EFEITO ANTIBACTERIANO DE COBERTURAS COMESTÍVEIS DE QUITOSANA INCORPORADAS COM ÓLEO ESSENCIAL DE Myrcia ovata Cambessedes

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1 EFEITO ANTIBACTERIANO DE COBERTURAS COMESTÍVEIS DE QUITOSANA INCORPORADAS COM ÓLEO ESSENCIAL DE Myrcia ovata Cambessedes G.G.S. Frazão 1, A.F. Blank 2, L.C.L.A. Santana 1* 1-Departamento de Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Sergipe CEP: São Cristóvão SE Brasil, Telefone: (79) Fax: (79) * 2-Departamento de Agronomia Universidade Federal de Sergipe CEP: São Cristóvão SE Brasil. RESUMO O presente estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar in vitro a eficiência microbiológica de coberturas comestíveis à base de quitosana incorporadas com 2 óleos essenciais de Myrcia ovata Cambessedes, (MYRO-174 e MYRO-175). A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e das coberturas comestíveis foi avaliada pela técnica de difusão as bactérias frente à bactérias patogênicas de alimentos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Salmonella enteritidis). A maioria das bactérias foram de sensíveis a extremamente sensíveis aos óleos essenciais com halos de inibição variando entre 10,5 e 32,0 mm). As bactérias gram-positivas foram sensíveis as formulações de coberturas comestíveis contendo MYRO-174 ou MYRO-175. Entretanto, dentre as gram-negativas, apenas a P. aeruginosa foi sensível a formulação contendo 2,5% do óleo MYRO As coberturas comestíveis incorporadas com ambos óleos essenciais demonstraram ser uma alternativa para aplicações futuras em sistemas de alimentos. ABSTRACT This study aimed to develop and evaluate in vitro microbiological efficiency of chitosan edible coatings incorporated with 2 essential oils Myrcia ovata Cambessedes (MYRO-174 and MYRO-175). The antimicrobial activity of essential oils and edible coatings was evaluated by disc-diffusion technique against foodborne bacteria (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus faecalis and Salmonella enteritidis). The bacteria were sensitive to extremely sensitive to essential oils with diameter of inhibition zone ranging between 10.5 and 32.0 mm). Gram-positive bacteria were sensitive to edible coatings containing MYRO-174 or MYRO-175. However, among the gramnegative bacteria, only P. aeruginosa was sensitive to the formulation containing 2.5% of MYRO-174 oil. The edible coatings incorporated to both essential oils proved to be an alternative for future applications in food systems. PALAVRAS-CHAVE: controle de qualidade; cobertura comestível; antimicrobiano. KEYWORDS: quality control; edible coating; antimicrobial. INTRODUÇÃO Revestimentos ou coberturas comestíveis são definidos como uma camada fina de material comestível formada sobre um alimento, geralmente são aplicados na forma líquida sobre o produto, por imersão do mesmo em solução de uma substância geradora formada pela matriz estrutural

2 (carboidratos, proteínas, lipídios ou mistura de componentes múltiplos) já os filmes comestíveis são películas finas formadas separadamente do alimento e posteriormente aplicadas sobre o alimento (Falguera et al., 2011). Os revestimentos comestíveis regulam as trocas gasosas do produto com o meio exterior, a perda de vapor de água que resulta em perda de massa e controlam a perda de voláteis responsáveis pelo flavor do fruto.pesquisas com revestimentos à base de biopolímeros como polissacarídeos, proteínas e materiais lipídicos têm aumentado, devido à habilidade em estender a vida útil do alimento. Além do aumento da vida útil, os revestimentos também podem atuar como agentes de transporte de substâncias ativas, como antimicrobianos, para a superfície do alimento (Falguera et al., 2011; Bonilla et al., 2012). Dentre os materiais utilizados em coberturas biodegradáveis, a quitosana tem se destacado por ser facilmente obtida, possuir potencial antimicrobiano, impermeabilidade ao oxigênio, biodegrabilidade e carácter não tóxico. A quitosana é um polímero natural, derivado do processo de desacetilação da quitina, que é tido como o segundo polissacarídeo mais abundante da natureza, atrás apenas da celulose. Nas últimas décadas têm sido relatados estudos que mostram o interesse atribuindo a quitosana a partir de suas potencialidades e vantagens como agente antimicrobiano (Aider, 2010). Ao longo dos anos, os pesquisadores têm elaborado coberturas comestíveis incorporadas com vários tipos de agentes antimicrobianos, incluindo compostos orgânicos (ácidos acético, benzóico, láctico, propiónico, sórbico), ésteres de ácidos graxos (monolaurato de glicerilo), polipeptídeos (lisozima, peroxidase, lactoferrina, nisina) e óleos essenciais (Mantilla et al., 2013). Particularmente, a adição deóleos essenciais na composição de filmes e coberturas comestíveis é mais relevante do que o uso do óleo diretamente nos alimentos, visto que concentrações elevadas podem induzir alterações nas características organolépticas do produto (Fernandez-Pan et al., 2014). Tanto os óleos essenciais como compostos com atividade antioxidante e antimicrobiana podem melhorar as propriedades funcionais dos filmes e aumentar seu potencial de preservação dos alimentos (Bonilla et al., 2012). Componentes de óleos essenciais tais como: carvacrol, timol, eugenol, terpineno e carvona têm sido identificados como agentes antimicrobianos contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Burt, 2004). Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo desenvolver coberturas comestíveis à base de quitosana incorporadas com óleo essencial de Myrcia ovata Cambessedes e avaliar o potencial antimicrobiano das mesmas in vitro frente a bactérias patogênicas de alimentos. MATERIAL E MÉTODOS Materiais A quitosana foi adquirida da empresa Polymar (Fortaleza, Ceará). A fécula de mandioca da marca dinha bá foi adquirida em supermercado local. Dois óleos essenciais da planta Myrcia ovata Cambessedes (oriunda da região de Japaratuba, Sergipe), denominados MYRO-174 e MYRO-175, foram adquiridos do Laboratório de Fitotecnia do Departamento de Agronomia da Universidade Federal de Sergipe. A extração dos óleos das folhas foi realizada por hidrodestilação por meio de aparelho do tipo Clevenger. Os óleos essenciais foram analisados por Sampaio et al. (2016) e continham os seguintes compostos majoritários: MYRO-174 contendo 27,50% de isopulegol, 19,61% de linalol e 10,29% de iso-isopulegol e MYRO-175 contendo 14,97% linalol e 52,61% ácido nelórico. Micro-organismos Os micro-organismos Pseudomonas aeruginosa (INCQS 00025), Staphylococcus aureus (INCQS 00014), Bacillus cereus (INCQS 00003), Bacillus subtilis (INCQS 00002), Serratia

3 marcescens (INCQS 00131), Escherichia coli (INCQS 00032), Enterococcus faecalis (ATCC 51299) e Salmonella enteritidis (INCQS 00258) foram doados pela Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz, Manguinhos, Rio de Janeiro). As estirpes foram armazenadas em caldo de infusão de cérebro coração (BHI) e solução de glicerol a 20% a -80ºC em um Ultrafreezer. Elaboração das coberturas comestíveis incorporadas com óleo essencial As formulações de coberturas de quitosana foram elaboradas conforme metodologia descrita na patente depositada no Instituto Nacional da propriedade Industrial (BR ) com algumas modificações. Para cada formulação preparou-se separadamente uma solução 1,0% de quitosana em solução ade ácido acético a 1,5% (p/v) (100mL) e uma solução 0,5% de fécula de mandioca em solução aquosa de glicerol à 0,64% (p/v) (100 ml). A solução de fécula foi aquecida em banho-maria sob agitação, não ultrapassando 70 C. Após o resfriamento foi adicionada a solução de quitosana, agitando-se até completa homogeneização das mesmas. Por fim adicionou-se o óleo essencial. Todas as formulações de coberturas foram preparadas de acordo com este procedimento variando-se as porcentagens de quitosana, fécula de mandioca e óleo essencial. Potencial antimicrobiano das coberturas comestíveis e dos óleos essenciais O potencial antimicrobiano das coberturas comestíveis e dos óleos essenciais (MYRO-174 e MYRO-175) frente às bactérias patogênicas foi avaliado pela técnica de difusão em disco segundo protocolo descrito pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012). As suspensões de cada bactéria foram preparadas em caldo Muller-Hinton na escala 0,5 de McFarland. Em seguida cada micro-organismo foi semeado em placas separadas contendo ágar Muller-Hinton utilizando swabs estéreis, Em seguida, discos estéreis de 6 mm de diâmetro contendo 15µL de cobertura comestível ou óleo essencial foram colocados nas placas de petri com o auxílio de pinça. Discos de gentamicina (30 µg/disco) e cloranfenicol (30 µg/disco) foram utilizados como controle positivo. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 h, após esse período os halos foram medidos. Os experimentos foram realizados em triplicata. A sensibilidade das bactérias às coberturas comestíveis foi classificada pelo diâmetro dos halos de inibição como segue: não sensível, para diâmetros inferiores a 8 mm; sensível para diâmetros de 9-14 mm; muito sensível para diâmetros de mm; e extremamente sensível para diâmetros maiores de 20 mm (Djenane et al., 2011). RESULTADOS E DISCUSSÃO Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais Os diâmetros dos halos de inibição das bactérias patogênicas obtidos para os óleos essenciais de MYRO-174 e MYRO-175 estão apresentados na Tabela 1. O S. aureus foi sensível ao MYRO-175 e muito sensível ao MYRO-174. As bactérias B. cereus e B. subtilis foram muito sensíveis a ambos óleos. O E. faecalis e P. aeruginosa foram extremamente sensíveis ao MYRO-175 e MYRO-174, respectivamente. Já a S. enteritidis foi sensível apenas ao MYRO-174. Apesar dos óleos essenciais terem sido obtidos de plantas de M. ovata coletados na mesma região, estes possuem diferentes compostos majoritários em sua composição, o que provavelmente explica a variação de potencial antimicrobiano. Segundo Sampaio et al. (2016), a os fatores genéticos das plantas são os principais responsáveis pela diversidade na composição química dos óleos essenciais MYRO-174 e MYRO-175.

4 Tabela 1: Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais MYRO-174 e MYRO-175 frente às bactérias patogênicas Diâmetros de halos de inibição (mm) (média ± desvio padrão) Bactérias MYRO-174 MYRO-175 S. aureus 14,0±2,5 12,5±0,7 B. cereus 15,5±0,7 15,0±1,4 B. subtilis 20,0±1,4 18,5±2,0 E. faecalis 10,5±0,7 22,0±1,4 P. aeruginosa 32,0±2,5 17,5±0,7 S. marcescens 6,0±0,0 11,0±1,4 E. coli 8,0±0,5 8,0±0,0 S. enteritidis 13,0±3,0 6,0±0,0 Potencial antimicrobiano das coberturas comestíveis A atividade antimicrobiana das coberturas comestíveis contendo os óleos, MYRO-174 e MYRO-175 foi analisada frente a bactérias patogênicas, utilizando o método de difusão em disco e os resultados estão apresentados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Os diâmetros dos halos de inibição variaram entre 7,0 e 12,5 mm. As bactérias gram-positivas B. cereus, B. subtilis, S. aureus foram sensíveis a todas as coberturas contendo os óleos MYRO-174 ou MYRO-175. O E. faecalis demonstrou sensibilidade apenas às coberturas comestíveis contendo 2,5% do óleo essencial MYRO Dentre as bactérias gram-negativas a P. aeruginosa foi a única bactéria que mostrou sensibilidade a todas as formulações. Este resultado foi bastante positivo para controle desta bactéria, visto que segundo a literatura a P. aeruginosa tem sido resistente a agentes antimicrobianos (Burt, 2004). As demais bactérias gram-negativas E. coli, S. enteritidis e S. marcescens não foram sensíveis a nenhuma das coberturas comestíveis. Azevedo et al. (2014) também avaliaram o potencial antimicrobiano de coberturas comestíveis de quitosana incorporadas com óleo essencial de Lippia gracillis Schauer e observaram que o B. cereus e B. subtilis foram sensíveis apenas as formulações que continham de 0,6 a 1,5% de quitosana e de 2,4 a 3,0% de óleo essencial, o S. aureus foi sensível apenas às coberturas comestíveis com 2,4% de óleo essencial de L. gracillis e a bactéria E. faecalis não apresentou sensibilidade a nenhuma das formulações de coberturas comestíveis. No presente trabalho estas bactérias foram inibidas com coberturas contendo menor concentração de óleo essencial Myrcia ovata (1,25%). Além disto, Azevedo et al. (2014) verificaram que E. coli, S. enteritidis e P. aeruginosa não demostraram sensibilidade a nenhuma das formulações. Já as coberturas contendo os óleos MYRO-174 ou MYRO- 175 inibiram a P. aeruginosa. As diferenças de atividade antimicrobiana observadas entre estas coberturas comestíveis se deve provavelmente a variações na composição dos óleos essenciais, bem como a interação dos compostos com a quitosana e fécula de mandioca.

5 Tabela 2: Diâmetros de halos de inibição (mm) obtidos com as coberturas comestíveis com o óleo Myrcia ovata (MYRO-174) frente às bactérias patogênicas de alimentos Diâmetros de halos de inibição (mm) (média ± desvio padrão) Exp 1 Exp 2 B. cereus 9,5 ±0,0 10,0 ±0,4 B. subtilis 9,5 ±0,3 11,2 ±0,2 S. aureus 9,5 ±0,2 10,0 ±0,0 E. faecalis 7,0 ±0,0 9,0 ±0,0 P. aeruginosa 9,0 ±0,4 9,7 ±0,5 E. coli 7,3 ±0,0 7,6±0,0 S. marcensces 7,0 ±0,0 8,0 ±0,0 S. enteritidis 8,0 ±0,0 7,0 ±0,0 Exp 1 :0,5% de fécula de mandioca, 1,0% de quitosana, 1,25% de óleo essencial; Exp 2: 0,5% de fécula de mandioca, 1,0% de quitosana, 2,5% de óleo essencial. Tabela 3: Diâmetros de halos de inibição (mm) obtidos com as coberturas comestíveis com o óleo Myrcia ovata (MYRO-175) frente às bactérias patogênicas de alimentos Diâmetros de halos de inibição (mm) (média ± desvio padrão) Exp 1 Exp 2 B. cereus 10,0 ±0,0 10,3 ±0,6 B. subtilis 11,5 ±0 12,5 ±0,7 S. aureus 10,3 ±0,0 10,3 ±0,0 E. faecalis 8,0 ±0,0 8,5 ±0,0 P. aeruginosa 10,0 ±0,0 9,5 ±0,0 E. coli 7,0 ±0,0 8,0 ±0,0 S. marcensces 8,5 ±0,0 8,0 ±0,0 S. enteritidis 7,0 ±0,0 8,0 ±0,0 Exp 1 : 0,5% de fécula de mandioca, 1,0% de quitosana, 1,25% de óleo essencial; Exp 2:0,5% de fécula de mandioca, 1,0% de quitosana, 2,5% de óleo essencial. CONCLUSÕES Os óleos essenciais Myrcia ovata Cambessedes (MYRO-174 e MYRO-175) demonstraram excelente potencial como agente antimicrobiano frente às bactérias estudadas neste trabalho. Coberturas comestíveis de quitosana incorporadas com este óleos essenciais foram elaboradas e estas demonstraram eficiência para inibição das bactérias patogênicas podendo ser aplicada em estudos futuros em sistemas de alimentos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aider, M. (2010). Chitosan application for active bio-based films production and potential in the food industry: Review. LWT-Food Science and Technology, 43, Azevedo, A. N., Buarque, P. R., Cruz, E. M. O., Blank, A. F., Alves, P. B., Nunes, M. L., & Santana, L.C.L.A. (2014). Response surface methodology for optimisation of edible chitosan coating formulations incorporating essential oil against several foodborne pathogenic bacteria. Food Control, 43,1 9.

6 Bonilla J., Atares, L., Vargas, M., & Chiral, A. (2012) Edible films and coatings to prevent the detrimental effect of oxygen on food quality: Possibilities and limitations. Journal of Food Engineering, 110, Burt, S. (2004) Essential oils their antibacterial properties and potential applications in foods a review. International Journal of Food Microbiology, 94, Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard: Eleventh edition, M Wayne, PA. Djenane, D., Yangüela, J., Montañés, L., Djerbal, M., & Roncalés, P. (2011). Antimicrobial activity of Pistacia lentiscus and Satureja montana essential oils against Listeria monocytogenes CECT 935 using laboratory media: efficacy and synergistic potential in minced beef. Food Control, 22, Falguera, V., Quintero, J.P., Jimenez, A., Munoz, J.A., & Ibarz, A. (2011) Edible films and coatings: Structures,active functions and trends in their use. Trends in Food Science & Technology, 22, Fernández-Pan, I., Carrión-Granda, X., & Maté, J. I. (2014). Antimicrobial efficiency of edible coatings on the preservation of chicken breast fillets. Food Control, 36, INPI, submissão de Patente, N0. BR , 09 de Dezembro de Mantilla, N., Castell-Perez, M.E., Gomes, C., & Moreira,R.G. (2013). Multilayered antimicrobial edible coating and its effect on quality and shelf-life of fresh-cut pineapple (Ananas comosus). LWT - Food Science and Technology, 51, Sampaio, T.S., Nizio, D.A.C., White, L.A.S., Melo, J.O., Almeida, C.S., Alves, M.F., Gagliardi, P.R., Arrigoni-Blank, M.F., Junior, A.W., Sobral, M.E.G & Blank, A.F. (2016). Chemical diversity of a wild population of Myrcia ovata Cambessedes and antifungal activity against Fusarium solani. Industrial Crops and Products, 86,