Estudo da diversidade com sequências de DNA

Transcrição

1 Estudo da diversidade com sequências de DNA

2 estudo do DNA por sequenciação extracção de DNA PCR do fragmento desejado sequenciação

3 estudo do DNA por sequenciação sequenciação indivíduo A indivíduo B indivíduo C

4 Alguns índices de diversidade: π (diversidade nucleotídica): Número médio de diferenças (por site) entre duas sequências retiradas ao acaso de uma amostra. H (diversidade haplotípica): Probabilidade de, retirando aleatoriamente dois haplótipos de uma amostra, estes serem diferentes S (número de sítios variáveis) θ (population mutation parameter) Nível esperado de variabilidade assumindo equilíbrio entre mutação e deriva e ausência de selecção. Estabelece uma relação entre o efectivo populacional e a taxa de mutação. θ = 4Neμ autossomas θ = 3Neμ cromossoma X θ = Neμ cromossoma Y, mitocondrial Em vez de uma só maneira de o calcular, existem diferentes estimadores que aproximam este valor (exemplo: θ de Watterson (1975)). Usa-se este valor para estimar o Ne.

5 PROGRAMAS QUE CALCULAM PARÂMETROS DE DIVERSIDADE DNAsp Arlequin SITES

6

7 A diversidade diminui nas populações mais a norte. 0.8 Hd Hd

8 Construção de redes de haplótipos p

9 A

10 A 3 5 B

11 C 2 A 3 5 B

12 C 2 A 3 5 B D 1

13 E 4 C 2 A 3 5 B D 1

14 E 4 F 1 C 2 A 3 5 B 2 D 1

15 E 4 F 1 C 2 A 3 5 B, G 2 D 1

16 E 4 F 1 C, H 2 A 3 5 B, G 2 D 1

17 Softwares que fazem redes de haplótipos: -Network -TCS -(Arlequin) (usam métodos diferentes)

18

19 h25 h24 h19 h20 h21 h2 6 h16 h28 h24 h2 3 N t h30 h22 h14 h11 h29 h18 h17 h2 7 h15 Norte Sul h30 h4 h1 h9 h13 h10 h14 h11 h29 h17 h BU Rede de haplótipos h3 h7 h2 h4 h1 2 h5 haplótipos (700bp ) h1 h6 Distribuição geográfica dos grupos

20 Pi Buçaco Pi

21 Subestruturação ao nível de sequências do DNA

22 Distância entre populações Grupo 1 Grupo 2 Dxy: distância média entre elementos dos dois grupos. Da: distância média entre elementos dos dois grupos, corrigida para a distância observada dentro de cada grupo.

23 Resultados Dxy = 1,268% Da =0,996% Nºdeposições fixas = 6 Etc. etc.

24 Recapitulando

25 Calculámos diferentes índices de diversidade para populações de C. lusitanica Verificámos que, tal como nos marcadores nucleares, a diversidade diminui nas populações mais a norte Hd Hd

26 Verificámos que existem dois grandes grupos de haplótipos que ocupam áreas geográficas diferentes. h19 h20 h21 h2 6 h25 h24 9 Norte Sul h11 h15 h18 h14 h16 h17 h22 h2 3 h30 h2 7 h28 h BU h10 h9 h1 2 h8 h13 h3 h4 Distribuição geográfica dos grupos h7 h5 h6 h2 h1 Rede de haplótipos (700bp )

27 Pi Buçaco Pi

28 Iniciámos ainda a análisede subestruturação Iniciámos ainda a análise de subestruturação calculando a distância genética entre os grupos.

29 Subestruturação ao nível de sequências do DNA

30 Diferenciação entre populações Pop 1 As estatísticas F (Fst, Fit, Fis) foram desenvolvidas a pensar em dados alélicos (como proteínas), mas podemos fazer um paralelo com sequências de DNA. Pop 2 Existem diversas medidas análogas ao Fst para sequências de DNA. Algumas incorporam informação sobre o número de mutações (distância) entre alelos (ex. Fst de Hudson et al. (1992)), outras contemplam apenas frequências (como as medidas clássicas ). No fundo, o que estes valores nos medem é a proporção de variação que está entre as unidades que consideramos (ex. populações) por oposição à proporção que está dentro dessas unidades. O DNAsp e o Arlequin calculam nos estes valores de Fst O DNAsp e o Arlequin calculam-nos estes valores de Fst (mas para isto temos primeiro de definir populações).

31 Diferenciação entre populações E se quisermos pensar a mais do que um nível? Pop 1 Pop 3 Qual a % de variação explicada por diferenças: entre grupos? entre populações dentro de cada grupo? dentro das populações? AMOVA analysis of molecular variance Grupo 1 Grupo 2 (Excoffier et al. 1992) Pop 2 Pop 4 Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.). Software Arlequin

32 Diferenciação entre populações E se quisermos pensar a mais do que um nível? Pop 1 Pop 3 Grupo 1 Pop 2 Pop 4 Grupo 2 Qual a % de variação explicada por diferenças: entre grupos? entre populações dentro de cada grupo? dentro das populações? AMOVA analysis of molecular variance (Excoffier et al. 1992) Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.). Software Arlequin

33 Diferenciação entre populações Output do Arlequin: -% de variação em cada nível hierárquico - índices de fixação í i d i ifi â i -níveis de significância determinados por permutações

34 Resultados AMOVA norte vs. sul (ignorando a população do Buçaco): % variação entre grupos: 77,91% % variação entre pops dentro dos grupos: 12,07% % variação dentro das pops: 10,02% (todos os valores estimados para os índices de fixação são significativos)