ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ÓLEO ESSENCIAL DE TOMILHO EM FILMES BIODEGRADÁVEIS DE ISOLADO PROTEICO DE SORO DE LEITE E NANOFIBRAS DE CELULOSE

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1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ÓLEO ESSENCIAL DE TOMILHO EM FILMES BIODEGRADÁVEIS DE ISOLADO PROTEICO DE SORO DE LEITE E NANOFIBRAS DE CELULOSE CAMILA FERREIRA GONÇALVES PEREIRA 1, VIVIANE MACHADO AZEVEDO 2, NAYANE APARECIDA ARAÚJO DIAS 3, ROBERTA HILSDORF PICCOLI 4, SORAIA VILELA BORGES 5 1 Graduação, Departamento de Ciência dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 2 Doutorado, Departamento de Ciência dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 3 Doutorado, Departamento de Ciência dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 4 Pesquisador, Departamento de Ciência dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 5 Pesquisador, Departamento de Ciência dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras RESUMO Embalagens ativas são embalagens que interagem, de alguma forma, com o alimento por ela embalado com diversas finalidades. Filmes a base de isolado proteico de soro de leite adicionados de óleo essencial de tomilho são filmes ativos que podem proporcionar aumento da vida útil de um produto bem como garantir segurança ao consumidor, devido às propriedades antimicrobianas do óleo de tomilho. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial de tomilho em filmes biodegradáveis de isolado proteico de soro de leite adicionado com nanofibras de celulose. Os filmes com concentração igual e superior a 4,5% de óleo de tomilho apresentaram atividade antimicrobiana para as bactérias Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus, já o filme com menor concentração não foi efetivo. Palavras-chave: MIC, inibição microbiana, nanocompósitos. INTRODUÇÃO Novas tecnologias de embalagens para alimentos estão se desenvolvendo como uma resposta às exigências dos consumidores, que buscam por conveniência e qualidade. Além disso, essas tecnologias, aliadas à produção industrial, permitem preservação de frescor, sabor, aroma e também produtos com vida útil prolongada sem alterar a qualidade. (DAINELLI et al., 2008). A segurança alimentar é uma prioridade global e um dos principais objetivos da legislação vigente de alimentos. No entanto, os riscos microbiológicos dos produtos alimentares ainda hoje são uma das principais fontes de doenças transmitidas por alimentos. (REALINI; MARCOS, 2014). Embalagens ativas mudam as condições dos alimentos embalados para estender a vida útil ou melhorar propriedades de segurança alimentar ou sensoriais, mantendo a qualidade do alimento embalado sendo uma alternativa para solucionar problemas de contaminação e, ao mesmo tempo, atender as necessidades do consumidor. (KRUIJF et al., 2002). Filmes formulados a base de isolado proteico de soro de leite são caracterizados pela flexibilidade, transparência, ausência de odor e sabor, o que contribui para sua aceitabilidade (AZEVEDO et al., 2014). Além disso, a adição de elementos antimicrobianos a estes filmes, como óleos essenciais, é uma alternativa para utilização em alimentos embalados com a finalidade de garantir maior segurança do produto, aumentar sua vida útil e assim, sua qualidade (KRUIJF et al., 2002) Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades antimicrobianas, in vitro de óleo essencial de tomilho em filmes biodegradáveis de isolado proteico de soro de leite e nanofibras de celulose.

2 MATERIAL E MÉTODOS Material Isolado protéico de soro de leite (IPS 9400), foi obtido pela Hilmar Ingredients (Hilmar, CA, USA). Glicerol pela Sigma Aldrich (Brasil), nanofibras de celulose de eucalipto foram adquiridas no Departamento de Ciência e Tecnologia da Madeira na Universidade Federal de Lavras e óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris) foi adquirido da empresa Ferquima Indústria e Comercio Ltda, (Vargem Grande Paulista, Brasil). Microrganismos: Listeria monocytogenes ATCC 19117, Pseudomonas fluorescens ATCC e Staphylococcus aureus ATCC 25923, cedidas pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Brasil. Métodos Isolado protéico de soro de leite (IPS) e glicerol foram fixados em 6% pv e 30% pv, respectivamente. O filme IPS (controle) foi preparado dissolvendo-se 6 g (m/v) de IPS com 1.8 g de glicerol (baseado no peso de IPS) em 44 ml e 56 ml de água destilada respectivamente, sendo ambos separadamente submetidos à agitação contínua em agitador magnético durante 30 min, em temperatura ambiente. Os filmes com óleo essencial de tomilho (OT) e nanofibras de celulose (NC) foram desenvolvidos conforme filme controle, sendo a nanofibra (1 g/ 100 g de IPS) e o óleo (3.0; 4.5 e 6.0 g/100g de IPS) dispersos com glicerol. Posteriormente as soluções foram vertidas uma na outra e submetidas a agitação em um homogeneizador Ultra- Turrax (T 25, Ika-Werke, Alemanha) por 5 min, 7000 rpm, em temperatura ambiente para homogeneização do óleo e ph ajustado para 8 com NaOH 2N e a solução final submetida a homogeneizador ultrassônico (Sonifier Cell Disruptor Branson - Model 450D, Manchester, UK) por 10 min. com potência de 80W/25 C. As soluções foram aquecidas a 90 C/30 min. em banho-maria, resfriada à temperatura ambiente e vertidas em placas de vidro. O controle de espessura foi efetuado por volume aplicado no suporte (20 x 30 cm), correspondendo a 110 ml. Os filmes foram secos em temperatura ambiente durante 48h garantindo evaporação lenta do solvente e formação do filme. Todos os filmes foram acondicionados em temperatura controlada, 23 ± 2 C e umidade relativa 50 ± 5% UR por 48 h antes das análises. Delineamento Experimental O experimento foi conduzido em um planejamento fatorial completo. Os filmes foram codificados conforme Tabela 1. Tabela 1 Filmes desenvolvidos de IPS/OT Filmes Nanofibra (g 100g-1 IPS) OT (g 100g-1 IPS) IPS 0 0 IPSOT0 1 0 IPSOT IPSOT IPSOT Concentração mínima inibitória (CMI) do óleo de tomilho Foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo BHI para P.fluorescens e S.aureus, e TSB suplementado com 0,6% de extrato de levedura para L.monocytogenes na

3 determinação da CMI do óleo essencial de tomilho. Foram utilizadas microplacas de poliestireno com 96 cavidades e fundo chato, nas seguintes concentrações: 0.00; 0.01; 0.03; 0.06; 0.12; 0.25; 0.50 e 1.00 (v/v), obtidas pela homogeneização do óleo essencial com o meio de cultura contendo 0,5% (v/v) de Tween 80. O meio de cultura contendo inóculo bacteriano (108 UFC.mL-1) adicionado às cavidades foi 10 μl, sendo o volume final de líquido nas cavidades, 150μL. Para todas as concentrações, foi utilizado o controle a partir de cavidades sem o inóculo bacteriano. As microplacas inoculadas com L.monocytogenes e S.aureus foram incubadas a 37ºC por 24 horas e as inoculadas com P.fluorescens foram incubadas a 25ºC por 24 horas. A absorbância das amostras foi lida a 620 nm em leitor de microplacas 6, antes do início de incubação (tempo zero) e após 24 horas. As menores concentrações que resultarão em completa inibição do crescimento bacteriano serão denominadas CMI. Foram realizadas triplicata com três repetições no tempo. Atividade antimicrobiana (in vitro) dos filmes A CMI dos filmes foi determinada empregando-se a metodologia de Difusão em Disco. Após homogeneização de 108 UFC/mL de P.fluorescens e S.aureus em ágar BHI, e de L.monocytogenes em TSA (TrypticSoy Agar, Himedia ) suplementado com Extrato de levedura, foi vertido em placas de Petri. Após a solidificação do meio, os filmes com 6 mm de diâmetro, desenvolvidos nas concentrações 0; 1.5; 3.0; 4.5 e 6.0 (g 100g -1 IPS) de OT, foram colocados nas placas. O filme IPS foi utilizado como controle negativo e para controle positivo foi utilizado solução de cloranfenicol (1000 mg/l). O procedimento foi realizado em três repetições no tempo, em triplicata, e as placas foram incubadas a 37 C/24h. Os halos de inibição formados foram mensurados com paquímetro digital DIGIMESS. Tabela 2 Concentração mínima inibitória de óleo essencial de tomilho para L. Monocytogenes, P. fluorescens e S. aureus L. monocytogenes Tempo (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 0h h P. fluorescens 0h h S. aureus 0h h A menor concentração de óleo essencial de tomilho para L. monocytogenes foi de 1.56%, enquanto a CMI tanto para P. fluorescens e S. aureus foi de 3.12% (Tabela 2). Óleos essenciais e os seus componentes são conhecidos por serem ativos contra uma ampla variedade de microrganismos (DEANS e RITCHIE, 1987; SIVROPOULOU et al., 1996). O óleo essencial de tomilho apresenta como principais componentes antimicrobianos o cravacol e o timol, que são compostos fenólicos (ROTA, 2008; SKOCIBUSIC, 2006). Segundo Sikkema et al., (1995) as propriedades antimicrobianas destes compostos está associada com o seu carácter lipofílico, levando a acumulação em membranas celulares e subsequente esgotamento de energia. Os resultados apresentados nesse estudo foram obtidos após 24h da adição do inóculo, sendo confirmadas pela absorbância que teve uma diminuição devido a propriedade antimicrobiano do óleo essencial que, provavelmente, ocasionou à lise celular.

4 Foi observada a formação de zonas de inibição do antimicrobiano e inibição por contato no filme controle e nos filmes incorporados com OT, testados in vitro. (Tabela 2). Tabela 3 Concentração mínima inibitória de filmes de IPS/NC/OT para L. monocytogenes, P. fluorescens e S. aureus Microrganismo Filme 6% 4.5% 3.0% 0% controle OE OE OE OE (IPS) L. monocytogenes IC IC P. fluorescens IC S. aureus IH IH houve crescimento microbiano; IC: Inibição por contato; IH: inibição com formação de halo. O filme controle (IPS) e o filme IPSOT0 não apresentaram ação contra os microrganismos, o que já era esperado, visto que estes não apresentam OT, e, portanto, não apresentam atividade antimicrobiana. O filme IPSOT3 que apresenta menor concentração de óleo essencial de tomilho não foi suficiente para inibir o crescimento de nenhum dos microrganismos analisados, mostrando, que esta concentração de OT não foi suficiente para garantir inibição das bactérias avaliadas. O filme IPSOT4.5 apresentou inibição por contato para placas contendo L. monocytogenes e o filme IPSOT6 para as placas onde continham as P. fluorescens, sendo o único filme efetivo contra este microrganismo. Já para placas contendo S. aureus foi observada a formação de halo em filme IPSOT4.5, bem como para o filme IPSOT6. Assim, percebeu-se que o mínimo de óleo essencial de tomilho que deve ser adicionado na formulação de filmes comestíveis de soro de leite para permitir inibição deve ser de 4,5%. Os resultados condisseram com estudos sobre as espécies de T.vulgaris onde se verificou que seus óleos essenciais possuem propriedades antimicrobianas podendo ser utilizados na indústria de alimentos, devido a capacidade de varias espécies de bactérias. Alguns estudos demonstraram também que óleos essenciais de orégano e alecrim são os mais efetivos antimicrobianos, como o óleo de tomilho (DIMITRIJEVIĆ et al., 2007). As nanofibras de celulose apresentam significativo potencial de utilização como reforço na fabricação de nanocompósitos (BLEDZKI, 1996). O presente estudo mostrou que a presença de NC não afetou a atividade antimicrobiana dos filmes, visto que todos foram efetivos. Sendo assim, é uma boa alternativa para melhorar o desempenho mecânico dos mesmos sem afetar sua atividade antimicrobiana. CONCLUSÃO O óleo essencial de tomilho apresentou atividade antimicrobiana in vitro e quando adicionado em filmes biodegradáveis de isolado proteico de soro de leite. A presença de nanofibra de celulose não afetou na atividade antimicrobiana dos filmes. Os resultados apresentados neste trabalho indicam sua eficiência para inibição dos microrganismos em estudo. Assim, uma alternativa promissora para o desenvolvimento de filmes ativos seria a utilização do óleo essencial de tomilho como carreador de substâncias ativas visando aplicações na forma de embalagens antimicrobiana para alimentos, além da adição de naofibras de celulose para melhorar suas propriedades mecânicas formando filmes mais resistentes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

5 AZEVEDO, V. M. et al. Whey protein isolate biodegradable films: Influence of the citric acid and montmorillonite clay nanoparticles on the physical properties. Food Hydrocolloids. V. 43, p , BLEDZKI, A.; REIHMANE, S.; GASSAN, J. Properties and modification methods for vegetable fibers for natural fiber composites, Journal of Applied Polymer Science, v. 59, n. 8, p , DAINELLI, D. et al. Active and intelligent food packaging: legal aspects and safety concerns. Trends in Food Science & Technology, v. 19, p. S103-S112, DEANS, S. G.; RITCHIE G. Antibacterial properties of plant essential oils. International Journal of Food Microbiology. v. 5, p , DIMITRIJEVIĆ, S. I., et al. A study of the synergistic antilisterial effects of a sub-lethal dose of lactic acid and essential oils from Thymus vulgaris L., Rosmarinusofficinalis L. and Origanumvulgare L. Food Chem, v. 104, p , REALINI, C.E., MARCOS, B. Active and intelligent packaging systems for a modern society. Meat Science, v. 98, p , KRUIJF, N. et al. Active and intelligent packaging: applications and regulatory aspects. Food Additives and Contaminants, v. 19, p , ROTA, M. C., et al. Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils. Food Control, v. 19, p , SIVROPOULOU, A. et al. Antimicrobial and cytotoxic activities of origanum essential oils. J. Agric. Food Chem. v. 44, p , SIKKEMA, J.; DE BONT, J. A. M.; POOLMAN, B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol Mol. Biol. Rev., v. 59, p , SKOCIBUSIC, M.; BEZIC, N.; DUNKIC, V. Phytochemical composition and antimicrobial activities of the essential oils from Vis. growing in Croatia. Food Chem, v. 96, p , AGRADECIMENTOS Agradeço ao CNPq, órgão fomentador da pesquisa, à professora Soraia pela orientação e a todos que estiveram envolvidos, de alguma forma, para a realização deste experimento. Autor a ser contatado: Camila Ferreira Gonçalves Pereira. Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciência dos Alimentos. Campus Universitário Lavras, MG Brasil Telefone: (37) camila.gato.goncalves@hotmail.com