Exercício colaborativo GHEP-ISFG SPInDel Identificação taxonómica de amostras forenses Instruções específicas Genotipagem de amostras A metodologia descrita corresponde à versão que foi optimizada no nosso laboratório. As amostras a genotipar correspondem a todas as incluídas no Exercício Intercomparação 2014 (M1-M8). Pede-se ainda aos laboratórios que tenham participado nos três Exercícios anteriores, que genotipem também as amostras não-humanas fornecidas, nomeadamente, a M7 de 2011, M7 de 2012 e M8 de 2013. Protocolo PCR SPInDel (v.3) com QIAGEN Multiplex PCR Kit: Vol. Final 10 μl 1x QIAGEN Multiplex PCR 5 Kit, Master Mix 2x Primer Mix fornecido 1 Água 3 9 μl mix + 1 μl DNA (±0,5-1ng/μl) Programa PCR (optimizado em termociclador GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler): Desnaturação inicial: 95ºC, 15min 94ºC, 30seg 30 ciclos 56ºC, 90seg 72ºC, 60 seg Extensão final: 72ºC, 50min 4 C,. Pós-PCR (electroforese em ABI 3130 com POP7): - Size standard LIZ 500; Filtro G5. Genotipagem A genotipagem das amostras pode ser feita por comparação directa do tamanho dos fragmentos com os controlos fornecidos (perfis na tabela abaixo), sendo ainda possível realizar a genotipagem automática com o Panel e Bins criados no GeneMapper ID v3.2 (faça aqui o download). Os 10 controlos amplificados fornecidos (7µl cada), correspondentes às 10 espécies estudadas, deverão ser corridos no aparelho que servirá para genotipar as amostras deste exercício (0,5µl amplificado em 10µl mix HiDi+LIZ 500; poderá ser necessário diluir os controlos, dependendo do aparelho e condições de corrida). No caso de pretender fazer a genotipagem automática, deverá inserir o Panel e Bins no programa GeneMapper e os Bins deverão ser ajustados de acordo com os tamanhos dos fragmentos dos controlos obtidos no seu aparelho.
A nomenclatura utilizada para designar os alelos não tem qualquer significado particular (ao contrário dos STRs); relembra-se que os fragmentos amplificados correspondem a regiões específicas do DNA mitocondrial (rever em Pereira et al., 2010) e para cada marcador genético os alelos encontram-se separados, na sua maioria, por apenas 1 bp. Marcadores genéticos Espécie Tubo SPID2716 SPID1350 SPID639 SPID1051 SPID2975 SPID2173 Capra_hircus (Cabra) A 11 15 12 14 13 14 Canis_lupus_familiaris (Cão) B 19 11 12 13 19 15 Equus_caballus (Cavalo) C 18 25 16 15 17 15 Oryctolagus_cuniculus (Coelho) D 17 11 12 13 16 17 Felis_catus (Gato) E 13 13 14 15 19 12 Homo_sapiens (Homem) F 10 10 11 10 10 11 Ovis_aries (Ovelha) G 11 15 13 14 12 16 Sus_scrofa (Porco) H 14 17 13 13 16 10 Mus_musculus (Rato) I 12 10 11 15 15 14 Bos_taurus (Vaca) J 11 16 10 14 11 14 Exemplo de um perfil obtido com SPInDel (v.3):
Análise dos resultados no programa SPInDel Workbench - Faça download do ficheiro SPInDel Workbench version 1.3 portable aqui; - O ficheiro encontra-se no formato de compactação de arquivos zip. Faça a extracção do ficheiro utilizando um programa apropriado (por exemplo, http://www.7-zip.org/ ou www.winzip.com); - Entre na pasta SPInDel_v13_April2014Release ; - Abra o programa seleccionando o ficheiro SPInDelv13.exe ; - No painel do lado esquerdo encontra dois projectos: GHEP_SPInDel_reference_seqs GHEP_SPInDel_alleles Fig1: O projecto GHEP_SPInDel_reference_seqs inclui o alinhamento da região do DNA mitocondrial de referência onde se localizam os marcadores genéticos para as 10 espécies incluídas no exercício. Este projecto descreve o local das regiões conservadas onde se ligam os primers incluídos no multiplex PCR. O projecto GHEP_SPInDel_alleles inclui a tabela com os alelos para todos os marcadores genéticos do SPInDel. Deverá utilizar este projecto para analisar as amostras do exercício. - Organize num ficheiro (word, excel, ou outro) os perfis das amostras obtidos no exercício, utilizando os alelos anteriormente descritos. Por exemplo: amostra X: 10 / 14 /10 / 16. Amostra Y: 16 /12 / 11 / 11
- Na SPInDel Workbench, seleccione o projecto GHEP_SPInDel_alleles e clique em Calculate Profiles (estas instruções também se encontram descritas no programa); Fig2: - A tabela que surge no programa descreve os alelos SPInDel para as 10 espécies incluídas no exercício; Fig3:
- Carregue em Search profile no menu do lado esquerdo; Fig4: - Adicione o nome da sua primeira amostra na caixa indicada; Fig5:
- Introduza os alelos da sua amostra (e.g. 11) nas caixas correspondentes aos marcadores genéticos. No caso de misturas, separe os alelos do mesmo marcador por um ponto (e.g. 15.16). No caso de alelos nulos, introduza um zero. Fig6: - Seleccione a amostra clicando no seu nome; Fig7:
- Clique em Search no menu do lado direito; Fig8: - Obtenha os resultados na caixa do lado superior direito; Fig9:
- Adicione uma nova amostra, clicando em Add do lado direito. Fig10: - Introduza o nome da amostra e o perfil, e veja o resultado como descrito anteriormente; - Depois de adicionar todas as amostras do exercício, exporte os resultados seleccionando Export results ; Fig11:
- Guarde o ficheiro dos resultados (*.xls) com o nome do investigador responsável pela análise das amostras no seu laboratório; Por exemplo, FilipePereira.xls Fig12: - Envie o ficheiro *.xls dos resultados para fpereirapt@gmail.com, até ao dia 12 de Junho de 2014.