Doença multifatorial Fatores Genéticos Muitos genes Fatores Ambientais Também chamadas doenças complexas
Limiar Vários fatores que contribuem quando passa do limiar = DOENÇA
Limiar Vários fatores que contribuem quando a pessoa passa do limiar = DOENÇA
Limiar Vários fatores que contribuem quando a pessoa passa do limiar = DOENÇA
Genes associados São vários genes Cada gene segue padrão de herança mendeliano Nem todo mundo tem os mesmos alelos nos mesmos locos
Exemplo fictício Doença associada com 10 genes (A J) e 1 fator ambiental (cigarro) Todos os genes tem efeito igual sobre a susceptibilidade (sempre o recessivo ) Limiar é quando tem alelo de susceptibilidade em pelo menos 7 genes (+fator ambiental)
Exemplo fictício 1: AA BB CC DD EE FF GG HH II jj fuma 2: AA BB CC DD ee FF gg HH II jj não fuma 3: aa BB cc dd ee FF gg hh ii JJ fuma 4: AA BB CC dd ee ff gg hh ii jj fuma 5: aa bb cc dd ee ff gg hh ii jj não fuma
Genes associados Não tem um gene causador da doença e sim muitos genes ASSOCIADOS Genes associados alelos conferem diferentes graus de SUSCEPTIBILIDADE
Risco de recorrência Menor que para características monogênicas Não é simples de ser calculado estimativa Depende da prevalência da doença na população em questão
Como saber se tem fator genético Estudos de gêmeos e filhos adotivos Agregação familial parentes consanguíneos x parentes não consanguíneos Estudos de genes associados
Como saber quais genes Estudos de associação POPULAÇÃO vs Estudos de ligação FAMÍLIAS
Estudos de associação Baseados em análises populacionais Também chamados de estudos caso-controle Comparação entre grupo de pacientes com grupo de indivíduos não afetados
Estudos de associação Princípio: compara os alelos de um gene em pacientes e em controles se houver diferença entre o grupo de pacientes e o grupo controle o gene está associado
Exemplo fictício Gene A alelos A1 e A2
Exemplo fictício Teste estatístico para ver se a diferença é significativa Se for: Cálculo da OR (odds ratio) ~ risco relativo
Exemplo fictício Nem todo mundo que tem A1 tem a doença Nem todo mundo que tem a doença tem A1
Análise estatística Método de Woolf (1955) Razão de proporções (odds ratio) É a incidência relativa da característica em pessoas com marcador α comparada a pessoas com o marcador β
Incidência relativa marcador pacientes controles α a b β c d Razão entre os marcadores α e β em pacientes dividida pela razão respectiva em controles Odds ratio = (a/c)/(b/d) = a.d/c.b
Estudos de associação IMPORTANTE: grupos de pacientes e controles devem ser pareados para outros fatores!!!! Idade Sexo Exposição ao fator ambiental Origem étnica
Estudo de associação Consequências do mal-pareamento entre pacientes e controles: ASSOCIAÇÕES ESPÚRIAS ausência de associação IDADE se controles forem mais novos podem ainda não ter desenvolvido a doença Sexo se a doença afetar mais homens do que mulheres e nos controles tiverem mais mulheres
Origem étnica Se todos os pacientes forem do continente X e os controles do continente Y Se forem de um continente Z, mas com origem
Exposição ao fator ambiental Nem sempre se conhece, tentar parear por: Área geográfica Ocupação Classe social Hábitos de vida/alimentação (tabagismo, consumo de álcool, uso de anticonceptivos, etc...)
Polimorfismos Como estudar o gene? Marcadores genéticos SNP STR/VNTR Indel
Polimorfismos Técnicas utilizadas: PCR-RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) PCR-SSP (sequence specific primer) PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) PCR-SSCA (single strand conformation polymorphism) Sequenciamento Microarranjo
Polimorfismos associados Polimorfismo associado pode: Alterar aa na proteína (alteração de função) polimorfismo não sinônimo na região codificadora Alterar a quantidade da proteína polimorfismo na região do promotor ou região reguladora Alterar processamento do mrna (alteração sítio de splicing) polimorfismo em íntrons
Polimorfismos Polimorfismo estudado pode ser variante causal ou não (marcador genético) Polimorfismo pode aparecer associado porque está em Desequilíbrio de Ligação com polimorfismo causal
Haplótipos Gene A: alelos A1 e A2 Gene B: alelos B1 e B2 Tipagem: indivíduo A1/A2 e B1/B2 Possíveis haplótipos:
Desequilíbrio de Ligação Na população: Frequências alélicas: A1 20%; A2 80% B1 50%; B2 50%
Desequilíbrio de Ligação Desequilíbrio de ligação é quando as frequências haplotípicas observadas diferem das esperadas!
Desequilíbrio de Ligação Implicações para estudos de associação: Associações observadas podem estar acontecendo apenas por causa do Desequilíbrio de Ligação No exemplo: B2 só ocorre com A2 (não ocorre com A1) então, se A2 estiver associado, num estudo do gene B provavelmente B2 vai estar associado, mas a associação de B2 pode não ter significado biológico e apenas refletir a associação real de A2
Desequilíbrio de Ligação Permite usar um ou poucos marcadores (SNPs) para avaliar vários outros varredura de um gene inteiro ou uma região genômica TagSNP: SNP que funciona como etiqueta para um haplótipo inteiro
TagSNP -Exemplo Haplótipos existentes (4 genes): 1) A1B1C1D1 2) A1B2C2D1 3) A2B1C2D2 Se genotipar só gene A se for A2: já sabe que é B1, C2 e D2 Se for A1: sabe que é D1, mas não sabe B e C Se genotipar mais B ou C dá pra deduzir todo o haplótipo
Estudos de associação Abordagem do gene candidato Estudos de regiões candidatas Estudos de varredura GWAS (genome wide association studies)
Gene candidato Escolhe um gene para o estudo: Função do gene Estudos anteriores encontraram associação Estudos anteriores apontam região como candidata Genotipagem: Um ou vários polimorfismos do gene em questão
Estudos genômicos Estudo sem hipótese à priori livre de hipótese Permitem encontrar associações que não eram esperadas/previstas Precisam de amostras muito grandes (geralmente mais de 1.000 pacientes e 1.000 controles)
Estudos genômicos Estudos de milhares de SNPs (geralmente 100.000 ou mais) Apontam regiões de interesse SNPs associados em DL com SNP causal Precisam de estudos posteriores refinados destas regiões encontradas para validação
1161 pacientes e 1174 controles >315.000 SNPs Compararam com resultados de 2 estudos Genotiparam 80 SNPs em mais 1215 pacientes e 1258 controles Locos associados identificados com segurança para susceptibilidade a T2D pelo menos 10
Diabetes Dividida em dois tipos: Tipo 1: autoimune Tipo 2: metabólica Diabetes tipo 1 associação bem definida com genes HLA de classe II Genes HLA contribuem com 30-50% do risco para diabetes tipo 1, muitos outros genes também contribuem Clin Chem.2011 Feb;57(2):176-85.
Resumindo Doença Multifatorial Interação de fatores genéticos e ambientais Estudos de associação Estudos populacionais Comparação de grupo de pacientes com grupo de indivíduos controle
Resumindo Abordagens Genes candidatos escolhe por importância e conhecimento a priori GWA muitos SNPs (precisa amostra grande) Polimorfismos Regiões reguladoras ou regiões codificadoras TagSNP (desequilíbrio de ligação)
Resumindo Diferentes alelos conferem diferentes SUSCEPTIBILIDADES aos portadores Nenhum gene sozinho é suficiente para desenvolver doença Alelo associado: Nem todo mundo que tem a doença tem o alelo e viceversa
Estudos de Ligação Ligação entre dois locos. Famílias nas quais mais de um membro tem a doença.
Estudos de Ligação Dois loci (M e D) são ligados: probabilidade de que sejam herdados juntos, como um haplótipo, depende da probabilidade de recombinação durante a meiose:
Estudos de Ligação Para locos não ligados (segregação independente) a fração de recombinação = 0,5. Para locos completamente ligados, = 0.
Se D é um gene de doença desconhecido e M é um alelo de um loco de um marcador, e se M e D estão ligados, M irá segregar de modo semelhante à doença.
Alelo A está cosegregando com a doença: ligação entre alelo A do marcador e doença.
Diferentes alelos de marcadores irão cosegregar com a doença em diferentes famílias.
Alelo B está cosegregando com a doença: ligação entre alelo B do marcador e doença. Recombinação gera haplótipo diferente: alelo C e doença.
Importante Nenhum alelo do marcador está necessariamente ASSOCIADO à doença!!!! São locos LIGADOS!!! O loco do marcador é localizado próximo ao loco (gene) da doença: ocorre menos recombinação entre eles do que seria esperado se apresentassem segregação independente.
Marcadores e Mapeamento Para serem úteis no mapeamento de genes de doenças, os loci de marcadores moleculares devem: Ser altamente polimórficos, de modo que sua segregação em famílias possa ser atribuída precisamente; Ter sua localização conhecida.
Microssatélites (STR)
Estudos de Ligação - Características mendelianas Somente um ou dois locos estão envolvidos e os variantes causais são altamente penetrantes. Grandes heredogramas com múltiplos casos da doença. Métodos paramétricos (Lod score) são eficientes e o padrão de segregação é claro, permitindo a escolha de modelos plausíveis.
Análise em famílias: Método do LOD Score Mais utilizado para doenças monogênicas. Distâncias genéticas entre marcadores são conhecidas. Somente a localização do gene da doença e portanto a sua fração de recombinação com os marcadores, é desconhecida.
Método do LOD Score fração de recombinação : varia de 0 a 0,5. Frequência esperada na progênie para cada valor de : de 0,01 a 0,5. Probabilidade (likelihood; L) de que os dados da família resultem de um determinado valor de. Maximum likelihood é a melhor estimativa de.
Método do LOD Score Odds ratio (OR): L para cada valor de / L para = 0,5. LOD score (Z): Log (base 10) de OR. Somar o LOD score de diferentes famílias para obter o valor máximo de LOD score (MLS).
Análises paramétricas Método do LOD Score Evidência de ligação: Lod score (Z) > 3 Rejeitar ligação: Lod score (Z) < -2 Incerteza: -2< Lod score (Z) <3
Genetic analysis of cystic fibrosis using linked DNA markers. L C Tsui, K Buetow, and M Buchwald Am J Hum Genet. 1986 December; 39(6): 720 728.
Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística Dois marcadores em desequilibrio de ligação com a fibrose cística: MET e D7S8.
Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística
Mapeamento Gênico por análise de ligação e caminhada cromossômica: gene da fibrose cística
Estudos de Ligação - Características Complexas Suscetibilidade depende de muitos locos. Alelos comuns com efeitos pequenos e/ou alelos raros com efeitos um pouco maiores. Não se observam grandes famílias com múltiplos afetados. O risco de recorrência nas famílias é baixo. Métodos paramétricos podem levar a resultados enganosos.
Análises em pares de parentes Mais comuns para doenças multifatoriais. Pares de parentes afetados compartilham marcadores mais do que o esperado de acordo com sua relação de parentesco.
Método dos pares de irmãos Pares de irmãos afetados pela doença: maior disponibilidade; mesmos fatores ambientais. Quando possível, pais são coletados e genotipados também.
Análises não-paramétricas: pares de irmãos Compartilhamento de Alelos Idênticos por Descendência (IBD sharing): indício de ligação
Características Multifatoriais Análises em muitos pares de irmãos afetados: estimativa de MLS (maximum LOD score). Utilizando muitos marcadores: identificação de regiões no genoma que sugerem ligação com a doença. Varreduras genômicas: 400 marcadores, abrangendo entre 10 e 20 milhões de pares de bases.
QTLs: hipertensão.
Hipertensão.
Hipertensão.
Hipertensão.