1.0 Objetivos e alcance O MET/LACQSA/BH/007 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de zearalenona em produtos de origem vegetal e no registro dos dados relacionados às análises, para que estes sejam corretamente seguidos. 1.1 Abreviações As abreviações das micotoxinas estão conforme DS/LACQSA/BH/024. CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência DPR = RSD =CV =desvio padrão relativo LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação MC = material crítico p.a. = para análise p.a.r. = para análise de resíduos PBS = solução tampão fosfato salina R % = recuperação percentual r 2 = coeficiente de correlação Rf = fator de retenção Rt = tempo de retenção U = incerteza expandida 2.0 Fundamentos Esta metodologia fundamenta-se na extração de ZON das amostras pela solução de acetonitrila: água (84:16, v/v); purificação do extrato por cromatografia em coluna, empregando purificação em coluna, separação, detecção e quantificação por CLAE-fluorescência. 2.1 Características do método Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, com base nos estudos publicados por CHANG & DE VRIES (1984), ROMER (1994), SILVA e VARGAS (2001). Este método foi publicado no Diário Oficial da União (DOU, 2000) como método oficial do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Impresso por: Cópia não controlada Página 1/23
Este método foi revalidado utilizando os dados de análises de controles intralaboratoriais e de ensaios de proficiência realizados no período de 2002 a 2012. Os dados utilizados estão disponíveis nos documentos Análise Crítica AC025-2012 (elaborada em 01/06/2012), plano de estudo PE078 e seu respectivo Relatório e no PE089 e seu respectivo relatório, visando uma avaliação contínua do procedimento. Os parâmetros determinados no processo de revalidação são apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de revalidação utilizando dados de controles analisados no período de fevereiro de 2002 a maio de 2012 Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Z-score aceitáveis Ensaio de proficiência e análise de MR Resultados encontrados para materiais de referência do FAPAS e outros ensaios de proficiência dentro da faixa de aceitabilidade. Sim Dados de recuperação de controles intralaboratorial dentro dos critérios de aceitabilidade Veracidade Ensaios de recuperação Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029. Nível (g/kg) Recuperação (%) Valores obtidos dentro dos critérios de aceitabilidade para recuperação Faixa µg/kg Recuperação (%) Sim 50 60 a 120 4,53 a 1490,49 Entre 79 e 110 >50 70 a 120 Precisão (repetibilidade) Equação de Horwitz RSD Horwiitz 1 0,5log C 2 Valores obtidos menores que 0,66 (dois terços) do valor de DPR r (RSD) Sim Precisão intermediaria c C / 10 9 µg kg Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029 Nível (g/kg) DPR r DPR R 50 µg/kg 40 % 50 % Entre 1 e 10 µg/kg 25 % 40 % Valores obtidos menores que os previstos pela equação de Horwitz e menores que 22%. Faixa µg/kg CV = RSD % 4,53 a 1490,49 6 a 22 % Horrat Precisão adequada evidenciada por Horrat <1 Reprodutibilidade adequada evidenciada por Horrat < 1 Sim Seletividade Especificidade Ausência de interferentes no tempo de retenção (Rt) de ZON - não faz uso de coluna de imunoafinidade Ausência de interferentes no tempo de zearalenona Faixa ótima de 4,53 a 1490,49 µg\kg Sim Sim Sim Impresso por: Cópia não controlada Página 2/23
trabalho Faixa da curva de calibração Curva de calibração: aproximadamente na faixa 0,020a 2,5µg/mL equivalente a faixa 9,6 a 1200µg/kg na amostra Sim LD (g/kg) - 4,5 µg/kg Sim LQ (g/kg) - 9,0± 3,7 µg/kg Sim. U (g/kg) - LQ ± U : 9,0± 3,7 µg/kg Sim 2.2 Aplicabilidade O método é aplicável à determinação de zearalenona para os grupos de matrizes apresentados no DS/LACQSA/BH/004. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/005. 3.1 Vidrarias em geral Nota 1: As vidrarias identificadas como MC deverão ser calibradas e/ou terem desempenho satisfatório na verificação de desempenho segundo procedimento específico do LACQSA. conjunto (aparato) para filtração a vácuo com reservatório e base do funil com filtro poroso para membrana filtrante de 47 mm de diâmetro, com rolha para conexão ao kitasato; béqueres de 50, 100, 600 e 1000 ml ou equivalentes; frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente; frascos de vidro borossilicato, âmbar ou transparente, capacidade de 1000, 2000 e 5000 ml, com tampas, para armazenamento das fases móveis dos cromatógrafos; frascos para padrão, de vidro silanizado, âmbar com tampa sólida de rosca revestida com PTFE, capacidade de 2 e 4 ml; frasco de vidro borossilicato, para padrão, transparente, reutilizável, com fundo duplo, fundo interno cônico capacidade de 5 ml; Impresso por: Cópia não controlada Página 3/23
frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido, compatível com o rack do auto injetor do equipamento a ser utilizado, com tampa snap-cap ou equivalente; kitasatos de borossilicato de 500 e 1000 ml; provetas de borossilicato de 100 e 200 ml; seringas de vidro de 3 ml, tipo luer; pipetas de Pasteur; pipetas graduadas de 2,5 ml ou micropipeta capaz de medir 2,5mL; tubos de ensaio de 5-15 ml ou tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml com respectiva tampa. 3.2 Colunas e unidades filtrantes colunas Romer Mycosep TM 224 ou 226; filtro iso disc de 0,45 m de porosidade; membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC); membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para filtração de água; membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para filtração de solventes orgânicos; papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida. 3.3 Padrões e materiais de referência materiais de referência certificados e padrão analítico de zearalenona (MC). 3.4 Materiais de suporte adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 ml, tipo Bond elut, Varian ou equivalente; barra magnética; barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 litros; bastão, em vidro borossilicato; bulbos conta-gotas; cuba para recolher materiais limpos e utilizados; dispensete (dispensador); Impresso por: Cópia não controlada Página 4/23
espátulas; fita parafinada ou parafilme; gás hélio, 5.0 analítico; gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco; garra com 3 hastes; garra para conexão das partes do aparato de filtração; grades para tubos; hélice de aço inoxidável; papel toalha ou guardanapo; pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente; pinça dupla; papel alumínio; pissetas; ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e 200 a 1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a 10000 µl. 3.5 Material para quantificação por CLAE coluna Shimpack CLC-ODS (M) 250 x 4,6 mm, partículas de 5 m ou equivalente que apresente perfil característico para o sinal de ZON e que atenda ao perfil cromatográfico previsto neste MET (MC); pré-coluna ODS com partículas de 5 m ou equivalente, compatível com a coluna (MC); frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 ml com tampa snap-cap ou equivalente. 3.6 Reagentes, solventes e soluções 3.6.1 Reagentes e solventes acetonitrila grau p.a.r. ou HPLC (MC); ácido acético glacial p.a, ou ácido acético grau HPLC ou p.a.r.; água tipo I é recomendada. Em caso da não disponibilidade de água tipo I usar tipo II ou água deionizada, filtrada em membrana de 0,45 m; Impresso por: Cópia não controlada Página 5/23
benzeno p.a.r ou HPLC; celite p.a.; metanol grau HPLC ou p.a.r. (MC). 3.6.2 Soluções acetonitrila p.a.: água (84:16, v/v); metanol: água (70:30, v/v) ou (80:20, v/v); metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v); soluções padrão trabalho de zearalenona em benzeno. 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET. 4.1 Equipamentos críticos balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada; balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada; cromatógrafo líquido de alta ; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de escala de 2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µl; micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala de 2 µl; termômetro ou termopar calibrados. 4.2 Equipamentos de suporte Impresso por: Cópia não controlada Página 6/23
agitador de tubos; aparelho de ultrassom; banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40 C ±10%; capelas de exaustão; cronômetro temporizador digital; freezer capacidade de atingir temperaturas -15 C; geladeira capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 C; homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800 rpm; sistema de filtração a vácuo. 5.0 Precauções analíticas Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. Zearalenona é uma micotoxina estrogênica que apresenta ação hiperestrogênica e promotora de crescimento. Seus padrões sólidos e suas respectivas soluções devem ser manipulados como substâncias tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e à sua tendência de se dispersar em local de trabalho. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscaras, sempre que necessário, e sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica. Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise, conforme o IP/LACQSA/BH/001. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2 mol/l, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com Impresso por: Cópia não controlada Página 7/23
cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos (FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004. A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C 18 ), pode-se usar pré-colunas de C 18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. 6.0 Procedimentos O analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009, em acordo com o Responsável. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012. O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. No caso de realização de controle de reagente seguir procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002. O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula) empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista, metodologia utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. 6.1 Preparo de soluções Impresso por: Cópia não controlada Página 8/23
Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as necessidades das análises respeitando as devidas proporções. As soluções utilizadas como fases móveis nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas utilizando as bombas ou linhas dos equipamentos. Antes de serem transferidas para os cromatógrafos as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções. - Acetonitrila: água (84:16, v/v) Adicionar 160 ml de água tipo I em 840 ml de acetonitrila p. a. e homogeneizar. - Metanol: água (70:30, v/v) Adicionar 300 ml de água tipo I em 700 ml de metanol grau HPLC e homogeneizar. - Metanol: água (80:20, v/v) Adicionar 200 ml de água tipo I em 800 ml de metanol grau HPLC e homogeneizar. - Água: ácido acético (29:1, v/v) Adicionar 10 ml de ácido acético HPLC ou p.a.r a 290 ml de água tipo I, homogeneizar e filtrar em membrana de 0,45 m. - Metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) Adicionar 300 ml da solução água: ácido acético (29:1, v/v) à mistura de 350 ml de metanol grau HPLC e 350 ml de acetonitrila grau HPLC e homogeneizar. 6.1.1 Preparo da solução padrão de zearalenona As soluções padrão de zearalenona (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/003. Durante a manipulação das soluções padrões: - Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, coloque-os em suportes adequados e em ambiente protegidos da luz. Impresso por: Cópia não controlada Página 9/23
- Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada. - Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada. - Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para armazenamento no freezer. 6.1.2 Preparo da curva de calibração Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. Utilizando a solução trabalho de ZON (T ZON) preparar uma curva padrão de calibração em metanol: água (2:3, v/v), com no mínimo 5 concentrações diferentes, sendo estas aproximadamente iguais àquelas apresentadas na Tabela 3. Padrão Tabela 3: Faixas de concentrações aproximadas de ZON para curva de calibração (µg/ml) Concentração de ZON µg/ml Contaminação equivalente na amostra µg/kg P 1 2,50 1200 P 2 1,80 864 P 3 1,00 480 P 4 0,50 240 P 5 0,25 120 P 6 0,157 75 P 7 0,078 37,6 P 8 0,039 18,8 P 9 0,02 9,6 - Pipetar utilizando micropipeta um volume conhecido da solução trabalho e transferir para um frasco apropriado para o preparo da primeira solução da curva de calibração (P1). - Evaporar o padrão sob fluxo de N 2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o solvente não seque Impresso por: Cópia não controlada Página 10/23
completamente, deixando gotículas no fundo do frasco. - Dissolver o resíduo do padrão com a fase móvel com a mesma fase móvel a ser utilizada na análise: que pode ser metanol: água (70:30 ou 80:20 v/v), com agitação por aproximadamente 5 minutos em agitador de tubos, seguido de um minuto no ultrassom. Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P 1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados preferencialmente após aprovação de P 1 pela diluição do mesmo com solução de metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v) (Tabela 3). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001. 6.2 Determinação de zearalenona As etapas para a análise de zearalenona estão descritas de forma resumida no Fluxograma 6.6. 6.2.1 Extração - Pesar 25 g da amostra, à temperatura ambiente em frasco de vidro. - Adicionar 100 ml da solução de acetonitrila: água (84:16, v/v). Impresso por: Cópia não controlada Página 11/23
- Homogeneizar por 5 minutos, em velocidade alta (aproximadamente 800 1000 rpm). - Adicionar aproximadamente 3 g de celite, homogeneizar por agitação manual e deixar decantar. Esta massa pode ser medida utilizando um medidor aferido e marcado para retirada da quantidade aproximada de 3 g de Celite (Teste Número 10 de 01/04/2013). - Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar através de membrana de fibra de vidro Whatman GF/B 1 µm ou equivalente utilizando o conjunto para filtração à vácuo e recolher o filtrado. 6.2.2 Purificação - Transferir aproximadamente 5 ml do extrato filtrado para o tubo da coluna de Romer Mycosep TM 224 ou 226, utilizando pipeta automática ou pipeta volumétrica de 5 ml. - Pressionar a coluna lentamente para o interior do tubo com a extremidade de borracha para baixo. O extrato purificado é obtido na parte superior do tubo. - Caso se observe que o extrato purificado apresente evidências de impurezas ou turvo realizar o procedimento: transferir o extrato purificado para uma seringa de 3 ml, adaptada ao filtro iso disc de 0,45 m ou equivalente e filtrar. - Retirar quantitativamente 2,5 ml do extrato purificado e transferir para um tubo de polipropileno de 15 ml ou outro tubo de ensaio com capacidade de 5 a 15 ml. - Evaporar até secura, sob atmosfera de nitrogênio ou ar comprimido seco, em banho de aquecimento com agitação, a aproximadamente 40 C. - Caso não seja possível a evaporação imediata do extrato purificado, o mesmo deve ser armazenado em freezer para evaporação posterior. 6.2.3 Separação, detecção e quantificação por CLAE - Retomar os resíduos obtidos na purificação com 300 L ou com 400 µl (quando o auto-injetor do CLAE estiver configurado para utilização de racks com vials para volumes maiores) de metanol: água (70:30 ou 80:20, v/v) e em seguida homogeneizar utilizando agitador de tubos. Nota 2: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou Impresso por: Cópia não controlada Página 12/23
solvente de composição e polaridade similar. - Injetar no CLAE soluções padrão para curva de calibração e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação de ZON. coluna C18, 250 mm de comprimento, partículas de 5 m e 4,6 mm de diâmetro interno; pré coluna de C18; detector de fluorescência com comprimento de onda de excitação em 280 nm e de emissão em 465 nm; fase-móvel metanol: água (70:30, v/v) ou (80:20, v/v) com fluxo de 0,8 ml/min ou 0,5 ml/min, respectivamente; volume de injeção de 20 L. Nota 3: nestas condições (obtidos sob condições de validação do método), o tempo de retenção é de aproximadamente 12 13 minutos utilizando a fase móvel metanol: água (70:30, v/v) e 14-15 minutos para a proporção 80:20, v/v. - Armazenar os extratos brutos e os purificados, em freezer. - Com base na curva padrão de calibração, calcular as concentrações de zearalenona presente nas amostras. - Caso a leitura das amostras não esteja inserida na faixa ótima de trabalho da curva, diluir o extrato quantitativamente e injetar o extrato diluído. Impresso por: Cópia não controlada Página 13/23
6.2.5 Confirmação Figura 1: Cromatograma de padrão de zearalenona determinado por CLAE Reinjetar no CLAE os extratos das amostras suspeitas de contaminação (aquelas que apresentam sinal no Rf de zearalenona, mas que gera alguma dúvida), nas condições especificadas para determinação de ZON, substituindo a fase móvel por metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v). Haverá diminuição no tempo de retenção de ZON. Caso a dúvida persista realizar co-cromatografia pela adição de padrão ao extrato e reinjeção para verificação de aumento do sinal. 6.2.6 Fluxograma Impresso por: Cópia não controlada Página 14/23
7.0 Resultados 7.1 Cálculos Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg, conforme legislação vigente. Impresso por: Cópia não controlada Página 15/23
Os cálculos da contaminação de zearalenona, nas amostras analisadas deverão ser realizados utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/006 a qual considerou a Equação 1 para análises por CLAE. Equação 1 C ZEA C CLAE M ( µg) V A ( g) V SE EPE V R Em que: C CLAE = Concentração de zearalenona determinada pelo CLAE (µg/ml) V SE =Volume de solução usada na extração da amostra (ml) V R = Volume da solução usada para retomar o extrato evaporado (µl) M A = Massa da amostra usada na extração (g) V EPE = Volume do extrato purificado usado na evaporação (ml) 7.2 Reportagem de resultados Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência nas planilhas PLN/LACQSA/BH/014 e PLN/LACQSA/BH/015. Em caso de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011. Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão conforme determinado na tabela 1. A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Esse documento de suporte também trata dos casos em que é necessário realizar reanálise. Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado na Tabela 1. Impresso por: Cópia não controlada Página 16/23
Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/012 e, após verificação, deverá ser encaminhado à URPA. 8.0 Responsabilidades As funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no DS/LACQSA/BH/005. 9.0 Referências CHANG, H. L., and De VRIES, J. W. Short liquid chromatographic method for determination of zearalenone and alpha-zearalenone. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 67, 741-744, 1984. DOU Diário Oficial da União. Instrução Normativa n 9, 24/03/2000, publicado em 30/03/2000. Memorando elaborado dia 05/08/2013: 027-13: Assunto: Avaliação dos critérios de avaliação de P1. Ação de melhoria 00398/2012 (Auditoria interna) Trabalho não conforme 00035/2013 ROMER Labs. Inc., Mycotoxin Control Consultants. Quantitative method for DON, aflatoxin B1 and zearalenone. Method # MY8402, version 94.2, 1994. SILVA, C. M. G. and VARGAS, E. A. A survey of zearalenone in corn using Romer mycosep TM 224 column and high performance liquid chromatography. Food Additives and Contaminants, v.18, n.1, p. 39-45, 2001. 10.0 Documentos referenciados DE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006 IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinas IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e Suprimentos IT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análise POP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentos POP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientais POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentos DS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultados DS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetros FOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinas Impresso por: Cópia não controlada Página 17/23
FOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunas FOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle PLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentos PLN/LACQSA/BH/006-Resultado analítico Zearalenona - Incerteza de medição PLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cego PLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadas PLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadas PLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos PLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competência PLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas 12.0 Informações de registro Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010) Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061) Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015) Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014) Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054) Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018) Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020) Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001) Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114) Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012) Resultado analítico Zearalenona - incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/006) Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) 13.0 Arquivos anexados AC025-2012 (01/06/2012) AC067-2012 (10/07/2013) AC068-2012 (10/07/2013) Memorando elaborado dia 22/08/2013: 030-13: Assunto: Conclusões do Plano Estudo PE089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON PE078 Validação de limites de quantificação dos métodos de análise de micotoxinas. PE089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON (15/10/2012). Impresso por: Cópia não controlada Página 18/23
Relatório do PE078 - Validação de limites de quantificação (LQ) e definição dos critérios de aceitabilidade da Curva de Calibração para os métodos analíticos para micotoxinas. Relatório do PE089 Revalidação dos limites de quantificação dos métodos de análise das micotoxinas AFBG, DON, OTA e ZON (26/06/2013). 14.0 Controle de alterações Item - 1.1 2.1 Alteração Ao longo de todo o MET, foram retirados os nomes dos procedimentos e mantidas apenas as referências às suas siglas. - Inseridos MC, p.a., p.a.r. e retiradas siglas não presentes no documento. - Inserido: As abreviações das micotoxinas estão conforme DS/LACQSA/BH/024. - Retirado: Na validação foram determinadas as seguintes características do método: limite de detecção do equipamento, do método e de quantificação, linearidade, veracidade (em termos de recuperação, R%), precisão, repetibilidade e precisão intermediária (em termos de desvio padrão relativo, DPR%), obtidas por ensaios com amostras fortificadas com solução padrão de ZON e com amostras naturalmente contaminadas. 2.2 - Alteração da escrita fazendo menção ao DS/LACQSA/BH/004. 3.0 - Resumido a escrita do texto referente aos procedimentos de solicitação e aquisição de materiais. - Retirado: O material crítico (cuja qualidade afeta o resultado analítico) está identificado pelas iniciais MC. O significado de MC já está descrito em 1.1. - Retirado: Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrão, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada em ácido sulfúrico 2M, de acordo com os procedimentos descritos no IP/LACQSA/BH/001 (informação repetida). 3.1 - Inserida Nota 1. 3.6 - Retirado: que deverá estar de acordo com os critérios de aceitabilidade do MET, conforme Tabela 1. Avaliar também a existência de interferentes. A avaliação feita deve ser registrada no FOR/LACQSA/BH/005. As soluções deverão ser descartadas, mesmo dentro do prazo de validade, quando observadas alterações indicativas de deterioração (como turbidez, separação de fases, alteração de cor, etc.). Essas informações já estão contidas na IS/LACQSA/BH/002 referenciada nesse MET 4.0 - Retirado: considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a Impresso por: Cópia não controlada Página 19/23
5.0 adequada execução deste MET. Verificar a avaliação de desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para micropipetas, balanças, banho de agitação, proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas. Essas informações já estão disponíveis em outros documentos citados. - Inserido: Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT), no plano de equipamentos anual, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET. - Trocado plano de equipamentos por PLN/LACQSA/BH/001. - Inserção das informações: Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como das soluções padrões, incluindo vials novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico 2 mol/l, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 ml/min da fase móvel, para evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector. Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), pode-se usar pré-colunas de C18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila. Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão, avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção. - Alteração da escrita: Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de sódio a 1%, deixar em contato por 10 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. bem como resíduos. - Retirado:...produzida principalmente por fungo do gênero Fusarium, ocorrendo naturalmente em milho e cereais pré ou pós-colheita (KUIPER-GOODMAN, 1987; MILANO & LOPEZ 1991; PITTET 1998). 6.0 - Retirado: Na medição de massas, volumes finais de extratos de amostras, soluções padrão ou qualquer Impresso por: Cópia não controlada Página 20/23
6.1 6.1.1 medida que impacte significativamente a incerteza de medição deve ser usados vidrarias e equipamentos de medições calibradas. Devem ser utilizados equipamentos cujos valores das resoluções estejam de acordo com a especificação. A vidraria e o material utilizados nas análises deverão ser identificados, na medida do possível, evitando a troca de frascos de reagentes e amostras. Ao final da análise: Os resíduos de analise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004. Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as soluções e materiais utilizados na análise. - Inseridos: Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH/003. O FOR/LACQSA/BH/054 deverá ser preenchido com todas as características de identificação da coluna cromatográfica (tipo de coluna, marca, lote, número, comprimento, diâmetro interno e tamanho da partícula) empregada e, a cada análise, com informações referentes à data da utilização, nome do analista, metodologia utilizada e número de injeções. O formulário deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada. No caso de realização de controle de reagente seguir os procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/002. - Retirado: Os solventes e reagentes devem ser monitorados conforme IS/LACQSA/BH/002 (informação repetida). - Retirado: Etiquetar as soluções preparadas utilizando rótulo próprio, preenchendo adequadamente os campos com os dados do solvente/solução, data do preparo, nome do analista, validade e lote, conforme validado no Formulário FOR/LACQSA/BH/005 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de micotoxinas. - Retirado: Utilizar frascos tratados com ácido sulfúrico ou silanizados de volume adequado para preparo das soluções padrão. Os frascos devem ser âmbar ou devem ser protegidos contra a luz fluorescente e solar. Após o preparo, a solução trabalho deve ser selada com parafilm e armazenada em freezer a Temperatura < - 15 C. Durante a manipulação das soluções padrões. Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLA 013 Preparo de Soluções Padrão Impresso por: Cópia não controlada Página 21/23
6.1.2 6.1.2.1 6.1.2.2 Trabalho de Micotoxinas, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados. - Retirada: Nota 2: Observar a temperatura de recomendação de armazenamento de padrão fornecido pelo fabricante no certificado do padrão. - Troca do nome do item de Solução padrão para a curva de calibração CLAE para Preparo da curva de calibração CLAE. - Inserção das informações: Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de P 1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da PLN/LACQSA/BH/061. Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados preferencialmente após aprovação de P 1 pela diluição do mesmo (Tabela 3). Todas as soluções preparadas devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001. A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho devese preparar também uma nova curva de calibração. Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo. As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001. - Excluído o item de Aprovação da primeira solução (P 1 ) da curva de calibração para Preparo da curva de calibração. As informações desse item foram transferidas para o item 6.1.1 e as que já estão contidas na PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia a planilha. - Excluído o item de Critério para aceitabilidade e aprovação e da curva de calibração procedimento para o dia do preparo das soluções da curva de calibração. As informações desse item foram transferidas para o item 6.1.1 e as que já estão contidas na PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia a planilha. 6.1.2.3 - Excluído o item de Critério para aceitabilidade e aprovação e da curva de calibração (rotina analítica). As Impresso por: Cópia não controlada Página 22/23
6.2.3 informações desse item foram transferidas para o item 6.1.1 e as que já estão contidas na PLN/LACQSA/BH/061 foram retiradas do MET, pois ele já referencia a planilha. - Inserção da nota: Nota 2: Verificar o solvente do frasco de lavagem do auto injetor que deve ser preferencialmente a fase móvel ou solvente de composição e polaridade similar. 6.2.4 - Excluído o item 6.2.4, que trata dos procedimentos para uso de colunas cromatográficas. 7.1 7.2 - Retirado: Alterações nos procedimentos descritos neste MET poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de acompanhamento de análise. Informação repetida. - Item totalmente reformulado para inserir referência ao DS/LACQSA/BH/022 e evitar trazer informações que já se encontram nesse documento de suporte. - Substituído o FOR/LACQSA/BH/032 pela PLN/LACQSA/BH/011. 7.3 - Item retirado. 9.0 - Atualização das referências. 10.0 - Atualização das referências. 11.0 - Atualização das referências. 12.0 - Informações de Registro atualizada para inclusão de documentos e exclusão de documentos obsoletos. 13.0 - Inserido os arquivos anexados. Impresso por: Cópia não controlada Página 23/23