Pesquisa da Doença Residual Mínima M Leucemia Promielocítica Aguda. Eduardo M. Rego Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo
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1 Pesquisa da Doença Residual Mínima M na Leucemia Promielocítica Aguda Eduardo M. Rego Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo
2 Alterações Citogenéticas Alteração t(15;17)(q22;q21) t(11;17)(q23;q21) t(11;17)(q13;q21) t(5;17)(q35;q21) duplicação intersticial da 17q21-q23 q23 t(4;17)(q12;q21) 17 (17q24 ) Gene Híbrido PML/RARa PLZF/RARa NuMA/RARa NPM/RARa STAT5b/RARa FIP1L1/RARa PRKAR1A/RARa RARa Frequência Estimada > 98% ~ 1% < 1% < 1% um caso um caso Um caso
3 Pontos de Quebra PML Exon 3 PML Exon 4 PML Exon 5 PML Exon RARa Exon Bcr1 ~ 55% PML Exon 3 PML Exon PML Exon 4 PML Exon 5 PML Exon PML Exon 4 PML Exon PML Exon RARa Exon 3 RARa Exon Bcr2 ~ 5% Bcr3 ~ 40%
4 Frequência dos subtipos de bcr de acordo com a população Bcr1 Bcr2 Bcr3 Doeur et al., 2003 Não Latinos Latinos (n=1429) Latinos Latinos (n=52) 52% 75% 8% 10% 40% 15% Ribeiro & Rego, 2006 Brasileiros (n=72) 52.7% 9.7% 37.5%
5 Subtipo bcr3 Correlações Clínicas Mais frequente na variante hipogranular Sem características imunofenotípicas particulares Contagens de leucócitos citos mais elevadas Pior prognóstico Maior frequência de síndrome retinóide ide
6 Marcadores Marcadores Doença Residual Mínima Especificidade Sensibilidade Mais de fenótipo ou genótipo Mudanças as ao longo do monitoramento Protocolo de Tratamento Que combinação de tratamento? Em que pontos serão colhidas as amostras? Sangue ou medula óssea? Qual o valor limítrofe (cut cut-off off)? valor prognóstico
7 Tratamento Estudo N Idade CR pósindução OS/EFS 4 anos (%) Recaída em 4 anos (%) APL (ATRA-QT) / (ATRA+QT) / (GB<5000) / (GB>5000) /60 39 MRC (5d ATRA- QT) (ATRA+QT até CR) AIDA /79 2anos n.r. PETHEMA n.r. 6,4 (baixo risco) AMLCG (<60a) / (>60a) /54 17
8 Terapia Padrão INDUÇÃO ATRA + Antracíclico CONSOLIDAÇÃO ATRA + Antracíclico Adição de Citarabina? Papel do As 2 O 3? MANUTENÇÃO Ciclos alternados ATRA MTX + 6MP
9 Fatores de mau prognóstico Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA) Blood 2004; 103: Baixo risco: GB<10.000/µl e Plt>40.000/ >40.000/µl Alto risco: GB / /µl Risco intermediário: rio:gb<10.000/ GB<10.000/µl e Plt<40.000/ <40.000/µl
10 Risco de recaída
11 IC-APL
12 Caso 1. Paciente FAS RT PCR M 100 pb 1 2 * C+ * PMLC2-RARaD 289pb (Bcr3) Primers BIOMED-1 PMLC2 RARAD Tratado com Protocolo IC-APL 1 - Positivo ao diagnóstico (05/06/2008); 2- Positivo no final de indução (03/07/2008), mas em remissão hematológica com contagens normais no SP e sem alterações na avaliação da coagulação
13 Qual a melhor conduta? Prolongar o tratamento com ATRA mais 15 dias e repetir o exame Interromper o tratamento com ATRA e após 15 dias repetir o exame Intensificar o tratamento (p.ex. HDAC) Introduzir o Trióxido de Arsênico Ignorar o exame Viu? Quem mandou colher o exame...
14 Diverio D et al., Estudo GIMEMA e AIEOP al., Blood, Vol 92, No 3 (August 1), 1998: pp Análise prospectiva de 163 pacientes com LPA RT-PCR Sensibilidade Amostras de M.O. colhidas ao diagnóstico, após indução, após consolidação, a cada 3 m nos dois primeiros anos e a seguir a cada 6m Resultados 60% dos pacientes tornaram-se RT-PCR negativos ao final da indução 96% dos pacientes tornaram-se RT-PCR negativos ao final da consolidação Não houve resistência primária
15 Estudo GIMEMA e AIEOP Dos 21 pacientes RT-PCR + após a consolidação 20 recaíram ram (média 3m)
16 Caso 1. Paciente FAS RT PCR M 100 pb * C+ * * C+ 289pb (Bcr3) Primers BIOMED-1 PMLC2 RARAD Tratado com Protocolo IC-APL 1 - Positivo ao diagnóstico (05/06/2008); 2- Positivo no final de indução (03/07/2008) 3-Negativo no final da consolidação (07/08/2008) 4-Negativo novembro de 2008 e fevereiro de 2009
17 Conclusões O resultado positivo no final da indução não tem significado prognóstico Ao contrário rio do final da consolidação. Cut- off: positivo Os estudos na literatura avaliaram M.O. A sensibilidade do teste deve ser aferida (10-4 ) Controles sempre devem ser incluídos Falsos positivos não são incomuns
18 Definição de 3 termos Remissão Molecular Persistência Molecular Recaída Molecular Conclusões Exigem a repetição do exame em segunda amostra colhida após 15 dias
19 Real-Time PCR Exame mais sensível Avalia a fase inicial da amplificação Melhor avaliação dos genes controle (housekeeping housekeeping) Permite o estudo da cinética
20 Quociente de Normalização Santamaría a C. et al., Gabert J. et al., Cassinat et al. Gallagher RE et al., al., Haematologica 2007 vol. 92, pp: al., Leukemia 2003 vol. 17, pp: al. Leukemia Res 2009 al., Blood 2003 vol. 101, pp: Diluições seriadas de plasmídeos contendo PML/RARa (bcr1, bcr3) Diluições seriadas de plasmídeos contendo o gene endógeno (Abl Abl-1, GUS, B2M, GAPDH) NQ: 1 cópia PML/RARa / 1 cópia Abl1 ou GUS, mas para 100 cópias do B2M
21 Real-Time PCR para PML/RARa Proporção de falsos positivos: ~10% Proporção de falsos negativos: 0% Gabert J. et al., Leukemia 2003 vol. 17, pp:
22 Diferentes Controles e Tecidos Ao Diagnóstico Gabert J. et al., Leukemia 2003 vol. 17, pp:
23 PETHEMA NQ: PML/RARa RARa/ABL x amostras de M.O. e 145 de S.P. Durante manutenção e após o final do tratamento NCN média ao diagnóstico ~ 3000 cópias Comparação RQ vs RT-PCR Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp:
24 Indução Nem a carga tumoral ao diagnóstico nem a cinética de redução pós indução correlacionaram-se a SLD. Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp:
25 Manutenção 19/19 pacientes com NCN > 10 recaíram ram todos RT-PCR positivos 6/18 pacientes com NCN recaíram, ram, 8 eram RT positivos, com 3 falsos positivos e 1 falso negativo) 0/101 pacientes com NCN < 1 recaíram, ram, 2 eram RT positivos (falsos positivos)
26 Estratificação de Risco Segundo o NCN Após o Tratamento Na Manutenção Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp:
27 Cassinat et al. Sangue ou Medula? Outro housekeeping (PBGD) gerou 3 faixas de NCN <10, e > 100 Baseado em análise em duplicadas/triplicatas Maior número de amostras de sangue foram estudadas Para amostras com NCN>10, 7-SP e 17-MO 4 amostras pareadas: 2 falsos negativos no SP No estudo do PETHEMA em 7 pacientes que recairam houve uma diferença de 24 a 35 dias entre a conversão na MO e no SP
28 Caso NCN PML/RARa / ABL Diag Indução Consol Manut 1
29 1 Diagnóstico 2a 2b 2c Br * M100pb Br Br * C+ Br Br * C+ Br * C+ C+ M100pb Consolidação 289pb 720pb 576pb 246pb 253pb 355pb PMLC2-RARD PML-PML RARa-RARa PML/RARa Br 3 Manutenção X C+ Br Br * * C+ Br Br * X Y Z C+ 545pb 289pb 289pb PMLC2-RARE3 PMLC2-RARD PMLC2-RARD 3 meses após resgate com arsênico ~6 meses após resgate com Mylotarg
30 Extra 6 Extra Caso 2. CP Manut 1 Manut 2 Manut 3 Manut 4 Consol Indução Diag NCN PML/RARa / ABL
31 Conclusões A pesquisa da DRM deve ser feita após consolidação A técnica de RQ-PCR possui menor variabilidade e maior sensibilidade, mas exige a normalização As evidências sugerem que o estudo da M.O. é superior É possivel distinguir 3 grupos de pacientes com prognósticos distintos com base no NCN
32 Obrigado.
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