,3 68 0,8 82 1,2 39 0,7 82 1,3 59 0, , ,4 59 0, ,

29 Prevalência HPV carcinoma INVASIVO Mundo África América Norte Europa Tipo HPV Prevalência HPV Prevalência Prevalência HPV Prevalência HPV Tipo HPV Tipo HPV Tipo HPV % HPV % % % Todos 87,2 Todos 93,9 Todos 86,8 Todos 85, , , , , , , ,9 33 4,3 33 7,6 31 3,7 58 5,6 45 3,7 45 6,6 33 3,5 33 3,9 31 3,5 35 2,9 45 3,3 52 3,8 58 3,3 31 2,7 6 1,1 45 2, , , ,2 35 1,7 52 1,2 35 0,4 35 1, ,1 58 0,3 59 1,5 51 0,7 51 0,9 73 0,3 51 0,9 56 0,7 73 0,9 56 0,2 56 0,7 39 0,6 66 0,9 39 0,2 68 0,7 6 0,5 59 0,8 68 0,2 39 0,5 68 0,5 39 0,8 59 0,1 6 0,5 73 0,5 68 0,7 66 0,1 11 0,4 66 0,3 6 0, ,3 11 0,2 82 0, , , ,2 82 0, ,

30 Prevalência do tipo de HPV em vários tipos de lesão cervical 1. Bosch FX et al. Vaccine 2008; 26S: K1 K

31 Incidência i Para além do cancro do colo do útero o HPV causa outros cancros e doenças genitais em ambos os sexos Em 2009, em Portugal, os custos de diagnóstico e tratamento de CONDILOMAS GENITAIS (7,6M ) foram superiores aos custos de CANCRO DO COLO DO ÚTERO (6,7M )

32 HPV na cavidade oral Oncologia oral HPV como vírus oncogénico HPV como agente causal

33 HPV na cavidade oral Os vírus da cavidade oral são importantes agentes ulcerogénicos e tumorogénicos Cerca de 15 20% de todos os cancros têm origem viral Umas vezes actuam como Cofactores Outras como Bystanders O tipo de infecção/doença Depende do status imunitário de cada individuo

34 HPV na cavidade oral Vírus Tumores associados Úlceras mucosaoral oral Carcinoma células escamosas da cabeça e pescoço HPV16 HPV Carcinoma da amígdala Doença de Heck (Hiperplasia focal provocada pelo HPV 13) Úlceras orais não especificadas (HPV18) A maior parte das infecções a HPV são transitórias, Doença Heck: HPV 13 Raramente provocam cancro

35 HPV na cavidade oral O HPV como vírus oncogénico Nos carcinomas de células escamosas de cabeça pescoço temos duas realidades distintas: t Tumores HPV (+) Tumores HPV ( ) Com incidência máxima nas amígdalas

36 Modelo de carcinogénese: O HPV como vírus oncogénico HPV ( ) Instabilidade genómica (álcool, tabaco e higiene oral), originando: aneuploidia, mutações na p53 e na p16 HPV (+) Supraexpressão E6 e E7 que interagem com os genes supressores de tumor (p53 e prb) Roberto Haddad, NEJM, 359, 11,

37 O HPV como Vírus oncogénico Tina Dalianis Karolinska Institute Na Suécia, o carcinoma das amígdalas é o mais comum dos carcinomas da orofaringe O grande aumento é na Europa do norte e central. Ao longo da última década houve uma aumento de 2.6% por ano. Em homens brancos com idade d inferior i a 50 anos sem hitoria i de consumo de tabaco ou de alcóol. l In BMC Cancer 2012, 12:30 Estimation of the epidemiological burden of human papillomavirus-related cancers and non-malignant diseases in men in Europe: a review

38 HPV como agente etiológico HPV como agente causal No carcinoma do colo do útero o HPV é o agente etiológico. Bernard dkleter 99.7% (cumpre um dos postulados de Koch e os critérios de causação de Evans) Nos carcinomas de cabeça e pescoço os dados epidemiológicos e laboratoriais i evidenciam i que HPV é agente causal. Postulados de Koch: Tem de estar sempre presente na lesão O isolado tem de crescer em cultura pura Tem de reproduzir a doença a partir do isolado, num hospedeiro susceptível

39 Alfred S. Evans Revisitou os critérios i de Hill s in Historia da virologia ICTV pg

40 Sir Bradford Hill Uma correspondência c unívoca entre um factor especifico e doença

41 Robert Joseph Huebner Determinar o agente causal de doença não é fácil. Pode mesmo levantar grandes dilemas ao virologista. A primeira epidemia no sec XXI que foi o S.A.R.S (severe acute respiratory sindrome) foi rapidamente identificado o agente causal, um coronavírus e não um influenza, isto deveu-se à eficiência dos laboratórios e a importancia da biologia molecular e sequenciação de agentes isolados. THE VIROLOGIST'S DILEMMA

42 Comparação entre agente etiológico i e agente causal 1974 Zur Hausen vai aos EUA: sugere que o HPV é um agente indutor do Carcinoma Colo Útero Produção das primeiras VLPs Primeiras vacinas 1983 Syrjanen: Morphological and immunohistochemical evidence suggesting humam papilomavirus (HPV) involvement in oral squamous cell carcinogenesis. In Int J Oral surg Localimmunologicalreactivity in oralsquamouscell lesions of possible HPV (human papillomavirus) origin. In Arch Geschwulstforsch. 1983;53(6): Propõe se a fazer uma vacina: HPV 16 e 18 detectado em HPV é proposto como biópsias do colo, bem como em agente etiológico do lesões pré cancerígenas. carcinoma do colo do Oncogenes E6 e E7 imortalizavam útero (estudos células epidemiológicos) B. Kleter 2012 National comprehensive Cancer network (NCCN) Guidelines version updates head and neck cancers. Detecção HPV sugerida para recomendada IARC HPV como Agente causal suficiente na carcinogenese da cavidade oral, orofaringe e amígdala. 42

43 HPV na cavidade oral Cancer epidemiology, Biomarkers & Prevention, 14 (2005) IARC IARC: International Agency for Research on Cancer

44 HPV na cavidade oral In BMC Cancer 2012, 12:30 Estimation of the epidemiological burden of human papillomavirus related cancers and non malignant diseases in men in Europe: a review

45 HPV na cavidade oral In BMCC Cancer 2012, 12:30 Estimation i i of the epidemiological i i lburden of human papillomavirus related i l cancers and non malignant diseases in men in Europe: a review

46 HPV na cavidade oral

47 HPV na cavidade oral Dados ROR sul Topografia Taxa bruta Taxa padrao europa Taxa padrao mundial amigdala 0,72 0,67 0,50 Lingua 2,78 2,35 1,72 Língua dos anos Amígdala dos anos Taxa de incidência - região sul de Portugal Editado por registo oncológico regional sul (ROR-sul)

48 homens Topografia Taxa bruta Taxa padrão Europa HPV na cavidade oral Taxa padrão mundial Taxa bruta Dados ROR sul mulheres Taxa padrão Europa Taxa padrão mundial amigdala 1,06 1,05 0,00 0,04 0,04 0,03 Lingua 4,54 4,09 3,02 1,14 0,83 0,57 Taxa de incidência - região sul de Portugal Editado por registo oncológico regional sul (ROR-sul)

49 Detecção do HPV em laboratório e Análise de resultados Daniela Cochicho Carmo Ornelas Responsável Laboratório Virologia IPO Lisboa

50 Porquê detectar o HPV? o As boas práticas clínicas requerem a identificação dos agentes etiológicos; O HPV é o agente etiológico do Carcinoma do Colo do Útero; Porque tem um elevado Valor Predictivo Negativo (cerca de 99%); Após 5 anos, mulheres com um teste de HPV Neg. tem um risco mais baixo de desenvolver CIN3+ (0.25%) do que mulheres com citologia negativa (0.83%) Joakim Dillner (HPV Today, Nº 21 Junho 2010). Mulheres com: HPV Negativo Citologia Negativa Parceiro certo Não tem Carcinoma do Colo do Útero

51 Porquê detectar e genotipar o HPV? Kaiser permanente health plan, mulheres, monitorização durante um período 10 anos M.J.Khan, et al, TIPOS de HPV Estimativa de risco (%) para CIN 3+ HPV negativo 0.8 HPV HPV HPV positivo (outros tipos)

52 Porquê detectar e genotipar o HPV? National comprehensive Cancer network (NCCN) Guidelines version updates head and neck cancers

53 Porquê detectar e genotipar o HPV? Tumor primário Oculto National comprehensive Cancer network (NCCN) Guidelines version updates head and neck cancers

54 As 3 eras: História Má sorte Má fortuna Em 1842, Rigoni Stern publicou artigo sobre nº de mortes de cancro na cidade de Verona, entre 1760 e 1839; Neste documento notável ele chamou a atenção para as mortes por cancro do útero ser raro entre Era Papanicolaou O diagnóstico do carcinoma do colo do útero tem tido como suporte inquestionável os exames citológicos (Papanicolaou) e histológicos que não detectam o agente viral mas apenas os seus efeitos citopatogénicos. virgens e freiras e frequente entre casadas e viúvas; Doença transmitida sexualmente

55 As 3 eras: História ERA Molecular : HPV Agente Etiológico do Carcinoma do Colo Em 1980, zur Hausen verificou que: 70% das biópsias do colo tinham HPV 16 e 18; 2/3 das biópsias tinham o DNA integrado no genoma celular Genes virais E6 e E7 estavam activos Estes genes, quando transfectados, imortalizavam células 1996: a World Health Association associou o HPV 16 e 18 ao carcinoma do colo do útero; Bernard Kleter (1998) demonstrou que o HPV estava presente em 99.7% de todos os carcinomas do colo; Com os dados clínicos e epidemiológicos provou se o efeito de causalidade, cumprindo o 3º Postulado de Koch O agente tem de estar sempre presente na lesão que provoca

56 Como detectar? As culturas celulares onde replicam os HPVs são as raft cultures : HPV infectam a camada basal do epitélio; Só formam viriões completos em células diferenciadas da pele e mucosa; Raft Cultures : Recriam in vitro o processo de diferenciação morfológica e fisiológica das células epiteliais; Células crescem numa matriz de colagéneo mantida num suporte sólido; Laboratorialmente, os HPVs detectam-se por técnicas de Biologia Molecular Detecção de DNA Viral a partir de células ou biópsias; Recriam in vitro o processo de diferenciação morfológica e fisiológica das células epiteliais; Células crescem numa matriz de colagéneo mantida num suporte sólido;

57 Vírus a DNA Cadeia dupla Genoma com 8kbp A região L1 é a mais conservada Como detectar?

58 Métodos de Detecção Microscopia electrónica Só permite a visualização das partículas virais. Desde do Ernst Ruska (Nobel 1986) que descobre o microscópio electrónico, na década de 30. Técnicas de Biologia i Molecular l Captura Híbrida (quimioluminescência) Amplificação sinal/sem genotipagem Sensibilidade: 1 pg DNA viral (5000 cópias/ml) P.C.R. (polimerase chain reaction): P.C.R. em Tempo Real Detecção Transcritos E6/E7 (mrna) Amplificação DNA detecção em gel de agarose Amplificação DNA detecção em SYBR Green/ Sonda TaqMan Amplificação cdna detecção em NASBA e citometria de fluxo Sensibilidade: 0.5 a 10 pg (10 a 200 cópias/ml) Sensibilidade: Sensibilidade: Microarrays Amplificação DNA detecção em Sensibilidade: microarray Inno LIPA Amplificação DNA 65pb L1 detecção em LiRAs Sensibilidade:

59 Detecção do Vírus: Captura Híbrida A.R.: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 B.R.: 6, 11, 42, 43, 44 Detecção sem genotipagem Está validado clinicamente

60 Actividade viral: detecção de transcritos (mrna) NASBA: Nucleic Acid Sequence Based Amplification

61 Actividade Viral: citometria de fluxo HPV today nº26 (2012)

62 Kary Mullis, prémio Nobel 1993 Detecção do DNA: Técnica de PCR clássico

63 Detecção do DNA: PCR em tempo real Amplificação e detecção do produto especifico é realizada numúnico sistema. A quantidade de produto de PCR é medido em cada ciclo de amplificação e durante a fase exponencial. O aumento do sinal de fluorescência é directamente proporcional ao número de moléculas de produto amplificado (amplicon) formadas na fase exponencial do PCR

64 Visualização em gel de agarose com RFLP s Detecção DNA: Métodos de genotipagem Enzimas de restrição tesouras da biologia molecular

65 Tecnologia Inno Lipa O Kit INNO LIPA utiliza uma metodologia em LiRAS, tem a capacidade de detectar 28 genótipos diferentes de VPH: 15de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82), 3 de provável alto risco (VPH 26, 53 e 66) e 7debaixo risco (VPH 6, 11, 26, 40, 43, 44, 54 e 70). Os genótipos VPH 69, 71 e 74 dt detectados td pelo kit não se encontram classificados. Tecnologia Microarrays Detecção DNA: Métodos de genotipagem O kit Papillocheck utiliza uma metodologia em microarrays, tem a capacidade de identificar 24 genótipos de VPH: 15 genótipos de alto risco (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 2 de provavel alto risco (VPH 53 e 66) e 7 de baixo risco (VPH 6, 11, 40, 42, 43, 44/55, 70)

66 A detecção do HPV no Laboratório de Virologia Controlo qualidade Resultados fiáveis exigem controlo de qualidade apertado O sucesso de um resultado depende: Qualidade na recolha da amostra Da rentabilidade da extracção (quantificação e pureza do DNA Nanodrop) Validação ld Analítica e Clínica do teste utilizado

67 Implementação de uma Metodologia in house Um método válido para a detecção de HPV em displasias e neoplasias PCR em tempo real: validação analítica Detecção de cerca de 40 tipos de HPV TIPOS DE HPV CONCENTRAÇÃO DETECTADA EM qpcr (IU/5 ul) Cada tipo de HPV apresenta um limite de detecção

68 Controlo de qualidade interno Controlo positivo Células: As células Caski, SiHa e HeLa infectadas com ADN de HPV 16 Controlo interno Células CaSki/Siha/HeLa Amplificação do gene da albumina Controlo de extracção Branco de extracção Controlo Negativo Água bidestilada e HPV 18 mantidas em cultura no laboratório e armazenadas em alíquotas de células e células respectivamente, previamente contadas com a câmara de NeuBauer. A quantidade de DNA numa célula diplóide é cerca de 6pg. Se uma célula CaSki contem cerca de 600 GE HPV16, então, 1pg DNA CaSki 100 GE HPV

69 Processamento de amostras Preparação da amostra Isolamento das células l por meio de centrifugação tif Lavagem do pellet com soro fisiológico Lise Celular Tampão de lise Proteinase K (enzima) Duração O/N Extracção do DNA Kit comercial em sistema de colunas (membrana de sílica) Eluição em 50 ul de tampão Quantificação e pureza do DNA Leitura das absorvências nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, permite determinar a quantidade de DNA obtido do método de extracção e em que pureza se encontra

70 qpcr COM SYBR GREEN na detecção do vírus do Papiloma Humano DNA Extraído Primers específicos 7900 fast Aplied Biosystems

71 qpcr COM SYBR GREEN Análise do resultado Curva de amplificação Análise da temperatura de dissociação

72 Emissão do Resultado Descrição DETECTADO NÃO DETECTADO INIBIDO AMOSTRA INSUFICIENTE INCONCLUSIVO Interpretação Resultado positivo para a presença do DNA viral. Denominação do genótipo específico determinado em alto risco (AR) ou baixo risco (BR) Apenas HPV Resultado negativo para a presença do DNA viral. Um resultado "Não detectado" em PCR indica ausência de DNA viral na amostra, ou presença em quantidade inferior ao limite de sensibilidade do teste. Não foi possível chegar a um resultado final. Presença de substâncias inibidoras na amostra. Amostra insuficiente para a Detecção de DNA viral, após quantificação. Detectado por PCR em tempo real e Não detectado no KIT de genotipagem Apenas HPV

73 População: os diferentes serviços Nº AMOSTRAS GINEC. CAB/PESC PROCT PNEUM

74 População: estudo da prevalência TOTAL AMOSTRAS PREVALENCIA Dados do Estudo da Prevalência CITOLOGIA NEGATIVA 45% HPV 16 21,1% 1% CENTROS DE SAÚDE USSC Bairro da Boavista USSC Bairro do Armador USSC Bairro Padre Cruz/Telheiras USSC Castelo USSC Dr. José Domingos Barreiro USSC Vale de Alcântara/Tapada

75 Resultados: Colo útero ADENOCARCINO CONDILOMAS; MA; 0,5% 3% NEGATIVO; 14% Distribuição das amostras por resultado citologico/histologico CARCINOMA; 15% CIN III; 7% CIN II; 8% ASC-US; 28% Dados de CIN I; 21% ASC-H; 2% AGUS; 1%

76 Resultados: HPV e Colo útero Gráfico 2 Representação dos resultados qualitativos obtidos para a detecção do ADN VPH. Determinação da frequência de amostras positivas e negativas por tipo de lesão diagnosticada. No total de amostras analisadas, obteve-se 52.3% (548/1044) de amostras detectadas e 47.7% (500/1044) de amostras não detectadas para o VPH. A frequência de positivos é mais elevada do que a frequência de negativos nos adenocarcinomas com 0.6% (6/1044) de amostras positivas para o ADN do VPH, 5.7% (60/1044) nos Carcinomas, 4.2% (44/1044) nos CIN III, 1.6% (17/1044) nos CIN II, 2.5% (26/1044) nos CIN I, 4.3% (45/1044) nos HSIL e 9.4% (98/1044) nos LSIL. A frequência de negativos é mais elevada que a frequência dos positivos no ASC-H com 1.5% (16/1044) de amostras negativas para o ADN do VPH, 16.3% (170/1044) nos ASCUS, 1.4% (15/1044) nos condilomas e em 19.2% (200/1044) nos negativos

77 SAMPLES NATURE 8,3% 10,8% 31,4% 3,9% Dd Dados obtidos: 2,3% Cabeça Pescoço 1,1% 0,4% HPV POSITIVETY BY ANATOMIC REGION 37,5% 4,3% CONTROLO TONSIL PHARINGE GUM TONGUE JAW JUGAL MUCOSA PAVEMENT % POSITIVE % NEGATIVE % INIB 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 21% 77% 2% CONTROLO (N=175) 33% 67% 0% TONSIL (n=6) 0% 100% 50% PHARINGE (n=2) 17% 79% GUM (n=24) 22% 4% 4% 74% 73% 70% 46% TONGUE (n=209) 31% 15% JAW (n=13) 18% 9% JUGAL MUCOSA (n=22) 28% PAVEMENT (n=60) UNSPECIFIC ORAL VACETY 37% 59% 2% 4% UNSPECIFIC ORAL VACETY (n=46) % POSITIVE 21,1% 33,3% 0,0% 16,7% 22,0% 30,8% 18,2% 28,3% 37,0% % NEGATIVE 77,1% 66,7% 100,0% 79,2% 74,2% 46,2% 72,7% 70,0% 58,7% % INIB 1,7% 0,0% 50,0% 4,2% 3,8% 15,4% 9,1% 1,7% 4,3%

78 Dados obtidos: Cabeça Pescoço 35,0% 33,3% tipos de HPV 30,0% 25,0% 20,0% 22,2% 15,0% 13,9% tipos de HPV 11,1% 10,0% 0% 5,0% 2,8% 2,8% 2,8% 2,8% 5,6% 2,8% 0,0% coinfecção

79 Resultado laboratorial test result information for infected HPVs genotype coinfection ce infection persisten new 1st 2nd 3rd clearence s caso yes yes no caso yes yes no caso yes yes no caso yes yes no no

80 Resultado laboratorial Regredir Amostra Progredir Persistir História clínica Resultado laboratorial Estimativa de risco (Modelo de Markov)

81 Agradecimento Equipa do Laboratório de virologia Serviço de Patologia clínica do IPOFGL