AVALIAÇÃO DO LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO (LCR) POR CITOMETRIA DE FLUXO

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1 AVALIAÇÃO DO LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO (LCR) POR CITOMETRIA DE FLUXO Maria Daniela Périco Colombo LABORATÓRIO DE MARCADORES CELULARES HEMOSC FLORIANÓPOLIS

2 Declaração de Conflito de Interesse O apresentador declara não ter conflitos de interesse relacionados a esta apresentação.

3 INTRODUÇÃO

4 LCR Composição: ultrafiltrado de plasma: 99% água; baixa concentração de glicose, proteínas e aa Volume total: mL crianças 4 a 13 anos; mL adultos Renovação diária (500mL/dia 0,5mL/min) Coleta: 3-5mL, 1-2mL em crianças (reconstituição em 1h) 3 tubos estéreis: - 1º análises bioquímicas / sorológicas; - 2º culturas; - 3º: contagem celular (menor contaminação SP). Estud Biol.2009 (73/74/75)93-102

5 Celularidade do LCR Estudos de LCR normais de crianças com menos de 3 meses com punção lombar não traumática e cultura negativa: contagem média de leucócitos 4,3/mm3 (0-12/mm3). Contagem média significativamente mais elevada no primeiro mês, em comparação com os meses 2 e 3, respectivamente (6,1 / mm3 vs. 3,1 / mm3 e 3,0 / mm3). Após 2 meses de idade: 0-5 / mm3. Em todas as idades deve ser <1 / mm3. William Bonadio, J Emerg Med. 2014;46(1):

6 Celularidade do LCR Até 200 leucócitos/μl e 400 hemácias/μl CÉLULA LCR MÉDIA (cels/µl) FAIXA (cels/µl) Leucócitos 1,12 0,40-3,17 Granulócitos 0,08 0,02-0,43 Monócitos 0,23 0,08-1,11 Linfócitos T 0,62 0,15-1,83 CD4 0,44 0,08-1,43 CD8 0,13 0,04-0,40 Linfócitos B 0,00 Até 0,03 NK / NKT 0,02 0,0-0,11 Céls.Dendríticas 0,04 0,00-0,03 Estud Biol.2009 (73/74/75) Cytometry Part B 80B: (2011)

7 Celularidade do LCR vezes menor que a do SP Predomínio de Linfócitos TCD4+ centrais de memória (90% CD45RA(-) CD27/28+) recrutamento seletivo ( supervisão imunológica do SNC). Frequência muito baixa de células NK e dendríticas Células dendríticas: mielóides > plasmocitóides; relativamente mais abundantes no LCR do que no SP aumento nas doenças neuroinflamatórias Número de Linfócitos B em geral ABAIXO DO LIMITE DE DETECÇÃO (média 0,004 x 10 6 /L) Cytometry Part B 80B:43-50 (2011).

8 Envolvimento do LCR nas Doenças OncoHematológicas

9 Envolvimento do LCR nas LMAs Incidência menor que 5% pelo uso da Citarabina em altas doses (penetração SNC). Mais comum: LMAs com componente monocítico, LPA recidivada, LMA com inv(16) ou anormalidades do cromossomo 11, hiperleucocitose / LDH elevada, pacientes com menos de 2 anos de idade, blastos CD56+ (molécula de adesão). UpToDate 2016

10 Envolvimento do LCR nas LLAs Incidência: 2% apresentação / 30-40% 1ªrecaída A maioria das recidivas em SNC ocorre em pacientes SEM envolvimento de SNC ao diagnóstico POR QUÊ se todos os protocolos são desenhados com profilaxia SNC?? Limitações do tto: Baixa penetração de drogas Antileucêmicas no SNC RxT SNC: efeitos neurotóxicos agudos e a longo prazo: Deficit neurocognitivo; Endocrinopatias; Neoplasia 2ª J Clin Oncol 25: Leukemia (2010) 24, Blood, 28 May 2015 x Vol125, N 22

11 Envolvimento do LCR nas LLAs Propriedades endógenas dos Linfoblastos = NEUROTROPISMO Mecanismos de migração dos linfoblastos para o LCR são desconhecidos SNC santuário imunológico para linfoblastos (proteção contra ação das células NK) Expressão elevada de IL-15 e Polimorfismos associados a: Resistência ao tratamento de indução Recidiva SNC em crianças Envolvimento de mediastino em adultos Leukemia (2010) 24, Blood, 28 May 2015 x Vol125, N 22 NEJM 354;2 January 12, 2006

12 Mecanismos de migração dos Linfoblastos para o LCR Linfoblastos localizados nas veias aracnoideas superficiais aumento progressivo da leucometria ruptura da trabécula aracnoídea entrada de Linfoblastos no LCR IL-15 é produzida no SNC por células da glia Altos níveis de IL-15 aumentam a interação dos Linfoblastos com a barreira hematoencefálica, ajudando a promover a invasão do SNC Ambiente com teor proteico muito baixo ( serum starvation ) efeito antiapoptótico da IL-15 BLOOD, 15 MAY 2014 x VOL 123 N20 J Clin Oncol 25:

13 Envolvimento do LCR nas LLAs Diagnóstico - ALL IC-BFM 2002 SNC1 (-): Ausência de evidência clínica / radiológica de alteração de SNC (TC/ RNM normal; fundo de olho normal, líquor (-) SNC2 (-): RBC:WBC 100:1 com cel 5/L Punção lombar traumática (RBC:WBC >100:1) SNC3 (+): Tumor TC / RNI - Paralisia de par craniano Envolvimento de retina Punção lombar não-traumática com cel >5/L e predomínio de blastos

14 Envolvimento do LCR nas LLAs Risco aumentado de recaídas de SNC em pacientes pediátricos: Fenótipo T, pró-b; Hiperleucocitose; Raça negra; Anormalidades genéticas de alto risco: Ph+, t(4; 11) MLL-AF4, t(1;19)(tcf3-pbx1); presença de células leucêmicas em LCR (incluindo introdução iatrogênica por punção lombar traumática) SNC2 e 3. Ching-Hon Pui: Ash 2006; N Engl J Med 2006;354: N Engl J Med 2009;360;26

15 Envolvimento do LCR nos Linfomas LÑH associados com envolvimento do SNC (taxa de infiltração do SNC estimada no diagnóstico 1% a 21%) incluem: alto grau histopatológico; neoplasias de células B agressivas - ex.burkitt: estágios III/IV 70% dos casos. Uma das patologias de maior taxa de proliferação celular conhecidas envolvimento testicular, de medula óssea ou anel de Waldeyer; massa bulky retroperitoneal (10 cm); aumento da LDH. J Clin Oncol 27:

16 Meningite Química Efeito adverso neurológico do ITMTX. RxT SNC ou SNC+ danos diretos na barreira hematoencefálica, aumentando a permeabilidade ao MTX e subseqüente toxicidade. Inicialmente atribuída à presença de conservantes, ocorre pelo MTX per se. >Incidência número de ITMTX e dose. LCR: varia de predomínio de células mononucleares a polimorfonucleares simulando meningite infecciosa. Sintomas iniciam 4 a 72 horas após ITMTX: cefaléia, vômitos, rigidez de nuca, fotofobia, delírio e obnubilação. Recuperação espontânea. Ann Indian Acad Neurol 2015 Apr-Jun;18(2)

17 ANÁLISE DO LCR POR CITOMETRIA

18 DIFICULDADES PARA ANÁLISE DE LCR Problemas Soluções Pequeno volume Baixa celularidade Poucos tubos Muitos marcadores Rápida degradação celular Meios de estabilização

19 Pequeno volume Baixa celularidade Análise Citológica convencional (CC) = alta especificidade porém sensibilidade limitada com 20 a 60% resultados falso-negativos Citometria de Fluxo (CF): Maior sensibilidade e alta especificidade Comparação CC x CF: Aquisição de eventos por CF mesmo em amostras com leucometria ZERO Cytometry Part B 80B: (211). J Clin Oncol 27:

20 Pequeno volume Baixa celularidade Concentração da amostra com técnicas de centrifugação de baixa velocidade; Aquisição de maior número de eventos possível; Análise simultânea de vários marcadores (8FLs) Resultados: <10 eventos = NEGATIVO eventos = SUSPEITO >25 eventos = POSITIVO Cytometry Part B 80B: (211).

21 Painéis Euroflow

22 Painéis Euroflow - LLA

23 Rápida degradação celular Início: após 30 minutos de coleta Após 90 minutos apenas 10% de células viáveis Monócitos e Granulócitos: primeiros a sofrer degradação Causa: difusão de CO2 aumento de ph + hipotonicidade do LCR (baixa pressão oncótica infusão de água para espaço intracelular) Amostras com pleocitose analisadas após 1 hora de coleta podem ser erroneamente consideradas normocelulares

24 Rápida degradação celular Ferramentas de Citometria Identificação de restos celulares: Debris celulares, hemácias, plaquetas, bolhas de ar: SSC x FSC FSC-A x FSC- H 7AAD (Amino Actinomcina D): não cora células viáveis; liga-se à dupla hélice do DNA (G-C)

25 Rápida degradação celular Uso de Meios de estabilização Transfix Preconizado pelo Euroflow Coletar 2mL de LCR diretamente em tubo estéril contendo 0,4mL de Transfix (1/5) Pode ser armazenado a 4ºC por 48 72h CUSTO: $12,00 / 1mL Curr Protocols Cytometry 6.25 Jul 2008 Cytometry Part B 86B:

26 Rápida degradação celular Uso de Meios de estabilização RPMI-1640 HEPES Utilizado na Hemorrede SC Coletar 2mL de LCR diretamente em tubo estéril de 15mL contendo 2mL de RPMI Pode ser armazenado a 4ºC por até 18h CUSTO: $0,26/teste Cur Protocols Cytometry 6.25 Jul 2008 Cytometry Part B 86B:

27 Contaminação do LCR por Sangue Periférico Células detectadas são da amostra de LCR ou foram introduzidas por punção traumática? Avaliação concomitante de SP e MO (se disponíveis) Estud Biol.2009 (73/74/75)93-102

28 CASOS CLÍNICOS LLA - B

29 K.G.P.P., 11 a, 10Leuco/mm3

30 H.S.R.P., 10 anos, Jvlle, 80% Viab, Cel 2,0/mm3

31 A.S.A.; 32 anos; TMO alogênico 2015, Outubro 2016 Cefaléia intensa; Leuco 2,6; Viab.98%

32 CASOS CLÍNICOS LLA T C.J.D., 26a, procedente de Fpolis Viabilidade 90-99%

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36 CASOS CLÍNICOS LINFOMA BURKITT S.S., adulto, procedente de Blumenau Baixa viabilidade (40%), 0,1/mm3 X Boa viabilidade (80%), 0,1/mm3

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39 CASOS CLÍNICOS LINFOMA BURKITT J.L.N., adulto, procedente de Fpolis Diplopia + Cefaléia

40 Viab 98%, Cel 1,0/mm3

41 Viab 85%, Cel 0,1/mm3

42 Viab 85%, Cel 0,0/mm3

43 Viab 85%, Cel 0,1/mm3

44 Considerações Finais

45 Envolvimento LCR: estágios clínicos mais avançados alto risco pior evolução Avaliação fundamental porém amostra problemática Para minimizar problemas de análise: Coletar de volume adequado último tubo para citometria (menor contaminação por SP) Dados clínicos / Hemograma do dia da coleta de LCR quando disponível Coleta distante do laboratório de CF considerar uso de meios de estabilização

46 Laboratório de Marcadores Celulares Hemosc Florianópolis Obrigada!