HISTOTÉCNICAS NEUROPATOLÓGICAS

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1 HISTOTÉCNICAS NEUROPATOLÓGICAS As técnicas histológicas básicas para os espécimens do sistema nervoso central (SNC) são essencialmente as mesmas utilizadas para os espécimens das outras partes do corpo. Entretanto, há diferenças significativas no tempo de fixação e nas técnicas de embebição e de cortes, e os procedimentos de coloração especial desenvolvidos para demonstrar as estruturas vistas somente no cérebro e na medula espinhal. Para um melhor entendimento dos vários elementos, que são vistos no SNC, uma breve discussão das suas estruturas auxiliará o tecnologista na seleção, execução, e no controle de qualidade das colorações especiais empregadas nos espéçimens do SNC. O corpo da célula nervosa contém um núcleo e um nucléolo, os quais são demonstrados na coloração de rotina pelo método da H & E. No citoplasma de alguns corpos celulares há corpúsculos de Nissl, os quais contêm grânulos de ácido ribonucléico, e são vistos, ao microscópio eletrônico, como ribossomos. Os corpúsculos de Nissl podem ser seletivamente demonstrados utilizando-se o cresil-violeta (método de Vogt) ou a galocianina (método de Einarson) ou o aldeído-tionina / PAS. O método de escolha da AFIP é o cresil violeta. É possível demonstrar corpos de inclusão no citoplasma de alguns neurônios; e.g., os corpos de Lafora vistos em certos tipos de epilepsia (método do Ácido Periódico - Schiff) e os corpos de Negri vistos na raiva (método de Bosch). As neurofibrilas são estruturas citoplasmáticas de alguns neurônios, que podem ser demonstradas utilizando-se um procedimento modificado de Bielschowsky. Outras estruturas, que são vistas em preparações coradas pelo método de Bielschowsky, incluem as placas senis, as fibras nervosas e as terminações nervosas. Estendendo-se dos corpos celulares dos neurônios há um ou mais processos chamados axônios e dendritos. Os neurônios unipolares têm um processo, como o visto nas células dos gânglios da raiz dorsal. Os neurônios bipolares têm um axônio e um dendrito, como as células olfatórias de primeira ordem. Os neurônios multipolares, muito mais numerosos que os unipolares e bipolares, caracterizam-se por seus numerosos processos dendríticos, como os vistos nas células da substância cinzenta ventral da medula espinhal e nas células de Purkinje do córtex cerebelar. Os neurônios e os seus processos são demonstráveis pelos métodos de Bodian, de Holmes, e de Bielschowsky modificado. De tais procedimentos com prata, o método de Bodian utiliza um proteinato de prata, o protargol, e os métodos de Holmes e de Bielschowsky usam soluções de nitrato de prata. Envolvendo o axônio há uma complexa bainha lipídica chamada mielina. Para demonstrar a mielina, dois procedimentos são recomendados, o método de Kluver-Barrera para mielina e neurônios, o qual usa o Luxol Fast Blue, e o método de Woelke, que emprega a hematoxilina férrica. Há outras células e estruturas no SNC, que não estão envolvidas na recepção, correlação e na transmissão do impulso nervoso. Elas incluem a neuroglia, o epêndima e os epitélios. As funções destas estruturas e células incluem a nutrição, o suporte e a fagocitose. As estruturas vasculares e ependimárias são facilmente demonstráveis com a hematoxilina e a eosina. Para distinguirem-se os três tipos de células gliais são necessários procedimentos de coloração especial. Os astrócitos e a oligodendróglia, algumas vezes chamados macroglia, são as principais células da neuroglia. A microglia compreende as células migratórias que atuam como fagócitos. Os astrócitos fornecem nutrição aos neurônios, e a oligodendroglia é a responsável pela formação da mielina. Os astrócitos são mais comumente demonstrados pelo procedimento da hematoxilina-ácido fosfotúngstico de Russel (PTAH) e pelo método de Holzer modificado para fibras gliais. O método de Cajal para astrócitos é empregado em secções congeladas. O método de Penfield para oligodendrócitos e microglia, quando feito em cortes congelados, irá corar ambas as células em preto. Para fixar o encéfalo adequadamente nós recomendamos colocá-lo inteiro em formalina a 20%, neutra, tamponada, por 24 horas e, após, passá-lo para a formalina neutra a 10%, neutra, tamponada, onde deve permanecer por mais 7 a 10 dias. Alternativamente, a formalina a 10%, neutra e tamponada, pode também ser 1

2 usada em todo o procedimento. Após a fixação adequada o encéfalo estará pronto para a clivagem. Para reduzir a inalação do formol pode-se imergir o encéfalo inteiro em etanol a 80%, logo antes do exame macroscópico. O etanol a 80% também inicia a desidratação. Quando o exame macroscópico estiver terminado, os espécimens não selecionados para o processamento (reserva) devem retornar ao formol a 10%, neutro, tamponado. Os esquemas de processamento diferem se o encéfalo é de recém-natos ou de bebês, se de adultos, se é inteiro, e para os fragmentos obtidos por biopsia de músculos e nervos (veja a tabela 1). Como quaisquer outros tipos de tecidos, os fragmentos de encéfalo e de medula espinhal devem ser emblocados em parafina, o mais plano possível. Entretanto uma excessiva pressão não deve ser aplicada para manter os tecidos do SNC no plano. O esfriamento e o congelamento dos espécimens emblocados não deve ser feito, pois os mesmos promovem artefatos de fragmentação e fendas nos cortes. O bloco de parafina deve ser esfriado lentamente, à temperatura ambiente. Estando completa a solidificação do bloco de parafina, este pode ser resfriado com água corrente gelada, derramada sobre ele. As bolhas na parafina são as responsáveis pelos espaços que, por seu lado, levam ao surgimento de linhas que cruzam os cortes. Há várias diferenças significantes na realização dos cortes de tecidos do SNC, em relação aos demais tecidos. Os blocos parafinados nunca devem ser congelados ou a superfície dos mesmos esfriada, por exposição a cubos de gelo ou por meio do refrigerador. Somente a navalha deve ser esfriada. Uma vez obtida a fita de cortes, esta deve ser colocada em banho histológico a 43 o C, onde foi acrescentada gelatina. A obtenção de fitas de cortes será mais fácil se os blocos forem previamente aparados nos bordos, bem próximo ao fragmento de tecido, sem expô-lo. O histotecnólogo deve primeiro obter uma fita, antes de molhar o bloco. Se não conseguir, a superfície exposta do bloco pode ser umedecida com um chumaço de algodão molhado com água de torneira ou destilada. Devese evitar molhar muito, pois isto promove uma tumefação excessiva do tecido. Se forem muito molhados, os cortes finos, montados sobre lâminas, irão, inevitavelmente, cair durante a coloração. Muitos procedimentos de coloração especial requerem cortes com espessura específica, a saber: Nos métodos de Bodian e de Bielschowsky utilizam-se secções com 8 micrômetros (8 ìm); no Luxol Fast Blue, nos procedimentos de Woelke, do cresil violeta, de Hirsch-Peiffer, e do vermelho Congo requerem-se cortes com 20 micrômetros (20 ìm). Se uma coloração especial for pedida para espécimens representados apenas por nervos, a espessura sugerida é de 15 micrômetros (15 ìm). Numerosas técnicas neuro-histológicas tradicionais têm sido suplantadas, nos anos recentes, pelos procedimentos imuno-histoquímicos, os quais permitem a identificação de marcadores mais específicos de um tipo celular, e. g., a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para os astrócitos. 2

3 Tabela-1: ESQUEMAS DE PROCESSAMENTO ENCÉFALO (BEBÊ) ENCÉFALO (ADULTO) CORTES MONTADOS INTEIROS FRAGMENTOS DE NERVOS E MÚSCULOS Álcool, a 70% 24h h 30min Álcool, 80% 24h 24h 24h 30min Álcool, 95% (3 trocas) Álcool absoluto (3 trocas) Partes iguais de Álcool absoluto e xileno Xileno (2 trocas) 2h cada 2h cada 8h cada 15min cada 2h cada 2h cada 8h cada 15min cada 2h 2h 8h 15min 2h cada 2h cada 8h cada 15min cada Parafina b 2h cada 3h cada 8h cada 15min cada (3 trocas) c a Use somente álcool etílico (etanol) nos esquemas acima. b Paraplast ou composto de emblocamento com ponto de ebulição de 56 o C a 58 o C. c Coloque os espécimens no forno com vácuo por cerca de 1 hora se o processador de tecidos não tiver sistema de vácuo. 3

4 MÉTODO (DE VOGT) DO VIOLETA DE CRESILA PARA SUBSTÂNCIA DE NISSL FIXADOR: Formalina a 10% neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 6 a 20 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO ESTOQUE DE VIOLETA DE CRESILA (ECHT) A 2% Violeta de cresila (echt)... 2 gramas Água destilada...até completar 100 mililitros [Nota: O violeta de cresila echt [cresyl echt violet (violeta de cresila autêntico, genuíno), também conhecido como cresyl fast violet] pode ser substituido pelo acetato de violeta de cresila]. SOLUÇÃO TAMPÃO DE ACETATO DE SÓDIO Acetato de sódio (CH 3 COONa)... 2 gramas Água destilada mililitros Ácido acético glacial (CH 3 COOH)... 3 mililitros O acetato de sódio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite ingeri-lo, inalá-lo, assim como o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo. O ácido acético é substância tóxica, inflamável, corrosiva. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com quaisquer partes do corpo. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE VIOLETA DE CRESILA Solução estoque de violeta de cresila a 2%... 1 mililitro Solução tampão mililitros PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a segunda troca de etanol absoluto. 2. Coloque em etanol absoluto e deixe por 2 horas. 3. Coloque na solução de uso de violeta de cresila e deixe por 40 a 60 minutos. 4. Diferencie rapidamente em etanol 95%. 5. Desidrate e clarifique através do etanol absoluto e do xileno, 2 trocas de 2 minutos em cada. 6. Monte com meio resinoso. RESULTADOS Substância de Nissl... púrpura intenso. Núcleos... púrpura. Fundo... claro. 4

5 MÉTODO (DE EINARSON) DA GALOCIANINA PARA A SUBSTÂNCIA DE NISSL FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada, Solução de Zenker, ou de formol-zenker. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE GALOCIANINA Galocianina... 0,15 grama Sulfato de cromo III e potássio (alúmen) [CrK(SO 4 ) 2 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros Dissolva o alúmen em água destilada morna. Acrescente a galocianina e deixe ferver em fogo brando por 10 minutos. Deixe esfriar e filtre. A solução mantém-se boa para uso por 1 semana. O sulfato de cromo III e potássio é tóxico. Evite ingeri-lo, inalá-lo, assim como o contato com a pele, mucosas, ou quaisquer partes do corpo. Os sais de cromo são potencialmente cancerígenos. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque na solução de galocianina e deixe por 1 hora na estufa a 56 o C ou à temperatura ambiente por uma noite. 3. Lave em água destilada. 4. Desidrate e clarifique através do álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto, e xileno, 2 trocas de 2 minutos cada.. 5. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Substância de Nissl... azul. REFERÊNCIA EINARSON, L. A.. - Method for progressive selective staining of Nissl and nuclear substance in nerve cells. The American Journal of Pathology, 8: 295,

6 PAS ALDEÍDO-TIONINA MODIFICADO PARA A SUBSTÂNCIA DE NISSL FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO AQUOSA DE ÁCIDO SULFÚRICO A 0,5% Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 )... 0,5 mililitros Água destilada... 99,5 mililitros O ácido sulfúrico é corrosivo, oxidante e tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas ou quaisquer partes do corpo. Mantenha longe de fontes de calor. ACRESCENTE O ÁCIDO NA ÁGUA E NÃO O CONTRÁRIO. CUIDADO! REAÇÃO EXOTÉRMICA! SOLUÇÃO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO A 0,5% Permanganato de potássio (KMnO 4 )... 0,5 grama Água destilada... até completar 100 mililitros O permanganato de potássio é oxidante e tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas ou quaisquer partes do corpo. Mantenha-o longe de fontes de calor SOLUÇÃO DE METABISSULFITO DE POTÁSSIO A 2% Metabissulfito de potássio (K 2 S 2 O 5 )... 2 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O metabissulfito de potássio é tóxico. Evite inalá-lo, ingeri-lo e o contato com a pele, mucosas ou quaisquer partes do corpo. SOLUÇÃO DE ALDEÍDO-TIONINA Tionina... 0,5 grama Álcool etílico a 70%... 91,5 mililitros Paraldeído (C 6 H 12 O 3 )... 7,5 gramas Ácido clorídrico (HCl)...1 mililitro Deixe amadurecer em um frasco bem fechado por 3 a 5 dias antes de usar. O paraldeído é reagente corrosivo, facilmente inflamável, cancerígeno. O ácido clorídrico é reagente corrosivo e tóxico. Evite ingerí-los, inalá-los e o contato com a pele, mucosas e quaisquer partes do corpo. Mantenha longe de fontes de calor (paraldeído). SOLUÇÃO DE ÁCIDO PERIÓDICO A 0,5% Ácido periódico (H 5 IO 6 )... 0,5 grama Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido períódico é reagente oxidante e corrosivo. Evite ingerí-lo, inalá-lo e o contato com a pele, mucosas e quaisquer partes do corpo. REAGENTE DE SCHIFF Fucsina básica (C.I )... 1 grama Água destilada, aquecida a 60 o C... até completar 200 mililitros Leve até o ponto de ebulição. A fucsina básica é tóxica e irritante. Evite inalá-la, ingeri-la, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo. Siga os cuidados com o manuseio do metabissulfito de potássio e do ácido clorídrico já descritos anteriormente. 6

7 Esfrie e acrescente: Metabissulfito de potássio (K 2 S 2 O 5 )... 2 gramas Solução de ácido clorídrico (HCL) 1 Normal mililitros Deixe clarear por 24 horas e então acrescente: Carvão ativado... 0,5 grama Agite por 1 minuto e, a seguir, filtre várias vezes, com papel de filtro granuloso, até que fique incolor. Guarde na geladeira. SOLUÇÃO DE ORANGE G A 1% Orange G (C.I )... 1 grama Água destilada... até completar 100 mililitros SOLUÇÃO DE ÁCIDO FOSFOTÚNGSTICO A 5% Ácido fosfotúngstico [H 3 P(W 3 O 10 ) 4 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido fosfotúngstico é corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO A 1% Ácido acético glacial (CH 3 COOH)... 1 mililitro Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido acético é tóxico, corrosivo, combustível e inflamável. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. Mantenha longe de fontes de calor. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque em solução com partes iguais de ácido sulfúrico a 0,5% e permanganato de potássio a 0,5%, e deixe por 2 minutos. 3. Deixe clarear em solução de metabissulfito de potássio a 2%, por 1 minuto. 4. Lave bem com água destilada. 5. Core em solução de aldeído-tionina, num recipiente coberto e bem fechado, por no mínimo 50 minutos. 6. Lave em água destilada. 7. Oxide em ácido periódico a 0,5%, por 5 minutos. 8. Lave em água destilada. 9. Coloque em solução fresca de reagente de Schiff, e deixe por 15 minutos. 10. Lave bem em água corrente de torneira por 15 minutos. 11. Core em solução de orange G a 1% por 3 minutos. 12. Coloque em solução de ácido fosfotúngstico a 5% e deixe por 1 minuto. 13. Lave rapidamente em solução de ácido acético a 1%. 14. Desidrate e clarifique em álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto e xileno, com 2 trocas de 2 minutos em cada. 15. Monte em meio resinoso. 7

8 RESULTADOS Substância de Nissl... azul. Este procedimento é uma modificação da coloração para células da hipófise anterior e células das ilhotas pancreáticas. REFERÊNCIA PAGET, G.E. & ECCLESTON, C. - Simultaneous specific demonstration of thyrotroph, gonadotroph and acidophil cells in the anterior hypophysis. Stain Technology, 35: 120,

9 MÉTODO DE BIELCHOWSKY PARA NEUROFIBRILAS FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 8 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE NITRATO DE PRATA A 20% Nitrato de prata (AgNO 3 ) gramas Água destilada... até completar 100 mililitros Mantenha esta solução em frasco âmbar (escuro), fechado e protegido da luz. O nitrato de prata é muito tóxico, corrosivo e oxidante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. HIDRÓXIDO DE AMÔNIO CONCENTRADO SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE AMÔNIO A 1% Hidróxido de amônio (NH 4 OH) a 28%... 1 mililitro Água destilada mililitros O hidróxido de amônio é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE FORMALINA A 10% NÃO TAMPONADA Solução de formaldeído, 37%-40%, mililitros Água destilada mililitros ÁCIDO NÍTRICO (HNO 3 ), CONCENTRADO ÁCIDO CÍTRICO (C 6 H 8 O 7 ) SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO Formalina a 10%, não tamponada mililitros Água destilada mililitros Ácido nítrico, concentrado... 1 gota Ácido cítrico... 0,5 grama SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO (HIPOSSULFITO DE SÓDIO) A 5% Tiossulfato de sódio (Hipossulfito de sódio) [Na 2 S 2 O 3 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O tiossulfato de sódio é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, e com a roupa. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque na solução de nitrato de prata a 20%, pré-aquecida a 37 o C. 3. Deixe corar a 37 o C por 15 minutos. 4. Despeje a solução de nitrato de prata a 20% em um frasco e guarde-a. 5. Coloque os cortes na água destilada. 9

10 6. Na solução de nitrato de prata a 20%, despejada no frasco, acrescente 0,6 mililitros de hidróxido de amônio concentrado. 7. Clareie a solução de nitrato de prata, que deve estar negra, acrescentando, gota a gota, 1 a 3 mililitros de hidróxido de amônio concentrado, até que o precipitado formado fique claro. Não use mais que 10 mililitros de hidróxido de amônio. Um excesso do mesmo pode causar um precipitado ou resultar em uma impregnação fraca das fibras presentes nos cortes. 8. Despeje esta solução de prata amoniacal sobre os cortes e deixe corar por 15 minutos, a 37 o C, na estufa. 9. Coloque os cortes em solução de hidróxido de amônio a 1%, por 1 a 3 minutos. 10. Retorne a solução de prata amoniacal para o frasco e acrescente 10 a 25 gotas de solução de revelação. A seguir, coloque os cortes nesta solução, e deixe por 3 a 5 minutos. 11. Mergulhe os cortes na solução de hidróxido de amônio a 1%, para interromper a reação com a prata. Verifique ao microscópio. 12. Se as fibras não estiverem escuras o suficiente, mergulhe em solução de hidróxido de amônio a 1%, antes de retornar à solução de revelação com prata amoniacal, por 3 minutos. 13. Lave em solução de hidróxido de amônio a 1%, por 3 minutos. 14. Acrescente a solução de tiossulfato de sódio a 5% (solução redutora) e deixe atuar por 5 minutos. 15. Lave em água destilada, 3 trocas de 5 minutos cada. 16. Desidrate e clarifique em álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto, e xileno, com 2 trocas, por 2 minutos, em cada. 17. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Neurofibrilas e placas senis... preto. Fundo... amarelo a castanho. REFERÊNCIA MALLORY, F. B. - Pathological Technique. New York, NY: Hafner; pp

11 MÉTODO DE BODIAN PARA FIBRAS E TERMINAÇÕES NERVOSAS FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 8 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE PROTARGOL (PROTEINATO DE PRATA) A 1% Protargol... 1 grama Água destilada... até completar 100 mililitros Utilizando um recipiente previamente limpo com ácido, prepare, como a seguir: Espalhe o protargol sobre a superfície da água. Deixe ai permanecer até que todo o protargol se dissolva. Acrescente 6 gramas de esférulas de cobre, no momento de usar. SOLUÇÃO REDUTORA Hidroquinona (C 6 H 6 O 2 )... 1 grama Formalina, 37%-40%... 5 mililitros Água destilada... até completar 100 mililitros A hidroquinona é tóxica e irritante. Evite inalar, deglutir e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE CLORETO DE OURO A 1% Dissolva 1 mililitro de cloreto de ouro, da ampola, em 99 mililitros de água destilada. Para abrir a ampola primeiro sulque-a com um lápis com ponta de diamante e, então, coloque-a em um frasco grande com tampa. Acrescente metade do volume de água, cerca de 45 mililitros, feche o frasco e agiteo vigorosamente. Uma vez que a ampola tenha se partido, acrescente os 54 mililitros restantes de água e filtre. O cloreto de ouro é irritante e sensibilizante. Evite inalar, deglutir e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO A 2% Ácido oxálico (C 2 H 2 O 4 )... 2 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido oxálico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO (HIPOSSULFITO DE SÓDIO) A 5% Tiossulfato de sódio (Hipossulfito de sódio) [Na 2 S 2 O 3 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O tiossulfato de sódio é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO DE AZUL DE ANILINA Azul de anilina (C.I )... 0,1 grama Ácido oxálico... 2 gramas Ácido fosfomolíbdico H 3 P(Mo 3 O 10 ) gramas Água destilada... até completar 300 mililitros O ácido fosfomolíbdico é irritante e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. 11

12 PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque numa solução fresca de protargol e deixe ai permanecer por 72 horas, a 37 o C. 3. Lave em de água destilada, 3 trocas. 4. Coloque na solução redutora e deixe por 10 minutos. 5. Lave em água destilada, 3 trocas. 6. Dê o matiz, colocando na solução de cloreto de ouro a 1%, e deixe por 10 minutos. 7. Lave em água destilada, 3 trocas. 8. Revele na solução de ácido oxálico a 2%, por 3 a 5 minutos. 9. Lave em água destilada, 3 trocas. 10. Trate com a solução de tiossulfato de sódio a 5%, por 5 minutos. 11. Lave em água destilada. 12. Contracolore com solução de azul de anilina por 1 a 5 minutos. 13. Desidrate e clarifique através do álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto, e o xileno, por meio de 2 trocas, de 2 minutos, em cada. 14. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Fibras nervosas, mielinizadas e não-mielinizadas, e as neurofibrilas:... preto. Fundo... azul. Núcleos...preto. REFERÊNCIA LUNA, L.G.- Further studies of Bodian s technique. The American Journal of Medical Technology, 30: 355,

13 MÉTODO DE HOLMES PARA FIBRAS E CÉLULAS NERVOSAS FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÕES: SOLUÇÃO DE NITRATO DE PRATA A 20% Nitrato de prata (AgNO 3 ) gramas Água destilada... até completar 100 mililitros Mantenha esta solução em frasco âmbar, escuro, fechado e protegido da luz. O nitrato de prata é muito tóxico, corrosivo e oxidante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE NITRATO DE PRATA A 1% Nitrato de prata (AgNO 3 ) grama Água destilada... até completar 100 mililitros Mantenha esta solução em frasco âmbar, escuro, fechado e protegido da luz. SOLUÇÃO DE PIRIDINA A 10% Piridina (C 5 H 5 N) mililitros Água destilada mililitros A piridina é tóxica, inflamável e combustível. Evite inalá-la, ingeri-la, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. Afaste de fontes de calor. SOLUÇÃO DE CLORETO DE OURO A 0,2% Solução estoque de cloreto de ouro a 1% mililitros Água destilada mililitros O cloreto de ouro é irritante e sensibilizante. Evite inalar, deglutir e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO A 2% Ácido oxálico (C 2 H 2 O 4 )... 2 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido oxálico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO (HIPOSSULFITO DE SÓDIO) A 5% Tiossulfato de sódio (Hipossulfito de sódio) [Na 2 S 2 O 3 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O tiossulfato de sódio é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO TAMPÃO DE ÁCIDO BÓRICO Ácido bórico (H 3 BO 3 )...12,4 gramas Água destilada... até completar 1000 mililitros O ácido bórico é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. 13

14 SOLUÇÃO TAMPÃO DE BÓRAX Tetraborato de sódio (Na 2 B 4 O 7 ) gramas Água destilada... até completar 1000 mililitros SOLUÇÃO IMPREGNANTE Solução tampão de ácido bórico mililitros Solução tampão de bórax mililitros Água destilada mililitros Solução de nitrato de prata a 1%... 1 mililitro Solução de piridina a 10%... 5 mililitros SOLUÇÃO REDUTORA Hidroquinona (C 6 H 6 O 2 )... 1 grama Sulfito de sódio (Na 2 SO 3 ), cristais, gramas Água destilada... até completar 100 mililitros A hidroquinona e o sulfito de sódio são tóxicos e irritantes. Evite inalá-los, degluti-los e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque na solução de nitrato de prata a 20% e deixe por 2 horas. 3. Lave em água destilada, 3 trocas de 3 minutos cada. 4. Coloque na solução impregnante e mantenha a cuba coberta. Deixe por uma noite a 37 o C. 5. Tire da estufa, drene a solução e coloque os cortes em uma cuba limpa. 6. Lave gentilmente em água de torneira por 2 minutos. 7. Lave em água destilada. 8. Dê o matiz colocando na solução de cloreto de ouro por 3 minutos. 9. Lave rapidamente em água destilada. 10. Revele na solução de ácido oxálico por 3 a 5 minutos. Examine ao microscópio, mantendo os cortes úmidos com a solução de ácido oxálico até que os axônios fiquem azul escuro. 11. Lave em água destilada. 12. Coloque na solução de tiossulfato de sódio e deixe por 5 minutos. 13. Lave em água corrente de torneira por 5 minutos. 14. Desidrate e clarifique através do álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto, e o xileno, 2 trocas de 2 minutos em cada. 15. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Axônios (cilindros-eixos)... preto. Nervos e terminações nervosas... preto. Fundo... cinza a róseo. REFERÊNCIA HOLMES, W. Silver staining of nerve axons in paraffin sections. Anatomical Records, 86: 157,

15 MÉTODO (KLUVER-BARRERA) DO LUXOL FAST BLUE PARA MIELINA E CÉLULAS NERVOSAS FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 15 a 20 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE LUXOL FAST BLUE A 0,1% Luxol Fast Blue, MBS... 0,1 grama Álcool etílico a 95%... até completar 100 mililitros Dissolva o corante no álcool. Acrescente 0,5 mililitros de solução de ácido acético a 10% para cada 100 mililitros de solução. Esta solução permanece estável por meses. SOLUÇÃO DE VIOLETA DE CRESILA (ECHT) A 0,1% Violeta de cresila (echt)... 0,1 grama Água destilada... até completar 100 mililitros Logo antes de usar acrescente 15 gotas de solução de ácido acético glacial a 10%. Filtre. [Nota.: O violeta de cresila echt [cresyl echt violet (violeta de cresila autêntico, genuíno), também conhecido como cresyl fast violet] pode ser substituido pelo acetato de violeta de cresila]. SOLUÇÃO DE CARBONATO DE LÍTIO A 0,05% Carbonato de lítio (Li 2 CO 3 )... 0,0 5 grama Água destilada... até completar 100 mililitros O carbonato de lítio é tóxico quando inalado, deglutido, ou em contato com a pele e as mucosas, e pode também causar irritação e sensibilização. ÁLCOOL ETÍLICO A 70 % PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até o álcool etílico a 95%. 2. Deixe na solução de Luxol Fast Blue por uma noite, na estufa a 56 o C. 3. Lave o excesso de corante com álcool etílico a 95%. 4 Lave em água destilada. 5. Diferencie os cortes individualmente na solução de carbonato de lítio por 30 segundos. 6. Continue a diferenciação no álcool etílico a 70%, até que a substância cinzenta fique clara e a substância branca bem definida. 7. Cheque ao microscópio. Repita a diferenciação se necessária, começando pela etapa Quando a diferenciação estiver completa, coloque na água destilada. 9. Quando todos os cortes estiverem na água destilada, troque por água destilada fresca. 10. Contracolore na solução de violeta de cresila por 6 minutos. Contracoloração opcional inclui os métodos da Hematoxilina e Eosina e do Ácido Periódico-Schiff. 11. Lave em álcool etílico a 95%, 2 trocas. 12. Continue a desidratação por meio do álcool absoluto e do xileno, 2 trocas de 2 minutos em cada. 13. Monte em meio resinoso. 15

16 RESULTADOS Mielina, incluindo os fosfolipídios... azul a verde. Células e produtos celulares...rosa a violeta. O método do luxol fast blue funciona bem quando combinado com outro procedimento, como o método de Bondian. REFERÊNCIA KLUVER, H. & BARRERA, E. - A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 12: 400,

17 MÉTODO DE WOELCKE PARA A BAINHA DE MIELINA FIXADOR: Formalina a 10%, neutra e tamponada. SECÇÕES: Parafina, 20 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE SULFATO DE AMÔNIO FÉRRICO A 2,5% Sulfato de amônio férrico [FeNH 4 (SO 4 ) 2 ]... 2,5 gramas Água destilada...até completar 100 mililitros Utilize um almofariz com pistilo para quebrar os cristais grandes de sulfato de amônio férrico. O sulfato de amônio férrico é tóxico, quando inalado, deglutido, ou em contato com a pele e as mucosas, e pode também causar irritação e sensibilização. SOLUÇÃO ESTOQUE DE HEMATOXILINA ALCOÓLICA A 10% Hematoxilina, cristais, (C.I.75290)...10 gramas Álcool absoluto... até completar 100 mililitros SOLUÇÃO SATURADA DE CARBONATO DE LÍTIO Carbonato de lítio (Li 2 CO 3 )... 1,54 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O carbonato de lítio é tóxico quando inalado, deglutido, ou em contato com a pele e as mucosas, podendo também causar irritação e sensibilização. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE HEMATOXILINA Água destilada...45 mililitros Solução estoque de hematoxilina alcoólica a 10%, filtrada, mililitros Solução de carbonato de lítio, saturada, filtrada,...7 mililitros Água destilada...45 mililitros É essencial que a mistura dos ingredientes seja feita na ordem dada. NÃO AGITE. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque na solução de sulfato de amônio férrico a 2,5% e deixe por uma noite. 3. Lave em água destilada, 2 trocas. 4. Colore na solução de trabalho de hematoxilina por 2 horas. 5. Diferencie em álcool etílico a 80% até que o fundo fique claro. 6. Desidrate e clarifique, através de 2 trocas de 2 minutos cada, em álcool etílico a 95%, álcool absoluto, e xileno. 7. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Bainha de mielina e núcleos... preto. Células gliais... preto. Fundo... claro. 17

18 MÉTODO DE HIRSCH-PEIFFER PARA LEUCODISTROFIA METACROMÁTICA FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 12 a 20 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO ESTOQUE DE VIOLETA DE CRESILA V A 0,04% Violeta de cresila V... 0,04 grama Água destilada mililitros Ácido acético, glacial mililitros SOLUÇÃO DE TRIETANOLAMINA (2,2,2" NITRILOTRIETANOL) A 15% Trietanolamina mililitros Água destilada mililitros SOLUÇÃO DE TRABALHO DE VIOLETA DE CRESILA-TRIETANOLAMINA Combine partes iguais das soluções de violeta de cresila V e de trietanolamina a 15%, i. é., 100 mililitros de cada. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Pré-aqueça a solução de trabalho de violeta de cresila-trietanolamina a 15%, a 60 o C na estufa, por 1 hora. 3. Core na solução de trabalho pré-aquecida a 60 o C de violeta de cresila-trietanolamina a 15%, na estufa, por 10 minutos. 4. Retire da estufa. Deixe esfriar à temperatura ambiente (20 a 25 minutos). 5. Transfira para a água destilada. 6. Lave em água destilada, 2 trocas de 5 minutos cada. 7. Monte com glicerina espessada. RESULTADOS Sulfetos anormais... marrom. Outras estruturas tissulares... azul a castanho. REFERÊNCIA HIRSCH, V. & PEIFFER, J. - A histochemical study of the prelipid in metachromatic degenerative products in leucodystrophy. In: CUMINGS, J.N. (ed.) - Cerebral Lipidosis. Oxford, England, Blackwells; 1957, pp

19 PROCEDIMENTO DA HEMATOXILINA-ÁCIDO FOSFOTÚNGSTICO FIXADOR: Formalina A 10%, neutra, tamponada. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE HEMATOXILINA-ÁCIDO FOSFOTÚNGSTICO Hematoxilina... 1 grama Ácido fosfotúngstico [H 3 P(W 3 O 10 ) 4 ] gramas Água destilada... até completar 1000 mililitros O ácido fosfotúngstico é corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. Dissolva os ingredientes sólidos em porções de água destilada. A hematoxilina dissolver-se-á mais prontamente com o auxílio de calor. Quando fria, pode ser combinada com a mistura de ácido fosfotúngstico e água. Nenhum preservativo é necessário. O amadurecimento usualmente requer várias semanas, porém a adição de 0,2 grama de permanganato de potássio irá amadurecer o corante imediatamente. Um método alternativo de amadurecimento imediato é o uso de 20 mililitros de solução fresca de permanganato de potássio a 1%. SOLUÇÃO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO A 0,25% 0,25 gramas de permanganato de potássio (KMnO 4 ) em 100 mililitros de solução com água destilada, ou 1 grama de permanganato de potássio em 400 mililitros de solução com água destilada. O permanganato de potássio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO IODO DE LUGOL Iodo (I 2 )... 1 grama Iodeto de Potássio (KI)... 2 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O iodo e as soluções de iodo são tóxicos e corrosivos. Evite inalar os vapores e o contato com a pele e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO A 5% Ácido oxálico (C 2 H 2 O 4 )... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O ácido oxálico é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO ESTOQUE DE DICROMATO DE POTÁSSIO A 2,5% Dicromato de potássio (K 2 Cr 2 O 7 )... 2,5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O dicromato de potássio é tóxico, irritante, sensibilizante e oxidante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE TRABALHO DE DICROMATO DE POTÁSSIO Solução de dicromato de potássio a 2,5% mililitros Ácido acético glacial... 5 mililitros 19

20 PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Oxide os cortes na solução de trabalho de dicromato de potássio, deixando por uma noite. 3. Lave gentilmente em água corrente de torneira por 15 minutos. 4. Coloque na solução de iodo de Lugol e deixe por 15 minutos. 5. Coloque na solução de álcool a 95%, por 1 hora, para remover o iodo. A cor acastanhada do iodo é removida por meio de várias trocas do etanol a 95%. 6. Lave rapidamente em água destilada, 3 trocas. 7. Oxide em solução de permanganato de potássio a 0,25% por 5 minutos. 8. Lave rapidamente em água destilada, 3 trocas. 9. Coloque na solução de ácido oxálico a 5%, e deixe por 5 minutos. 10. Lave rapidamente em água destilada, 3 trocas. 11. Colore em solução de hematoxilina-ácido fosfotúngstico, deixando agir por 1 noite. 12. Lave em álcool etílico a 95% para ser removido o excesso de corante. 13. Desidrate rapidamente em álcool absoluto, 3 trocas. 14. Clarifique com xileno, 3 trocas de 3 minutos cada. 15. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Núcleos, bainhas de mielina, e processos das células gliais... azul. Citoplasma... rosa. 20

21 MÉTODO DE PENFIELD COMBINADO PARA OLIGODENDROGLIA E MICROGLIA FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada; formalina-brometo de amônio. SECÇÕES: Congelação, 15 a 20 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE FORMALINA-BROMETO DE AMÔNIO Formaldeído, 37% - 40% mililitros Brometo de amônio (NH 4 Br)... 2 gramas Água destilada mililitros SOLUÇÃO DE ÁCIDO BROMÍDRICO A 5% Ácido bromídrico (HBr)... 5 mililitros Água destilada mililitros O ácido bromídrico é tóxico, irritante, sensibilizante e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE CARBONATO DE SÓDIO A 5% Carbonato de sódio (Na 2 CO 3 )... 5 gramas Água destilada...até completar 100 mililitros O carbonato de sódio é tóxico, irritante e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE NITRATO DE PRATA A 10% Nitrato de prata (AgNO 3 ) gramas Água destilada... até completar 100 mililitros Mantenha esta solução em frasco âmbar (escuro) fechado e protegido da luz. O nitrato de prata é muito tóxico, corrosivo e oxidante. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. HIDRÓXIDO DE AMÔNIO CONCENTRADO (NH 4 OH) [solução de gás amônia (NH 3 ) em água] O hidróxido de amônio é tóxico e corrosivo. Evite inalá-lo, ingeri-lo, e o contato com a pele, mucosas, e quaisquer partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE CARBONATO DE PRATA DE HORTEGA Solução aquosa de nitrato de prata a 10%... 5 mililitros Solução aquosa de carbonato de sódio a 5% mililitros Acrescente solução de hidróxido de amônio a 28%, gota a gota. Agite vigorosamente, adicionando quantidade suficiente de hidróxido de amônio para dissolver o precipitado que se forma. Acrescente água destilada até o volume total de 75 mililitros. SOLUÇÃO DE FORMALINA A 1% Formaldeído, 37% - 40%... 1 mililitro Água destilada mililitros 21

22 SOLUÇÃO ESTOQUE DE CLORETO DE OURO A 1% Dissolva 1 mililitro de cloreto de ouro (Au Cl 3 ), da ampola, em 99 mililitros de água destilada. Para abrir a ampola primeiro sulque-a com um lápis com ponta de diamante e, então, coloque-a em um frasco grande com tampa. Acrescente metade do volume de água, cerca de 45 mililitros, feche o frasco e agite-o vigorosamente. Uma vez que a ampola tenha se partido, acrescente os 54 mililitros restantes de água, e filtre. O cloreto de ouro é irritante e sensibilizante. Evite inalar, deglutir e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO (HIPOSSULFITO DE SÓDIO) A 5% Tiossulfato de sódio (Hipossulfito de sódio) [Na 2 S 2 O 3 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O tiossulfato de sódio é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. PROCEDIMENTO 1. Coloque os tecidos, fixados em formalina, na solução de formalina-brometo de amônio por 3 a 5 dias. 2. Monte os cortes em lâminas limpas e previamente identificadas. Seque completamente. 3. Coloque em água destilada, onde foram acrescentadas 10 a 15 gotas de hidróxido de amônio concentrado, e deixe por uma noite para remover os traços de formalina. 4. Transfira para a solução de ácido bromídrico e deixe na estufa, a 37 o C, por 1 hora. 5. Tire da estufa e lave em água destilada, 3 trocas. 6. Trate com a solução de carbonato de sódio por 1 hora. Os cortes podem permanecer na solução de carbonato de sódio sem que haja dano. 7. Coloque na solução de carbonato de prata. Deixe reagir por 3 a 5 minutos. Avalie ao microscópio a impregnação das células gliais, incluindo seus prolongamentos. Seque bem o dorso da lâmina antes de colocá-la no microscópio. 8. Coloque na solução de formalina a 1% até os cortes ficarem uniformemente cinzas. Agite gentilmente. 9. Lave totalmente em água destilada. 10. Coloque na solução de cloreto de ouro. Deixe até os cortes ficarem azul-acinzentados. 11. Lave completamente em água destilada. 12. Fixe com a solução de tiossulfato de sódio por 30 a 45 segundos. 13. Lave em água destilada. 14. Desidrate e clarifique em álcool etílico a 95%, álcool etílico absoluto e em xileno, 2 trocas de 2 minutos em cada. 15. Monte com meio resinoso. RESULTADOS Oligodendrócitos e microglia... preto. Fundo... marrom a amarelo. REFERÊNCIA PENFIELD, W. - A method of staining oligodendroglia and microglia (combined method). The American Journal of Pathology, 4: 153,

23 MÉTODO DE HOLZER PARA FIBRAS GLIAIS FIXADOR: Formalina a 10%, neutra, tamponada, ou formol-álcool. SECÇÕES: Parafina, 6 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO ETANOL-ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICO Ácido fosfomolíbdico [H 3 P(Mo 3 O 10 ) 4 ] mililitros Álcool etílico mililitros O ácido fosfomolíbdico é irritante e corrosivo. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. SOLUÇÃO ETANOL ABSOLUTO - CLOROFÓRMIO Etanol absoluto mililitros Clorofórmio (CHCl 3 ) mililitros EVITE INALAR OS VAPORES DO CLOROFÓRMIO, ASSEGURANDO ADEQUADA VENTILAÇÃO. O clorofórmio é tóxico e pode causar sérios e imediatos danos à saúde. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e a roupa. SOLUÇÃO DE VIOLETA CRISTAL Violeta cristal (C.I )... 5 gramas Etanol absoluto mililitros Clorofórmio (CHCl 3 ) mililitros EVITE INALAR OS VAPORES DO CLOROFÓRMIO, ASSEGURANDO ADEQUADA VENTILAÇÃO. O clorofórmio é tóxico e pode causar sérios e imediatos danos à saúde. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e a roupa. SOLUÇÃO DE BROMETO DE POTÁSSIO Brometo de potássio (KBr) gramas Água destilada... até completar 100 mililitros É mais econômico preparar 1000 mililitros desta solução de uma vez, i. é., 100 gramas de brometo de potássio diluidos em água destilada até o volume final de 1000 mililitros. SOLUÇÃO DIFERENCIADORA Anilina (C 6 H 5 NH 2 ) mililitros Clorofórmio (CHCl 3 ) mililitros Hidróxido de amônio (NH 4 OH) a 28% gotas EVITE O CONTATO COM A PELE QUANDO USAR ANILINA. EVITE INALAR OS VAPORES DO CLOROFÓRMIO, ASSEGURANDO ADEQUADA VENTILAÇÃO. A anilina e o clorofórmio são tóxicos e podem causar sérios e imediatos danos à saúde (a anilina e derivados podem causar câncer de bexiga). O hidróxido de amônio é tóxico e corrosivo. Evite inalá-los, degluti-los e o contato com a pele, mucosas e a roupa. PROCEDIMENTO 1. Desparafine e hidrate até a água destilada. 2. Coloque na solução de etanol - ácido fosfomolíbdico e deixe por 3 minutos. 3. Drene. 4. Coloque na solução de etanol - clorofórmio e deixe até que os cortes fiquem translúcidos. 23

24 5. Coloque as lâminas em um berço, imerja-as na solução de cristal violeta e deixe por 30 segundos. Seque com papel absorvente. Se um precipitado de cristal violeta formar-se nos cortes, este pode ser removido com anilina não diluida. 6. Retorne as lâminas para o berço. 7. Imerja os cortes na solução de brometo de potássio e deixe por 1 minuto. Seque com papel absorvente. 8. Coloque na solução diferenciadora e deixe por 30 segundos. Se ocorrer excessiva diferenciação, recolore. 9. Lave e clarifique em vários banhos de xilol. Cheque as lâminas ao microscópio após o primeiro banho de xilol. 10. Monte em meio resinoso. RESULTADOS Células e fibras gliais... violeta-escuro. Fundo... violeta-claro. REFERÊNCIA HOLZER, W. - Uber eine neue methode der gliofaser-farbung. Zeitschrift für die gesamte Neurologie und Psychiatrie, 69: 354,

25 MÉTODO DO OURO SUBLIMADO DE CAJAL PARA ASTRÓCITOS FIXADOR: Formalina - brometo de amônio. SECÇÕES: Congeladas, 15 a 30 micrômetros. SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE FORMALINA-BROMETO DE AMÔNIO Formaldeído, 37% - 40%...15 mililitros Brometo de amônio (NH 4 Br)...2 gramas Água destilada mililitros SOLUÇÃO DE OURO SUBLIMADO DE CAJAL Bicloreto de mercúrio (HgCl 2 ), cristais,... 0,5 grama Solução aquosa de cloreto de ouro a 1%, marrom,... 6 mililitros Água destilada mililitros Mantenha em frasco âmbar (escuro),fechado. O cloreto de ouro é irritante e sensibilizante. O bicloreto de mercúrio é muito tóxico. Evite inalá-los, degluti-los e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, além da roupa. SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO (HIPOSSULFITO DE SÓDIO) A 5% Tiossulfato de sódio (Hipossulfito de sódio) [Na 2 S 2 O 3 ]... 5 gramas Água destilada... até completar 100 mililitros O tiossulfato de sódio é irritante, tóxico e sensibilizante. Evite inalá-lo, degluti-lo e o contato com a pele, mucosas e outras partes do corpo, e com a roupa. MISTURA DE CREOSOTO-XILENO-FENOL DE HORTEGA Creosoto mililitros Fenol, cristais fundidos (C 6 H 5 OH) mililitros Xileno mililitros O creosoto é tóxico, cancerígeno e irritante. O fenol é tóxico, corrosivo e irritante. O xileno é tóxico, inflamável, irritante e sensibilizante. Evite inalá-los, ingeri-los e o contato com a pele, mucosas e quaisquer partes do corpo, além da roupa. PROCEDIMENTO 1. Colete os cortes congelados para uma cuba com água destilada. 2. Coloque os cortes na posição horizontal e na solução de cloreto de ouro sublimado recém-preparada. Deixe agir por 4 a 6 horas, em ambiente escuro e à temperatura ambiente. 3. Cheque um dos cortes ao microscópio, quando as secções tornarem-se púrpuras. 4. Lave-os em água destilada por 5 a 10 minutos. 5. Coloque-os na solução de tiossulfato de sódio e deixe por 5 a 10 minutos. 6. Lave-os bem com várias trocas da água destilada. 7. Capture individualmente os cortes para lâminas de vidro limpas. 8. Deixe-os secar ao ar. 9. Inicie a desidratação com o álcool etílico a 95%. 10. Clarifique na mistura de creosoto-xileno-fenol, ou desidrate e clarifique completamente usando etanol a 95%, etanol absoluto e xileno; 2 trocas de 2 minutos em cada. 11. Monte em meio resinoso. 25

26 RESULTADOS Astrócitos e seus prolongamentos... preto. Neurônios...vermelho-claro. Fibras nervosas... não coradas. Fundo... claro a púrpura-acastanhado. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA PRINCIPAL Downing, A. E. - Neuropathological Histotechnology, In: Prophet, E. B.; Mills, B.; Arrington J.B. & Sobin, L.H., (eds.) AFIP - Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology,